Plasma Lithografie Surface Patterning voor de schepping van Cell Networks

Het algemene doel van het volgende experiment is het creëren van cellulaire micro-omgevingen om biologische vragen te bestuderen met betrekking tot individueel en collectief celgedrag dat plaatsvindt op micro- en nanoschaal. Dit wordt bereikt door eerst templates te ontwerpen die uiteindelijk de plaatsing van de cellen zullen sturen. Vervolgens worden deze ontwerpen via fotolithografie vertaald naar patroonoppervlakken, wat de creatie van plasma-afschermingsmallen via soft-lithografie mogelijk maakt.

Ten slotte worden deze afschermingsmallen in een Petrischaal in een driepootconfiguratie geplaatst om selectieve blootstelling van de onderliggende oppervlakken aan plasma mogelijk te maken, waardoor er op de gebieden onder elke mal een celgevoelig chemisch patroon ontstaat. Hiermee kunnen resultaten worden verkregen die laten zien hoe het gedrag van een cel afhangt van de micro-omgeving en de interactie met naburige cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de effecten van micro-omgevingen op celgedrag, zoals de vraag hoe interacties tussen groepen cellen invloed hebben op fenomenen van hogere orde.

En hoe beïnvloeden subcellulaire nanoscale signalen functies zoals gezondheid, migratie en differentiatie? Gebruik eerst secondelijm om een patroonplaatje aan een stapel blanco objectglazen te bevestigen. Maak vervolgens een bakje van aluminiumfolie dat iets groter is dan de stapel objectglazen en groot genoeg is om 30 gram polydimethylsiloxaan of PDMS te bevatten.

Plaats de stapel objectglaasjes in de houder en giet vervolgens PDMS over de stapel objectglaasjes om een initiële mal te maken. Ontgas daarna de PDMS door de houder in een vacuümkamer te plaatsen. Verwijder eventuele luchtbellen in de PDMS door een vinger meerdere keren snel van de toevoerleiding van het inlaatventiel te verwijderen en weer terug te plaatsen, zodat er kortstondig lucht in de kamer kan stromen.

Het ventiel blijft vijf minuten gesloten voor een ononderbroken ontgassing. Laat de PDMS vervolgens één tot twee dagen uitharden in de cleanflowkap bij kamertemperatuur. Zodra de PDMS is uitgehard, wordt deze van het masterpatroon afgepeld, waardoor een mal ontstaat.

Giet vervolgens een dunne laag van zes gram twee-componenten epoxy, die zojuist één minuut lang is gemengd, in de mastermal. Ontgas de epoxy onmiddellijk met meerdere bellenbrekende cycli voordat de epoxy uithardt. Nadat de ontgaste epoxy een uur ongestoord heeft kunnen rusten, is deze gedeeltelijk uitgehard.

Voeg meer epoxy toe aan de mal zonder te ontgassen om een dikkere structuur te verkrijgen die in latere stappen gemakkelijker te hanteren is. Laat de epoxy vervolgens één tot twee dagen uitharden. Zodra de epoxy-mal is uitgehard, wordt de epoxy uit de PDMS-moedermal verwijderd en wordt de epoxy-mal vervolgens met tape omwikkeld om een houder te vormen.

Een werkmatrijs kan vervolgens worden gemaakt door PDMS op de epoxymatrijs te gieten, het PDMS te ontgassen en de nieuwe matrijs één tot twee dagen te uitharden. Zodra de werkmatrijs is uitgehard, wordt deze van de epoxy afgepeld en worden beide in petrischalen bewaard in een afgesloten plastic container in de laminaire flowkast om de reinheid te waarborgen. Om een matrijs voor oppervlaktepatronering voor te bereiden, worden kleine secties van de werkmatrijs met een scheermesje uitgesneden en in een petrischaal geplaatst.

De posities van deze malsecties worden op de achterzijde van de Petrischaal met een permanente marker aangegeven door een omtrek te tekenen rond de plek waar de malsecties geplaatst zijn. Vorm een statief van de secties en belast het statief om een conform contact tussen de werkmal en het oppervlak van de Petrischaal te garanderen. Controleer de onderkant van de schaal om een goede plaatsing te bevestigen, wat blijkt uit de aanwezigheid van kanalen die met het blote oog of met een kleine vergrootglas zichtbaar zijn. Plaats de assemblage in een plasmakamer.

Start de plasmabehandeling na de plasmabehandeling. Verwijder de mal en de gewichtsopstelling en plaats de Petrischaal voor sterilisatie gedurende 10 minuten onder UV-licht in een veiligheidskast. Bewaar de schaal daar totdat deze met cellen wordt gezaaid.

Verdun de gekozen experimentele cellen in hun standaard kweekmedium om de gewenste confluentie te bereiken. Giet drie milliliters van de celoplossing in de gepatroneerde Petrischaal zodra deze op het oppervlak is geplaatst. Incubeer de gepatroneerde Petrischaal bij 37 °C, 5% CO2 en 100% luchtvochtigheid gedurende enkele uren tot enkele dagen, zodat de cellen zich kunnen assembleren op het patroon dat door de plasmacel is gecreëerd.

Het patroon wordt gecontroleerd met fasecontrastmicroscopie. Voeg bij het kweken van neuroblastoomcellen dagelijks 10 micromolair retinoïnezuur toe totdat celdifferentiatie naar een neuronale toestand wordt waargenomen. Vervang het standaard celkweekmedium elke drie tot vier dagen.

Een typisch resultaat van de implementatie van de plasmalithografietechniek is de vorming van een celpatroon dat lijkt op een willekeurige of natuurlijke structuur. Een voorbeeld hiervan is hier in deze figuur te zien met neuronen die met retinoïnezuur zijn gedifferentieerd op een patroon van lijnen. En hier in deze figuur waar lijnen en netwerken van neuronen zijn gecreëerd; ook andere celtypen dan neuronen kunnen worden gebruikt, zoals te zien is in deze volgende twee figuren: deze figuur toont menselijke navelstrengendotheelcellen, en deze figuur toont C2C12 skeletspiercellen die roosters vormen zoals hier te zien is.

Materialen zoals polylysine kunnen ook in patronen worden aangebracht om de aanhechting van bepaalde celtypen te vergemakkelijken en voor andere toepassingen. Na deze procedure kunnen aanvullende inputs worden geïntegreerd, zoals microfluidica, celonderzoek of genetische manipulatie van specifieke eiwitten, om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe combinaties van stimuli het gedrag van individuele cellen en collectief celgedrag beïnvloeden?