Obtaining a Single-Cell Suspension from Mouse Hippocampal Tissue
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 3:42 min • July 8th, 2025
Take perfused adult mouse hippocampi fragments in a dissociation tube containing papain and DNase.
Place the tube on a mechanical dissociator.
The dissociator mechanically disintegrates the tissue, loosening cells, including neurons and glial cells.
Papain breaks down the tissue's extracellular matrix, releasing cells. DNase degrades contaminating DNA.
Add buffer containing BSA, inactivating the enzymes.
Pass the suspension through a strainer to remove large debris.
Centrifuge the filtrate. Discard the enzyme-rich supernatant.
Resuspend the cells in buffer, and transfer them to a fresh tube.
Add density gradient media, mix, and overlay the mixture with buffer.
During centrifugation, cells and debris form separate layers based on their densities.
Remove the topmost buffer layer and the middle debris layer.
Add buffer to the bottom layer containing the cells and mix. Centrifuge and discard the supernatant containing the density gradient media.
Resuspend the hippocampal cells in buffer for further analysis.
Using forceps, transfer the hippocampi tissue pieces to a C-tube, and add 30 microliters of enzyme mix 2 into the tube. After twisting the cap and tightening until it clicks, place the tube in a dissociator, and run the appropriate program. While the program is running, pre-wet a 70-micron cell strainer placed on a 50-milliliter conical tube with 2 milliliters of BSA buffer.
After the dissociation program is complete, add 4 milliliters of BSA buffer to the dissociated tissue, and filter the mixture through the cell strainer on the 50-milliliter conical tube. Next, add 10 milliliters of DPBS to the C-tube. Then close the tube, swirl the solution gently, and filter it through the cell strainer on the 50-milliliter conical tube. Centrifuge the filtered cell suspension. Discard the supernatant without disturbing the pellet, and store the pellet.
For debris removal, resuspend the pellet with 1,550 microliters of cold DPBS and transfer the suspension to a labeled 15-milliliter conical tube. Then, add 450 microliters of cold debris removal solution, and pipette up and down. Gently overlay the cell suspension with 1 milliliter of cold DPBS, keeping the tip against the wall of the conical tube. Repeat the procedure until the total overlay is 2 milliliters.
Next, centrifuge the suspension at 3,000 times g for 10 minutes with full acceleration and full brake. Aspirate the topmost layer. Then, sweep the pipette tip back and forth to aspirate the white middle layer. Remove as much of the middle layer as possible without disturbing the bottom-most layer. Next, add 2 milliliters of cold DPBS, and pipette up and down to mix. Then, centrifuge the suspension at 1,000 times g for 10 minutes with full acceleration and full brake. After centrifugation, discard the supernatant, and resuspend the pellet in 1 milliliter BSA buffer.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het isoleren van hippocampale cellen uit weefsel van volwassen muizen met behulp van enzymatische dissociatie en dichtheidsgradiëntcentrifugatie. De methode is erop gericht om levensvatbare neuronen en glialcellen te verkrijgen voor verdere analyse.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Weefseltechnologie
Achtergrond
- De hippocampus is cruciaal voor leren en geheugen.
- Het isoleren van cellen uit de hippocampus maakt gedetailleerde studie van de neuronale functie mogelijk.
- Enzymatische dissociatie is een gebruikelijke methode voor celisolatie.
- Dichtheidsgradiëntcentrifugatie helpt bij het scheiden van cellen op basis van hun dichtheid.
Doel van het onderzoek
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het isoleren van hippcampale cellen.
- Het waarborgen van de levensvatbaarheid van de geïsoleerde neuronen en gliale cellen.
- Het faciliteren van verdere experimentele analyse van deze cellen.
Gebruikte methoden
- Mechanische dissociatie van weefsel met behulp van een dissociator.
- Enzymatische behandeling met papaine en DNase om de extracellulaire matrix af te breken.
- Dichtheidsgradiëntcentrifugatie om cellen van debris te scheiden.
- Filtratie door een celzeefje om grote deeltjes te verwijderen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van levensvatbare hippocampale neuronen en gliacellen.
- Demonstratie van effectieve verwijdering van debris en contaminanten.
