Isolating Murine Retinal Ganglion Cells Using Fluorescence-Activated Cell Sorting
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 3:10 min • July 8th, 2025
Place a murine retina on a moistened cell strainer and macerate in a circular motion to separate the retinal cells from the extracellular matrix.
Transfer the strainer to a collection tube.
Add a phosphate buffer and serum solution to the strainer to wash and collect the cells.
Centrifuge to settle the cells. Discard the supernatant and resuspend the cells in a phosphate buffer and serum solution.
Add blocking antibodies that bind to Fc receptors on cells, preventing non-specific binding of target antibodies.
Next, add fluorescently tagged and untagged primary antibodies that bind to specific cell surface markers on various cell types.
Wash to remove unbound antibodies.
Add a fluorescently tagged secondary antibody to bind to the untagged primary antibody.
Wash to remove unbound antibodies.
Perform fluorescence-activated cell sorting, or FACS to capture the distinct fluorescent signals of the labeled cells and sort the retinal ganglion cells from various retinal cell populations.
Place up to 12 retinae onto a sterile 70-micron nylon strainer moistened with PBS and FBS, and gently macerate the retina with the back end of a 10-milliliter syringe plunger using a circular motion. When all of the cells have been dissociated, place the strainer over a polypropylene collection tube, and use a P1000 pipette to filter the cells through the strainer into the collection tube.
Rinse the strainer with PBS and FBS, pooling the wash in the collection tube. Add enough PBS plus FBS to bring the final volume up to 1 milliliter of solution per retina, and collect the cells by centrifugation. Then, resuspend the pellet in PBS plus FBS at a 1 milliliter of medium per 5 retinae concentration. Next, block any nonspecific FC receptor binding in each tube with 1 microliter of anti-mouse CD16/32 antibody per 1 x 106 cells for 10 minutes at room temperature.
At the end of the blocking incubation, add the antibody cocktail of interest to the cells with gentle pipetting for a 30-minute incubation on ice protected from light. Then, wash the cells two times in a 4-milliliter final volume of PBS and FBS. Label the cells with an appropriate secondary antibody for another 30 minutes on ice protected from light, followed by 2 washes in PBS plus FBS, and load the sample tube onto the flow cytometer.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het isoleren van retinale ganglioncellen uit muizenretina's met behulp van fluorescence-activated cell sorting (FACS). De methode omvat het dissocieren van retinale cellen, het blokkeren van aspecifieke binding en het labelen van cellen met antilichamen voor sortering.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Retinale ganglioncellen zijn cruciaal voor de visuele verwerking.
- De isolatie van deze cellen is essentieel voor het bestuderen van hun eigenschappen en functies.
- FACS maakt het mogelijk om specifieke celtypen te sorteren op basis van fluorescente labeling.
- Een correcte behandeling en preparatie van het retinale weefsel zijn kritisch voor een succesvolle celisolatie.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerde methodologie te bieden voor het isoleren van retinale ganglioncellen.
- Om het begrip van retinale celpopulaties te verbeteren.
- Om verder onderzoek naar retinale ziekten en therapieën te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Maceratie van muizenretina's om cellen te dissociëren.
- Gebruik van fosfaatbuffer en serum voor het wassen van cellen.
- Toepassing van blockerende antilichamen om aspecifieke binding te voorkomen.
- Fluorescente labeling van cellen gevolgd door FACS voor sortering.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van retinale ganglioncellen uit gemengde retinale populaties.
- Demonstratie van effectieve blokkeer- en labeltechnieken.
- Validatie van FACS als een betrouwbare methode voor cel sortering.
- Het bieden van een reproduceerbaar protocol voor toekomstige studies.
Conclusies
- Het beschreven protocol is effectief voor het isoleren van retinale ganglioncellen.
- FACS biedt een krachtig instrument voor het bestuderen van specifieke celtypen in het netvlies.
- Deze methodologie kan bijdragen aan de vooruitgang van het onderzoek naar het netvlies en therapeutische benaderingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het isoleren van primaire retinale ganglioncellen maakt mechanische risicoreductie mogelijk bij de validatie van targets voor neurodegeneratieve ziekten door een gezuiverd, ziekterellevant systeem te bieden voor functionele assays. Deze aanpak ondersteunt het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door directe interactie met RGC-specifieke pathways en therapeutische hypothesen mogelijk te maken. De methode verbetert de translationele continuïteit van targetidentificatie naar preklinische modellering in programma's voor visuele neurowetenschappen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele ondervraging van retinale ganglioncellen mogelijk om targets te valideren die betrokken zijn bij pathways voor visusverlies.
