Transfecteren en Nucleofecting Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het algemene doel van dit experiment is om een hoge transfectie-efficiëntie in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen te bereiken met behulp van geoptimaliseerde transfectie- en nucleaire affectieprotocollen. Dit wordt bereikt door eerst feeder-vrije culturen van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen vast te stellen. Voor de transfectie worden de menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen overnacht op gelt, TRX of matrigel geplaatst.

Terwijl er voor nucleofectie kleine celklompen met trypsine worden verkregen, wordt een mengsel van plasmid DNA en gene juice transfectiereagens toegevoegd aan de geplaatste cellen, waarna de plaat wordt gecentrifugeerd en geïncubeerd bij 37 °C. De menselijke iPS-cel-suspensie wordt genucleofecteerd in een nucleofectie-apparaat, waarna de cellen worden geresuspendeerd in geconditioneerd medium en geïncubeerd bij 37 °C. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een efficiënte genetische manipulatie aantonen door middel van een hoge transfectie-efficiëntie in menselijke iPS-cellen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de eerder beschreven transfectie-elektroporatie en nucleaire affectiemethoden, is dat in ons laboratorium routinematig een hoge transfectie-efficiëntie in menselijke IPS-cellen met consistente resultaten kan worden behaald. Onze protocollen waarborgen daarnaast een minimale celdood na genetische modificatie. Hierdoor maken onze protocollen de snelle en grootschalige generatie van transgene menselijke IPS-cellijnen mogelijk. Bereid vóór het aanpassen van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen aan feeder-vrije culturen gelt TRX-gecoate schaaltjes voor.

Masseer vervolgens de menselijke IPC's, die eerder op feeder-cellen werden onderhouden, met 1 ml Accutane per well en incubeer gedurende één minuut bij 37 °C. Zodra de meeste cellen beginnen los te laten, worden er 10 tot 15 glaskralen aan de cellen toegevoegd en wordt de plaat voorzichtig geschud. Voeg daarna 2 ml knockout D-M-E-M-F 12 toe en titreer voorzichtig. Overbreng de celsuspensie naar een centrifugebuis van 10 ml.

Centrifugeer de cellen gedurende drie minuten bij 800 RPM op kamertemperatuur. Aspireer het supernatant, waarbij het menselijke IPSC-pellet intact blijft. Tik voorzichtig tegen de buis om het celpellet zachtjes te dispergeren.

Reese, resuspendeer de humane IPSC-pellet in een passend volume STEM pro-medium en verdeel dit over de putjes van een gel TRE-gecoate plaat. Afhankelijk van de proliferatiesnelheid kunnen humane IPC's worden gepasseerd met een splitratio van één op twee tot één op zes. Plaats de plaat voorzichtig in een incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius en schud de plaat voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van de cellen over de putjes te garanderen.

Voed de cellen dagelijks. Wanneer de cellen een confluentie van 80% bereiken, zijn ze klaar om opnieuw te worden overgeplaatst naar een nieuwe gel. Op de dag van transfectie moeten Rex-gecoate wells met een splitratio van één op twee cellen een confluentie van ongeveer 40 tot 50% hebben en in kleine kolonies gelijkmatig over de gel-gecoate well verdeeld zijn om een optimale transfectie-efficiëntie te bereiken.

Om deze procedure te starten, bereidt u 100 µL knockout-medium voor in een steriele 1,5 mL Eppendorf-buis. Voeg 27 µL gene juice transfectiereagens toe, meng dit goed en laat het vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens vier µg plasmid DNA toe.

De keuze van het plasmide is cruciaal voor een optimale transfectie-efficiëntie. Het hier gebruikte plasmide bevat een enhanced green fluorescent protein onder controle van een CAG-promotor, een sterke promotor die transcriptioneel actief is in humane IPC's. Incubeer de buis gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Voeg na 15 minuten het gen-sap, het DNA-mengsel, toe aan de cellen en laat de plaat wellen. Centrifugeer de plaat 5 minuten bij 1 200 RPM om het contact van het transfectiemengsel met de menselijke IPC's in de put te vergroten. Incubeer de cellen de volgende dag gedurende de nacht bij 37 °C.

Controleer de transfectie-efficiëntie op de dag van nucleaire affectie. Voorbehandel menselijke IPC's met 10 micromolar ROCK-inhibitor gedurende ten minste één uur bij 37 °C terwijl de menselijke iPSCs worden voorbehandeld. Bereid 82 µL menselijke stamcel-nucleaire effectorsolutie voor in een steriele 1,5 milliliter Eppendorf-buis. Voeg 80 µL toe.

