Preparing a Single-Cell Suspension of Immune Cells from Murine Brain Tissue
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 3:51 min • July 8th, 2025
Begin with a murine brain with neural, non-neural, and immune cells within the brain's extracellular matrix or ECM.
Mince the tissue and resuspend it in a culture medium.
Transfer these tissue fragments to a tube and treat them with collagenase and DNase-I enzymes.
Collagenase digests the ECM, releasing individual cells, while DNase-I degrades free DNA to prevent cell clumping.
Then, add EDTA to inactivate the collagenase enzymes.
Add a culture medium. Centrifuge and remove the supernatant.
Add a density gradient solution and the culture medium to the cell pellet, creating a low-density gradient layer.
Mix and then underlay the solution with a high-density gradient solution to establish a density difference.
Centrifuge at low speed to separate immune cells at the interface, with lighter cell debris at the top and heavier neuronal and glial cells at the bottom.
Remove the upper layer, and collect the immune cells, and transfer them to another tube.
Centrifuge and remove the supernatant, then resuspend the cells in a medium, forming a single-cell suspension for downstream applications.
Pour the brain or spinal cord tissue with the media into a 100-millimeter Petri dish, and use forceps to move the tissue to the bottom. Mince the brain tissue with a sterile razor blade, and gather the tissue at the bottom of the plate. Add 3 milliliters of RPMI supplemented with 10% FCS to the Petri dish, then use a 10-milliliter serological pipette to resuspend the tissue in the media and transfer it to a 15-milliliter conical tube.
Add collagenase type I and DNase I to the tissue and incubate the tubes in a 37 degrees Celsius water bath for 40 minutes. Invert the tubes every 15 minutes to thoroughly mix the tissue with the enzymes. After incubation, add EDTA to each tube for a final concentration of 0.01 molar, and incubate the tubes for an additional five minutes to inactivate the collagenase.
Add 9 milliliters of RPMI, supplemented with 10% FCS to each tube, then, centrifuge the tubes at 450 g for 5 minutes at 4 degrees Celsius. Use a Pasteur pipette with a vacuum to aspirate the supernatant, taking care not to touch the cell pellet.
Add 3 milliliters of 100% stock isotonic density gradient solution to the cell pellet. Then, add additional RPMI 10% FCS media to bring the final volume to 10 milliliters and resuspend the cell pellet. Invert and mix the tube well. Then, insert a serological pipette with 1 milliliter of 70% stock isotonic density gradient solution into the bottom of the tube.
Slowly underlay the solution, being careful not to make bubbles. Remove the serological pipette from the tube, making sure not to disturb the gradient. Centrifuge the tube at 800 g for 30 minutes at 4 degrees Celsius, then aspirate the supernatant, including the myelin debris layer until 2 to 3 milliliters remain in the tube.
Use a 1-milliliter pipette to harvest the cell layer between the 30% and 70% density gradient and transfer it to a new 15-milliliter tube. Add RPMI 10% FCS media to bring the final volume to 15 milliliters, then centrifuge the cells at 450 g for 5 minutes at 4 degrees Celsius.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het isoleren van immuuncellen uit muisbreinweefsel. Het proces omvat enzymatische digestie van de extracellulaire matrix en daaropvolgende dichtheidsgradiëntcentrifugatie om celtypen te scheiden.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Het begrijpen van de dynamiek van immuuncellen in de hersenen is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- De isolatie van specifieke celtypen maakt gedetailleerde studie van hun functies mogelijk.
- Enzymatische digestietechnieken worden veelvuldig gebruikt om cellen uit weefsel vrij te maken.
- Dichtheidsgradiëntcentrifugatie helpt bij de scheiding van verschillende celpopulaties.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het isoleren van immuuncellen uit hersenweefsel van muizen.
- Het faciliteren van downstream-toepassingen in de neurowetenschappen en immunologie.
- Het verbeteren van het begrip van immuunreacties in het centrale zenuwstelsel.
Gebruikte methoden
- Muizenbreinweefsel wordt fijngehakt en behandeld met collagenase en DNase-I.
- EDTA wordt toegevoegd om collagenase na de digestie te inactiveren.
- Dichtheidsgradiëntoplossingen worden gebruikt om immuuncellen te scheiden van andere celtypen.
- Centrifugatie wordt uitgevoerd om de gewenste celpopulaties te isoleren.
Belangrijkste Resultaten
- De succesvolle isolatie van immuuncellen uit hersenweefsel is bereikt.
- De methode maakt het mogelijk om een single-cell suspensie te verkrijgen.
- De levensvatbaarheid en functionaliteit van de cellen bleven gedurende het proces behouden.
