Microfabricated Post-Array-Detectoren (mPADs): een benadering van mechanische krachten Isoleer
1 oktober 2007
In deze video laten we zien hoe om te fabriceren en gebruiken microfabricated na reeks detectoren (mPADs) om modulaties van cellulaire contractiliteit te beoordelen.
Hallo, ik ben Nathan Snia Decky en met mij vandaag zijn Wes Ligan en Robbie Desai en Mike Yang. En we komen van Chris Chen's lab hier aan de Universiteit van Pennsylvania. In deze video zullen we onze aanpak presenteren om cellulaire aantrekkingskracht te meten met behulp van een microfabricaat array van palen.
Traktiekrachten worden gegenereerd door myosine en acton interacties en spelen een belangrijke rol in onze fysiologie. Tijdens de ontwikkeling maken ze het mogelijk voor cellen om van de ene locatie naar de andere te bewegen om de vroege structuren van ons weefsel te vormen. En ze helpen ook bij het genezingsproces omdat ze noodzakelijk zijn voor het sluiten van wonden of de migratie en het kruipen van leukocyten door ons lichaam.
Maar helaas kunnen dezezelfde krachten schadelijk zijn voor onze gezondheid in het geval van kankermetastase of vasculair groei richting een tumor. Er zijn dus maar weinig methoden waarmee men deze traktiekrachten op een kwantitatieve manier kan meten, en vooral op micro- en nanoschaal van individuele cellen. De meeste gebruikelijke methoden om cellen in vitro te bestuderen zijn met glazen bodem schalen of polystyreen schalen, maar deze zijn erg stijf substraat en ze laten ons niet toe om de traktiekrachten en de deformaties die een cel veroorzaakt daadwerkelijk fysiek te meten.
En dus is het erg moeilijk geweest om de onderliggende mechanismen van traktiekrachten te begrijpen zonder een soort van fysiek afleesmechanisme. En dus hebben we in Chris Chen's lab een techniek die ons toelaat om deze beperkingen te overwinnen. Onze methode is gebaseerd op een verticaal array van flexibele cantilevers, waarvan de stijfheid en de grootteschaal zodanig zijn dat individuele cellen zich over meerdere cantilevers verspreiden en ze daarbij vervormen.
De afmetingen die we het meest vaak gebruiken zijn cilindrische palen met een diameter van drie micron, 10 micron hoog met een centrum-tot-centrum afstand van negen micron en een rechthoekige array. Deze afmetingen kunnen echter worden gevarieerd om een verscheidenheid aan cellulaire studies te accommoderen. We beginnen met een stijve siliconen master die je hier kunt zien en vertalen deze dan naar flexibele PDMS cantilevers die we hier zien.
Met behulp van deze techniek kunnen we de vervormingen van individuele cantilevers onder een microscoop meten en de cellulaire traktiekrachten met de grootte en richting die vereist zijn om dergelijke vervormingen te genereren, terugberekenen. We hebben deze substraten M-pads voor micro-paal-array-detectors genoemd en in deze video zullen we je laten zien hoe je de M-pads kunt fabriceren, beginnend bij de siliconen master door de PDMS-replicatie, en tot slot de berekening van modulatie en cellulaire contractiliteit. Hallo, hier zijn we in onze schone ruimte in het lab.
Dit is een stofvrije en lichtgevoelige ruimte die ons toelaat om de SU acht palen te maken die als de siliconen master zullen dienen. We zullen beginnen met een siliconen wafer en hiermee zullen we deze coaten met SU acht foto resist SU acht is een negatief resist en het is lichtgevoelig. Dus wanneer we licht door deze fotomasker laten schijnen, zal het licht een patroon op de micro palen veroorzaken en vervolgens een driedimensionale structuur vormen, die dan de SU acht palen zullen zijn die we vervolgens in PDMS gieten.
