Differentiating Otic Progenitor Cells Into Sensory Epithelial Cells Followed by Immunostaining
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 3:55 min • July 8th, 2025
Culture immortalized multipotent otic progenitor, or iMOP, cells in media.
Growth factors in the media facilitate iMOP proliferation and colony formation, creating otospheres.
Collect the otospheres and let them settle by gravity.
Remove the media and add differentiation media lacking growth factors. Plate the otospheres.
The absence of growth factors initiates iMOP differentiation into sensory epithelial cells.
Collect the differentiated otospheres and let them settle.
Remove the media and add a fixative to preserve cellular morphology.
Next, add a detergent to permeabilize cellular and nuclear membranes.
Add a blocking buffer to prevent non-specific antibody binding.
Introduce primary antibodies targeting a specific differentiation marker.
Add fluorophore-conjugated secondary antibodies targeting the primary antibodies, fluorescently labeled phalloidin to stain actin, and a DNA-binding dye to stain the nuclei.
Mount the otospheres.
Using fluorescence microscopy, visualize the staining to confirm iMOP differentiation.
Three days after plating, use gravity sedimentation to collect otospheres as previously shown. Proceed to aspirate the supernatant, and gently resuspend the cells in 2 milliliters of sensory epithelial differentiation medium. Then, use a 10-milliliter large-bore pipette to transfer the otospheres to a new 60-millimeter dish. Differentiate the otospheres for 10 days, adding 2 milliliters of fresh differentiation medium to the culture every other day.
Afterwards, harvest the otospheres again through gravity, sedimentation, and aspirate the spent medium. Next, fix the otospheres in 4% paraformaldehyde in 1X PBS for 15 minutes at room temperature. Then, remove the formaldehyde solution, and wash the cells in 1X PBS containing 0.1% Triton X-100. Proceed by blocking the otospheres in 1X PBS, supplemented with 10% goat serum and 0.1% Triton X-100.
After one hour, replace the blocking buffer with that containing the appropriate dilution of Cdkn1b or Cdh1 antibody. Then, incubate the cells in primary antibody overnight at 4 degrees Celsius, and the next day, continue immunostaining using fluorescently labeled secondary antibodies, phalloidin, and Hoechst as described elsewhere.
To prepare for imaging, place mounting medium on a glass slide and then introduce the stained otospheres into the medium. Next, lay a coverslip on top of the sample. After letting the mounting medium dry overnight at 4 degrees Celsius, place the slide on the stage of an inverted microscope equipped with a 16-bit CCD camera. Using the 20X 0.75 air objective, acquire epifluorescence images by collecting data from the blue, green, red, and infrared channels.
Overzicht
Dit artikel beschrijft de differentiatie van geïmmortaliseerde multipotente otische progenitorcellen (iMOP-cellen) tot sensorische epitheelcellen. Het proces omvat het kweken van iMOP-cellen, het induceren van differentiatie en het visualiseren van de resultaten met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Stamcelonderzoek
Achtergrond
- iMOP-cellen zijn afgeleid van de otische regio en beschikken over multipotente eigenschappen.
- Groeifactoren spelen een cruciale rol bij de proliferatie en kolonievorming van deze cellen.
- Het differentiatieproces wordt geïnitieerd door de groeifactoren uit het kweekmedium te verwijderen.
- Fluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om cellulaire veranderingen tijdens de differentiatie te visualiseren.
Doel van de studie
- Om het differentiatiepotentieel van iMOP-cellen tot sensorische epitheelcellen te onderzoeken.
- Om een betrouwbare methode vast te stellen voor de visualisatie van gedifferentieerde cellen.
- Om bij te dragen aan het begrip van de otische cellijn en ontwikkeling.
Gebruikte methoden
- Kweek van iMOP-cellen in medium aangevuld met groeifactoren.
- Inductie van differentiatie door overschakeling naar medium zonder groeifactoren.
- Immunokleuring met primaire en secundaire antilichamen om differentiatiemarkers te visualiseren.
- Fluorescentiemicroscopie om de differentiatie van iMOP-cellen te bevestigen.
Belangrijkste resultaten
- De succesvolle differentiatie van iMOP-cellen naar sensorische epitheelcellen is gerealiseerd.
- Fluorescentiemicroscopie toonde duidelijke kleuringspatronen aan die wijzen op differentiatie.
- De cellulaire morfologie bleef gedurende het differentiatieproces behouden.
