Purifying Capillaries From a Porcine Brain
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 3:45 min • July 8th, 2025
Take a porcine brain.
Remove the meninges, the protective membrane covering the brain, to prevent meningeal cell contamination.
Scrape the grey matter, a region rich in capillaries, and collect the tissue in a culture dish containing media.
Pass the grey matter through a syringe without a needle to fragment the tissue.
Transfer the fragments to a homogenizer and homogenize to disintegrate the tissue further, releasing the brain capillaries.
Pass the homogenate through a filter with a specific pore size to retain the capillaries, allowing other brain cells to flow through.
Place the filter in a solution containing enzymes and DNase.
The enzymes detach the adherent cells, while DNase degrades contaminating DNA, facilitating the isolation of pure capillaries.
Wash the capillaries from the filter.
Add media containing serum proteins to inactivate the enzymes.
Transfer the capillaries to a tube, centrifuge, and remove the supernatant. Resuspend the pure capillaries in fresh media for further analysis.
To begin this procedure, place the brains in a sterile flow bench, and gently wash them with 1 liter of PBS in a beaker placed on ice. Next, carefully remove the meninges from each brain using fine-tip forceps. Using a scalpel, scrape off gray matter from the brains one at a time, and transfer the isolated material to Petri dishes containing 20 milliliters of DMEM/F12 placed on ice.
For initial fragmentation, run the gray matter material through a 50-milliliter syringe without the needle. Repeat the procedure for all brains and pool the collected gray matter material together. Transfer the isolated gray matter material with DMEM/F12 medium to the grinder tube of a handheld tissue homogenizer. Homogenize the material by making 8 up and down strokes with a loose pestle, followed by 8 up and down strokes with a tight pestle.
Next, isolate the capillaries by filtering the homogenate using a 500-milliliter blue cap bottle with filter holder and 140 micron-filter mesh. Place the capillary containing filters in Petri dishes with the digestion solution. Subsequently, incubate the Petri dishes at 37 degrees Celsius for one hour on an orbital shaker at 180 RPM, or stir them gently every 10 minutes.
After one hour, wash off the capillaries from the filters with suspension from the Petri dish. Then, split the suspension from the three dishes into two 50-milliliter tubes, and stop the digestion by adding 10 milliliters of DMEM/F12 to each 50-milliliter tube.
Centrifuge the cell suspensions at 250 times g, 4 degrees Celsius for 5 minutes. Afterward, aspirate the supernatants, and resuspend each pellet in 10 milliliters of DMEM/F12. Then, add a further 20 milliliters of DMEM/F12 to each tube.
Overzicht
Dit artikel presenteert een verbeterd protocol voor het isoleren van capillairen uit verse varkenshersenen om een in vitro bloed-hersenbarrière (BBB) model te vestigen. De methode legt de nadruk op het zorgvuldig verwijderen van de hersenvliezen, nauwkeurige weefselbehandeling en enzymatische digestie om zuivere hersencapillairen te verkrijgen die geschikt zijn voor verdere analyse of celcultuurapplicaties.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Onderzoek naar de bloed-hersenbarrière
Achtergrond
- De bloed-hersenbarrière is een cruciale structuur die de moleculaire uitwisseling tussen de bloedbaan en de hersenen reguleert.
- In vitro BBB-modellen zijn essentieel voor het bestuderen van de barrièrefunctie en de drugpermeabiliteit.
- Endotheelcellen van varkenshersenen worden veelvuldig gebruikt vanwege hun fysiologische gelijkenis met de menselijke BBB.
- Een efficiënte isolatie van hersencapillairen is een voorwaarde voor het opzetten van betrouwbare BBB-modellen.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerde en reproduceerbare methode aan te tonen voor het isoleren van capillairen uit varkenshersenen.
- Om contaminatie door niet-capillaire cellen te minimaliseren en de opbrengst aan capillairen te maximaliseren.
- Om een protocol te bieden dat geschikt is voor de verdere vestiging en analyse van een BBB-model.
Gebruikte methoden
- Verwijdering van de hersenvliezen van verse varkenshersenen met behulp van fijne pincetten.
- Afschrapen en verzamelen van grijze stof, rijk aan capillairen, in koud cultuurmedium.
- Mechanische fragmentatie van de grijze stof met behulp van een spuit en een weefselhomogenisator.
- Filtratie van het homogenaat door een 140-micron gaas om capillairen te isoleren.
- Enzymatische digestie met enzymen en DNase om capillairen te zuiveren en adherent celmateriaal en DNA te verwijderen.
- Wassen, centrifugeren en resuspenderen van de capillairen in vers medium.
Belangrijkste resultaten
- Efficiënte isolatie van zuivere hersencapillairen uit varkensweefsel.
- Geminimaliseerde contaminatie door meningeaal weefsel en andere niet-capillaire cellen.