Dus nadat we al onze verwerking hebben gedaan, zal de wafer er zo uitzien, waar we de micro pilaar, de micro paalstructuren al in de wafer hebben gefabriceerd. Dus om de masters te maken, beginnen we eerst met een kale siliconen wafer en deze is schoongemaakt met een ozonbehandeling gedurende zeven minuten en we hebben deze wafer ook 30 minuten op 120 graden Celsius gedehydrateerd. We gaan SU acht 2002 op deze spuiten om een zeer dunne basislaag voor de palen te vormen.
Omdat we SU acht gaan spuiten, ga ik een gasmasker dragen, ik zal de wafer in deze houder herladen, ik zal eventueel stof dat erop zou kunnen zitten eraf halen, ik zal het op de spinner plaatsen, we zullen controleren of het gecentreerd is en dan gaan we door met het spuiten van de SU acht 2002 op deze. En dan gaan we verder met het draaien van de wafer. We plaatsen deze vervolgens op de hot plate, de soft bake.
We doen dit één minuut. Daarna brengen we het over naar de hot plate van 95 graden. En we doen dit gedurende twee minuten.
En wanneer het klaar is, nemen we dit nu mee om de flood exposure in de mask aligner te doen. Oké, we hebben zojuist de eerste laag van SU acht op deze wafer gedraaid, en nu moeten we de hele wafer exposeren om die eerste basislaag voor de micro palen te creëren. Dus we moeten deze 70 millijoules aan blootstelling geven.
Dus we moeten de werkelijke intensiteit van het licht in onze mask aligner hier meten. Dus we laden de meter in de gewicht in de mask aligner. We belichten het vervolgens met licht.
Dit is UV licht hier. We laden de siliconen wafer op de mask aligner, plaatsen het in de mask aligner. En we hebben dit keer geen masker, zodat we de hele film kunnen belichten.
Laten we de sluiter erop doen en laten we een minuut blootstelling instellen en we gaan door met belichten. Dus na een minuut is het systeem klaar, we kunnen de wafer eruit halen. En nu moeten we de post-exposure bake doen.
Dus we hebben deze wafer zojuist blootgesteld en we gaan nu warmte toevoegen om de cross-link reactie voor deze eerste coating van SU acht te veroorzaken. Dus we plaatsen het op een hot plate van 65 graden gedurende een minuut en vervolgens brengen we het over naar een hot plate van 95 graden voor twee minuten. Na de tweede minuut processen, zetten we de hot plate uit en laten de wafer terug afkoelen tot kamertemperatuur, wat ongeveer 30 minuten duurt.
Dus we hebben onze tweede laag SU acht op deze wafer gedraaid. En nu moeten we dit eigenlijk door het fotomasker laten doorschijnen. Deze keer gaan we een UV filter gebruiken om diepe UV licht te blokkeren.
Dit is een Hoya optisch glas dat je kunt krijgen, maar deze keer moeten we opnieuw de intensiteit meten. Dus we gaan onze lichtmeter gebruiken of we gaan de filter op de top gebruiken om de gefilterde intensiteit te met
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video toont de fabricage en het gebruik van microfabricage post array detectoren (mPADs) om cellulaire contractiliteit te beoordelen. De benadering maakt het mogelijk om cellulaire aantrekkingskrachten te meten, die cruciaal zijn voor verschillende fysiologische processen.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Cellulaire biologie
- Biomechanica
- Microfabricagetechnieken
Achtergrond
- Tractiekrachten worden gegenereerd door interacties tussen myosine en actine.
- Deze krachten spelen een belangrijke rol bij celbeweging en weefselvorming tijdens ontwikkeling.
- Ze zijn ook essentieel voor wondgenezing en leukocytenmigratie.
- Het begrijpen van deze krachten kan inzicht geven in cellulair gedrag en fysiologie.
Doel van het onderzoek
- Om cellulaire aantrekkingskrachten te meten met behulp van mPADs.
- Om de rol van tractiekrachten in fysiologische processen te onderzoeken.