Voeg supplement één toe en meng goed door te pipetteren. Incubeer de oplossing vijf minuten bij 37 °C. Warm vooraf bereid, geconditioneerd medium van feeder-cellen en 0,25% trypsine in EDTA voor tot 37 °C onder de zuivkap.

Label vooraf één steriele conische buis van 15 milliliter. Verwijder voorzichtig het medium uit de menselijke IPSC-cultuur die moet worden onderworpen aan nucleaire extractie en was de cellen voorzichtig met fosfaatgebufferde zoutoplossing. Aspireer de PBS en voeg trypsine toe; incubeer de cellen gedurende drie minuten bij 37 °C.

Voor een succesvolle nucle-affectie is het cruciaal om de cellen niet met trypsine te dissociëren tot enkelcellen. In plaats daarvan moeten de cellen getritureerd worden tot kleine klompjes bestaande uit twee tot drie cellen. Resuspendeer de cellen voorzichtig met een P 1000 pipetpunt tot kleine klompjes bestaande uit twee tot drie cellen.

Spoel de bodem van de well door herhaaldelijk te pipetteren om er zeker van te zijn dat alle menselijke IPC's volledig zijn losgekomen. Breng de celsuspensie vervolgens over naar de gelabelde kegelvormige buis van 15 milliliter. Voeg daarna negen milliliter medium voor muis embryonale fibroblasten toe.

Om het trypsine te inactiveren, centrifugeert u de cellen gedurende drie minuten bij 800 RPM. Aspireer voorzichtig het supernatant, waarbij het celpellet intact blijft. Suspendeer de cellen in 100 µL van een vooraf opgewarmde nucleaire effectorsolutie voor menselijke stamcellen.

Breng met een pipetpunt van één milliliter cellen over naar een kolf voor nucleaire effectoren. Voeg vier microgram plasma-DNA toe aan de celsuspensie in de kolf en meng de cellen en het DNA door voorzichtig te zwenken. Tik de kolf twee keer tegen het oppervlak van de zuigkast.

Plaats de vette in de houder voor de nucleaire effector van het nucleaire effector-apparaat. Selecteer programma B 0 1 6 nucleaire effectcellen door op knop x te drukken; 'Okay' zal worden weergegeven wanneer het nucleaire affectieproces is voltooid, wat gewoonlijk één tot vijf seconden duurt. Gebruik de meegeleverde plastic pasta-pipet in de nucleaire affectiekit om de nucleair geaffecteerde cellen uit de vette te halen; herstel de cellen door ze te resuspenderen in voorverwarmde CM en rock-inhibitor in een steriele 1,5 milliliter eend orph; incubeer de cellen 10 minuten bij 37 °C.

Gebruik na 10 minuten een pipetpunt van één milliliter om de cellen druppelsgewijs over te brengen naar feederlagen. Incubeer de cellen de volgende dag gedurende de nacht bij 37 °C. Controleer de transfectie-efficiëntie.

Hier worden fotomicrografieën getoond van EGFP-expresserende RIV one menselijke iPSC-cellen die zijn getransfecteerd met GeneJuice op GelRex 12 uur na transfectie van het plasmide-DNA. DNA-transfectie van menselijke iPSCs. Het gebruik van GeneJuice met een sterke promotor levert in een transient transfectie-assay doorgaans meer dan 60% EGFP-reporter-expresserende cellen op.

EGFP-expresserende cellen kunnen ook worden verkregen via nucleaire affectie, zoals geïllustreerd in deze afbeeldingen van RIV one menselijke IPC's die zijn uitgeplaat en gevormd op feeder-cellen na nucleaire affectie met gebruik van ofwel het B 0 1 6 nucleaire affectieprogramma of het A 0 2 3 nucleaire affectieprogramma. Het gebruik van het B 0 1 6 programma resulteert in tot 80% EGFP-positieve cellen, terwijl het A 0 2 3 programma minder dan 10% EGFP-positieve cellen opleverde. Bovendien kunnen stabiele klonen van transgene menselijke iPSCs die het trends-gen tot expressie brengen, worden afgeleid.

Hier wordt een voorbeeld getoond van stabiele EGFP-expresserende menselijke iPSC-kolonies met ubiquitaire EGFP-expressie afgeleid van gene juice. Deze cellen behouden hun constitutieve EGFP-expressie tijdens embryonaire lichaamsdifferentiatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u menselijke iPS-cellen kunt nuclefecteren en transfecteren.

Efficiënte genetische manipulatie is een essentieel hulpmiddel om verschillende aspecten van de stamcelbiologie te bestuderen en zal het gebruik van menselijke iPS-cellijnen in de regeneratieve geneeskunde versnellen.