- Capillairen die geschikt zijn voor verdere analyse of gebruik in in vitro BBB-modellen.
- Het protocol is reproduceerbaar en schaalbaar voor meerdere hersenen.
Conclusies
- De beschreven methode biedt een betrouwbare aanpak voor het isoleren van haarvaten uit varkenshersenen.
- Zorgvuldige weefselbehandeling en enzymatische digestie zijn essentieel voor de zuiverheid en opbrengst.
- Dit protocol ondersteunt de ontwikkeling van robuuste in vitro BBB-modellen voor onderzoeksapplicaties.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Betrouwbare isolatie van capillairen uit varkenshersenen vormt de basis voor de ontwikkeling van robuuste in vitro bloed-hersenbarrière (BBB) modellen, een cruciaal omslagpunt voor het ontdekken van geneesmiddelen voor het centraal zenuwstelsel (CZS). Capillairpreparaten met een hoge zuiverheid maken een voorspellende beoordeling van de permeabiliteit van verbindingen en mechanische risicoreductie vroeg in de pijplijn mogelijk. Deze mogelijkheid ondersteunt de translationele continuïteit en portfoliotriage voor neurotherapeutische programma's.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar BBB-transportmechanismen mogelijk met behulp van fysiologisch relevante capillaire structuren.
- Ondersteunt functionele validatie van CNS-drugstargets door het leveren van authentieke endotheliale substraten.
- Faciliteert mechanistische risicovermindering van kandidaatmoleculen via gecontroleerde permeabiliteitsstudies.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerde bron van capillairen voor de reproduceerbare vestiging van een in vitro BBB-model.
- Maakt kwantitatieve beoordeling van de penetratie en efflux van verbindingen over de BBB mogelijk.
- Ondersteunt de schaalbaarheid van assays en hergebruik van het platform voor high-throughput screening van CNS-actieve verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt in vitro BBB-modellen af met ziekterelateerde menselijke fysiologie door gebruik te maken van capillairen afgeleid van varkens.
- Maakt continuïteit mogelijk van vroege ontdekking tot preklinische validatie van CNS-medicijnkandidaten.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door voorspellende permeabiliteitsgegevens te verschaffen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol voor capillaire isolatie bevindt zich op het grensvlak van vroege ontdekking en assay-ontwikkeling, waardoor downstream workflows voor BBB-modellering en compound-screening mogelijk worden gemaakt.
- Ontdekkingsbiologie: Levert capillaren van hoge zuiverheid voor het testen van hypothesen over BBB-transport en target-engagement.
- Screening: Levert reproduceerbare biologische substraten voor kwantitatieve permeabiliteits- en efflux-assays.
- Analytica: Ondersteunt de meting van verbindingspassage en barrière-integriteit met behulp van geïsoleerde capillairen.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische modellen door de fysiologische relevantie te behouden.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een schaalbaar, gestandaardiseerd protocol voor de herhaalde generatie van BBB-modellen over verschillende programma's heen.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij studies naar BBB-permeabiliteit en targetvalidatie.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van de preparatie van het BBB-model.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen voor activa in de CNS-portfolio.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neurotherapeutische kandidaten mogelijk op basis van vroege barrièregegevens.
Overwegingen bij implementatie
- Vereist technische expertise in weefseldissectie, enzymatische digestie en steriele techniek.
- Vereist toegang tot homogenisatoren, filtratieapparatuur en gecontroleerde incubatieapparatuur.
- Noodzaak van cross-team standaardisatie van de weefselverwerking en de stappen voor capillaire zuivering.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende soorten of hersengebieden, afhankelijk van de focus van het onderzoek.
- De opbrengst en zuiverheid worden beïnvloed door de weefselkwaliteit en de consistentie van de procedure.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Isolatie en Canulatie van Cerebral Parenchymale Arteriolen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Protocol voor het isoleren van de muis Cirkel van Willis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van cerebrale haarvaten van verse menselijk hersenweefsel
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolation and Culture of Primary Brain Pericytes: A Procedure to Isolate and Culture Pericytes from Bovine Brain Capillaries Without Endothelial Cell Contamination
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolation of Cerebral Capillaries from Human Brain: An Optimized Method to Extract Cerebral Capillaries from Human Brain Tissue
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Zuivering van Mouse Brain Schepen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Blootstelling van het varken voor CNS Histologische analyse: A Manual voor onthoofding, Schedel openen en Brain verwijdering
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Verbeterde methode voor de vaststelling van een In Vitro bloed - hersenbarrière Model gebaseerd op varkens Endothelial hersencellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Betrouwbare isolatie van micro vaten van het centrale zenuwstelsel in vijf gewervelde groepen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een hoge Uitvoermethode om cerebrale Pericytes van de muis te isoleren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026