- Om het begrip van mechanismen van cellulaire contractiliteit te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Fabricage van microfabricage post array detectoren (mPADs).
- Meting van tractiekrachten gegenereerd door cellen.
- Analyse van cellulaire contractiliteitsmodulaties.
- Toepassing van bevindingen op fysiologische contexten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle fabricage van mPADs voor het meten van cellulaire krachten.
- Demonstratie van de relatie tussen tractiekrachten en cellulair gedrag.
- Inzichten in de mechanismen van cellulaire beweging en contractiliteit.
- Mogelijke toepassingen in het begrijpen van weefselontwikkeling en genezing.
Conclusies
- mPADs zijn effectieve tools voor het beoordelen van cellulaire contractiliteit.
- Het begrijpen van tractiekrachten kan fysiologische en ontwikkelingsbiologie informeren.
- Toekomstig onderzoek kan de toepassingen van deze technologie in verschillende biologische contexten uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Measuring cellular traction forces provides critical insight into mechanobiology pathways that influence target validation in oncology, fibrosis, and immunology. The mPAD platform enables quantitative, spatially resolved assessment of contractility, supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses involving cell migration, invasion, or tissue remodeling. By converting post deflection into force vectors, the method delivers predictive confidence in early discovery by linking molecular perturbations to functional biomechanical outputs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic targets through direct measurement of cellular contractility changes induced by genetic or pharmacological modulation.
- Operational Value: Supports target de-risking by correlating traction force modulation with pathway activity in disease-relevant cellular models.
- Predictive Value: Facilitates lead identification by quantifying compound effects on force generation, providing a functional readout beyond viability or proliferation assays.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible microenvironments where cells deflect elastomeric posts, enabling consistent traction force quantification across compound screens.
- Quantitative Output: Delivers displacement vectors convertible to force measurements, supporting dose-response analysis and hit selection in contractility-modulating compound libraries.
- Scalability: Compatible with live-cell imaging and fixed-endpoint workflows, allowing integration into automated microscopy platforms for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models pathophysiological processes such as cancer metastasis and vascular remodeling where aberrant traction forces drive pathology.
- Translational Continuity: Bridges in vitro contractility measurements to in vivo tissue-level behaviors, supporting extrapolation to preclinical efficacy and safety assessments.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on whether a compound normalizes pathological force signatures in relevant cell types.
Pipeline & Workflow Integration
The mPAD method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, particularly for programs focused on cytoskeletal regulators, adhesion molecules, or mechanotransduction nodes. It complements biochemical assays by adding a functional, biomechanical layer of validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how perturbations in myosin-actin dynamics or upstream signaling affect cellular force generation.
- Screening: Enables assay standardization through defined post geometry and PDMS material properties, ensuring reproducible deflection measurements across wells and plates.
- Analytics: Provides quantitative displacement and force vector outputs that allow comparison of contractility states across conditions, time points, or genetic backgrounds.
- Translational Research: Connects cellular contractility to tissue-level outcomes such as wound healing or tumor invasion, when supported by disease-model context.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform technology where post dimensions and surface chemistry can be adapted to different cell types or study goals without revalidating core fabrication principles.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, physical readouts of cellular contractility linked to molecular interventions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fabrication, surface functionalization, and imaging protocols that minimize variability in force measurements.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of compounds with unwanted effects on cell motility or tissue integrity, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by distinguishing compounds that modulate pathological versus physiological contractility in relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, PDMS handling, and fluorescence microscopy for reliable substrate generation and imaging.
- Depends on access to cleanroom facilities for SU-8 master fabrication and plasma treatment equipment for surface functionalization.
- Necessitates standardization of cell seeding density, incubation times, and fixation protocols to ensure comparable traction force measurements across experiments.
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to different cell types, as post size and spacing must be optimized for cellular spreading and force detection limits.
- Includes practical limitations such as the need for careful handling to prevent post collapse and the requirement for specialized image analysis tools to convert deflection data into force vectors.