- Operationele waarde: Biedt een gezuiverde primaire celpopulatie, waardoor storende signalen in mechanistische studies worden verminderd.
- Predictieve waarde: Ondersteunt target de-risking via directe meting van RGC-specifieke responsen op modulatoren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert een gestandaardiseerd, reproduceerbaar cellulair substraat voor de ontwikkeling van fluorescentie- of luminescentiegebaseerde functionele RGC-assays.
- Kwantitatieve output: Maakt metingen van afhankelijke variabelen mogelijk, zoals neurietenuitgroei, calciumflux of overleving onder behandeling met verbindingen.
- Schaalbaarheid: Het FACS-gebaseerde isolatieproces maakt het mogelijk om meerdere retinae te poolen om voldoende celaantallen te bereiken voor assay-screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Maakt gebruik van primaire muis-RGC's als een ziekterelevant systeem om neurodegeneratieve processen te modelleren die de visuele functie beïnvloeden.
- Translationele Continuïteit: Slaat een brug tussen doelwitvalidatie en preklinische effectiviteitstests door een consistent cellulair fenotype te bieden over de verschillende studiefasen heen.
- Mechanische Risicoreductie: Vermindert biologische ambiguïteit in pathway-analyse door het specifieke celtype te isoleren dat de therapeutische hypothese medieert.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via assayontwikkeling tot preklinische evaluatie, waardoor iteratieve verfijning van therapeutische kandidaten mogelijk is op basis van RGC-specifieke readouts.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door het isoleren van de cellulaire effectoren van visuele signaleringscascades.
- Screening: Levert assay-ready cellen met gestandaardiseerde expressie van oppervlaktemarkers voor betrouwbare compound-screening.
- Analytiek: Faciliteert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen die essentieel zijn voor dosis-respons- en target-engagement-analyses.
- Translationeel onderzoek: Biedt continuïteit van geïsoleerde primaire cellen naar validatie van ziektemodellen in preklinische systemen.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbare isolatieworkflow die toepasbaar is op meerdere projecten gericht op RGC's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van het target door cellulaire heterogeniteit in functionele read-outs te verminderen.
- Operationele waarde: Standardiseert de celvoorbereiding tussen teams, wat de reproduceerbaarheid van downstream assays verbetert.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door mechanistische helderheid te bieden over target-effecten in het relevante celtype.
- Impact op portfolio: Maakt risicogestuurde prioritering mogelijk van verbindingen die activiteit vertonen in gevalideerde RGC-systemen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in flowcytometrie, antilichaamlabeling en het verwerken van primair weefsel.
- Afhankelijk van toegang tot een fluorescentie-geactiveerde cel-sorter en een compatibele biosafety-infrastructuur.
- Vereist gestandaardiseerde antilichaampanels en blokkeringsprotocollen om consistente sortering over experimenten heen te waarborgen.
- Er moet rekening worden gehouden met variabiliteit in de efficiëntie van de retina-dissociatie bij het opschalen over meerdere weefselmonsters.
- Beperkt door de opbrengst en viabiliteit van primaire retinale ganglioncellen na isolatie, wat de assay-window kan beïnvloeden.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Single-cell RNA-Seq van gedefinieerde subsetjes van retinale Ganglion-cellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Cocultuur van Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons met Olfactory Ensheathing Glia, als een In Vitro Model van Volwassen Axonale Regeneratie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Op methanol gebaseerd hele-mountpreparaat voor het onderzoek van retinale ganglioncellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een geïsoleerde Retinale Voorbereiding op Light Response Opnemen van genetisch Labeled retinale ganglioncellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Microglia Isolation by Immunostaining Coupled Cell Sorting: An Immunostaining Method to Isolate Microglia from Zebrafish Brain Cells Using Fluorescent Activated Cell Sorting
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Identification of Mouse Retinal Ganglion Cell Subtypes Through Fluorescent Tracing
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGC's) door Flow Cytometry
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie en cultuur van Oculomotor, Trochlear en spinale motor neuronen van prenatale ISLMN: GFP transgene muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Twee peelingmethoden voor de isolatie van fotoreceptorcelcompartimenten in het netvlies van de muis voor eiwitanalyse
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van murine retinale endotheelcellen voor next-generation sequencing
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026