- Geïsoleerde immuuncellen kunnen worden gebruikt voor diverse downstream-toepassingen.
Conclusies
- De beschreven methode is effectief voor het isoleren van immuuncellen uit muizenbreinweefsel.
- Deze techniek kan het onderzoek in de neuro-immunologie verder bevorderen.
- Verdere studies kunnen de rol van deze immuuncellen bij neurologische ziekten onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het isoleren van immuuncellen uit muizenbreinweefsel maakt mechanische risicoreductie bij de validatie van neuro-immunologische targets mogelijk door een ziekterelevant systeem te bieden voor functionele analyse. Deze benadering ondersteunt fenotypische screening en assay-ontwikkeling voor therapeutica die het centrale zenuwstelsel moduleren, waardoor het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase wordt vergroot. De methode faciliteert de afstemming van translationele biomarkers en de continuïteit van preklinische modellen voor immuun-gemedieerde neurologische indicaties.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & doelwitvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen over de functie van immuuncellen bij pathologieën van het centrale zenuwstelsel te onderzoeken.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar biologisch systeem voor de verduidelijking van signaalpaden en het verminderen van risico's bij targetvalidatie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de prioritering van portfolio's door mechanistische ambiguïteit bij de selectie van neuro-immuuntargets te verminderen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde immuuncelsuspensies voor voor daaropvolgende functionele en fenotypische assays.
- Operationele waarde: Garandeert assay-standaardisatie door consistente celisolatie en levensvatbaarheid.
- Schaalbaarheid: Maakt hergebruik van het platform mogelijk voor compound-screeningcampagnes die gericht zijn op neuroinflammatoire pathways.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische validatie met behulp van ziekterelevante immuuncelsystemen.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt de identificatie en validatie van translationele biomarkers uit geïsoleerde immuunpopulaties van het centrale zenuwstelsel.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert go/no-go-beslissingen door mechanistische read-outs te bieden over target engagement in immuuncellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode positioneert de isolatie van immuuncellen als een cruciale vroege ontdekkingsstap die lead-identificatie en preklinische validatie in neuro-immunologische programma's mogelijk maakt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en biologische risicoreductie van immuuntargets in het centraal zenuwstelsel door middel van directe functionele bevraging.
- Screening: Levert assay-ready, reproduceerbare cel-suspensies voor kwantitatieve compound-screening en targetvalidatie.
- Analytics: Genereert levensvatbare single-cell suspensies die flowcytometrie, genexpressie en functionele read-outs mogelijk maken voor comparatieve conditieanalyse.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt immuuncelfenotypes met preklinische ziektestudies via geïsoleerde, functioneel relevante populaties.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerde isolatiecapaciteit die toepasbaar is op meerdere neuro-immunologieprojecten en targetklassen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanische ambiguïteit in neuro-immuunpaden te verminderen.
- Operationele waarde: Zorgt voor standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid bij de preparatie van immuuncellen voor downstream-applicaties.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door vroege biologische risicovermindering mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van CZS-targets via gevalideerde functionele assays op basis van immuuncellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in weefseldissociatie, enzymatische digestie en dichtheidsgradiëntcentrifugatietechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot centrifugatieapparatuur, enzymatische reagentia (collagenase, DNase-I, EDTA) en gradiëntoplossingen.
- Maakt cross-team standaardisatie van isolatieprotocollen noodzakelijk om reproduceerbaarheid tussen discovery- en preklinische units te waarborgen.
- Vereist aanpassingen bij het toepassen van de methode op andere neurale weefsels of ziektemodellen.
- Praktische beperkingen omvatten weefselvariabiliteit en de noodzaak voor enzymoptimalisatie om de levensvatbaarheid en functionaliteit van immuuncellen te behouden.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Voorbereiding van de Single-cell Charms voor Cytofluorimetric Analyse van verschillende Mouse Skin Regio
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Flow Cytometrische Analyse van lymfocyten infiltratie in het centrale zenuwstelsel tijdens experimentele auto-immuunenceomyelitis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Voorbereiding van de Single-celsuspensies van Mouse Spleen met de gentleMACS Dissociator
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Generatie van de Single-celsuspensies van Mouse Neural Tissue
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Mononuclear Cell Isolation from Mouse Brain: A Density Gradient Centrifugation Technique to Isolate Brain Resident Mononuclear Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolation of Microglia from the Cortex of an Adult Mouse Brain
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolating Tumor-Infiltrating Immune Cells from a Murine Brain
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Obtaining Cell Suspensions from Ischemic Mouse Brain Tissues
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie en Flow cytometrische analyse van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026