- Immunokleuring bevestigde de expressie van specifieke differentiatiemarkers.
Conclusies
- De studie biedt een methode voor het differentiëren van iMOP-cellen tot sensorische epitheelcellen.
- Fluorescentiemicroscopie is een effectief hulpmiddel voor het visualiseren van cellulaire differentiatie.
- Deze bevindingen kunnen implicaties hebben voor de regeneratieve geneeskunde en het gehooronderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor het management
Deze methode maakt de generatie van sensorische epitheelcellen uit geïmmortaliseerde otische progenitorlijnen mogelijk, wat een hernieuwbaar in vitro-systeem biedt voor het bestuderen van de biologie van het binnenoor. Het ondersteunt targetvalidatie in auditief onderzoek door mechanistische analyse van differentiatiepaden en markerexpressie mogelijk te maken. De aanpak biedt voorspellende waarde voor het screenen van otoprotectieve of regeneratieve verbindingen in een ziekterelevante cellulaire context.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar differentiatiepaden en lineage-committering van otische progenitorcellen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de functionele validatie van sensorische epitheelmarkers zoals Cdkn1b en Cdh1.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert mechanistische risicoanalyse van targets die betrokken zijn bij de ontwikkeling en het behoud van haarcellen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert gedifferentieerde sensorische epitheelcellen die geschikt zijn voor screening-assays van verbindingen.
- Operationele waarde: Maakt gestandaardiseerde, reproduceerbare generatie van otosferen mogelijk voor consistente resultaten.
- Operationele waarde: Ondersteunt kwantitatieve fluorescentiegebaseerde meting van marker-expressie en actinorganisatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekterelevant systeem voor het modelleren van fenotypen van sensorische epitheelcellen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt translationele biomarker-afstemming via immunokleuring van differentiatiemarkers.
- Strategische waarde: Maakt risico-gecorrigeerde ontwikkeling mogelijk van verbindingen gericht op otische regeneratie of bescherming.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie en biedt een platform voor mechanistische en fenotypische screening in het auditieve onderzoek.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van genen en pathways die de differentiatie van otische progenitorcellen reguleren.
- Screening: Levert assay-klare sensorische epitheelcellen met reproduceerbare morfologie en marker-expressie.
- Analytics: Maakt kwantitatieve beoordeling van differentiatie mogelijk via fluorescentie-intensiteit en co-lokalisatie van markers.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege ontdekking met preklinische validatie via geconserveerde markerpanels en cellulaire fenotypes.
- Enterprise Reuse: Vestigt een hernieuwbaar, schaalbaar platform voor herhaaldelijk gebruik in meerdere projecten en verbindingenseries.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de validatie van otische targets door directe observatie van differentiatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert workflows voor differentiatie en immunokleuring om variabiliteit te verminderen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door mechanistisch inzicht te bieden in de effecten van verbindingen op de ontwikkeling van het sensorisch epitheel.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van otisch gerichte kandidaten op basis van de effectiviteit van de differentiatie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in celkweek, immunokleuring en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van toegang tot omgekeerde microscopen met epifluorescentie en geschikte filtersets.
- Vereist standaardisatie van antilichaamverdunningen en blokkeringscondities tussen gebruikers.
- Aanpassing aan alternatieve otische progenitorlijnen kan optimalisatie van differentiatiedia vereisen.
- Beperkt door de noodzaak van langdurige kweekperioden en zorgvuldige behandeling van otosferen tijdens de verwerking.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Protocol voor de differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in gemengde culturen van neuronen en glia voor het testen van neurotoxiciteit
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Inductie van Endothelial differentiatie in cardiale voorlopercellen onder lage Serum voorwaarden
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Differentiatie van embryonale stamcellen in de oligodendrocyt Voorlopers
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isoleren neus Olfactorische stamcellen van Knaagdieren of mensen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isoleren van LacZ-expressie Cellen van Mouse Inner Ear weefsels met behulp van flowcytometrie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Progenitor afgeleide oligodendrocyt Cultuur System van menselijke foetale hersenen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Differentiating Human Embryonic Stem Cells into Oligodendrocytes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Differentiating Immortalized Multipotent Otic Progenitors into Spiral Ganglion Neurons and Evaluating the Differentiation
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Cultuur van embryonale Mouse Cochlear Explantaten en Gene Transfer door elektroporatie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026