- Protocoloptimalisatie voor een verbeterde celopbrengst en levensvatbaarheid.
- Vestiging van een reproduceerbare methode voor toekomstige studies.
Conclusies
- Het beschreven protocol is effectief voor het isoleren van hippocampale cellen.
- Het biedt een basis voor verder onderzoek naar neuronale functies.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode om diverse aspecten van de neurowetenschappen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het verkrijgen van levensvatbare enkelcel-suspensies uit complexe weefsels zoals de hippocampus is cruciaal voor downstream-applicaties in targetvalidatie en fenotypische screening. Dit protocol maakt de reproduceerbare isolatie van neuronen en gliacellen mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische de-risking bij het ontdekken van geneesmiddelen voor neurowetenschappen. De methode biedt een ziekte-relevant systeem voor het evalueren van effecten van verbindingen op de cellulaire functie en pathway-modulatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar neuronale en gliale doelwitten in de hippocampus in een natuurgetrouwe micro-omgeving.
- Operationele waarde: Levert zeer levensvatbare cellen op die geschikt zijn voor functionele assays en studies naar target engagement.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert een gezuiverde celpopulatie voor consistente assay-metingen en verminderde variabiliteit.
- Operationele waarde: Filtratie- en centrifugatiestappen waarborgen de verwijdering van debris, waardoor de betrouwbaarheid en schaalbaarheid van de assay worden verbeterd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekterevariant-relevant systeem om mechanismen van leren en geheugen te bestuderen, wat bijdraagt aan de afstemming van biomarkers.
- Operationele waarde: Dichtheidsgradiëntcentrifugatie maakt de scheiding van levensvatbare cellen van contaminanten mogelijk, wat reproduceerbare preklinische workflows ondersteunt.
Integratie van Pipeline en Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van target-hypothesetoetsing tot assay-ontwikkeling en biedt een betrouwbare stap voor celvoorbereiding voor functionele validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door levensvatbare hippocampale neuronen en glia te leveren voor padanalyse.
- Screening: Levert een gestandaardiseerde, puine vrije suspensie die betrouwbare screening van verbindingen mogelijk maakt.
- Analytica: Maakt kwantitatieve downstream-metingen mogelijk, zoals marker-expressie of elektrofysiologie.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt hippocampale isolatie met preklinische continuïteit via een opbrengst van levensvatbare, functionele cellen.
- Bedrijfsmatige Hergebruik: De workflow voor dissociatie en purificatie is aanpasbaar aan verschillende neurale weefseltypen, wat hergebruik van het platform ondersteunt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door fysiologisch relevante neurale cellen te leveren.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde enzymatische en mechanische stappen verbeteren de reproduceerbaarheid tussen verschillende locaties.
- Strategische waarde: Vermindert biologische ruis in assays, wat betere go/no-go beslissingen bij targetvalidatie ondersteunt.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van functionele responsen van hippocampale cellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in weefselverwerking en optimalisatie van enzymatische dissociatie.
- Afhankelijk van toegang tot een mechanische dissociator, cellstrainers en centrifugeerapparatuur.
- Vereist standaardisatie van enzymconcentraties en dissociatietijden tussen verschillende gebruikers.
- Aanpassing aan andere hersenregio's kan aanpassingen in de enzymmix en de mechanische kracht vereisen.
- Residuele enzymactiviteit moet volledig worden geïnactiveerd om celschade na de dissociatie te voorkomen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Spinal Cord Neurons Isolatie en Cultuur van Neonatale Muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Celdissociatie van het tongepitheel en mesenchym/bindweefsel van embryonale dag 12,5 en 8 weken oude muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Eenvoudige en reproduceerbare primaire cultuur met lage dichtheid met behulp van bevroren voorraad embryonale hippocampusneuronen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Generatie van de Single-celsuspensies van Mouse Neural Tissue
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie en Cultuur van hippocampale neuronen van Prenatal Muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Dissociating and Culturing Neurons from Hippocampal Tissue Samples
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Preparing a Single-Cell Suspension of Immune Cells from Murine Brain Tissue
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Obtaining Various Neural Cell Populations from a Rat Hippocampus
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Obtaining a Single-Cell Suspension from Frozen Rat Brain Tissue
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026