Name: Plasma Lithografie Surface Patterning voor de schepping van Cell Networks (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Leer plasma lithografie om celnetwerken te creëren die natuurlijke weefsels nabootsen. Deze techniek maakt gestuurde celhechting mogelijk voor onderzoek naar gedrag en differentiatie van verschillende celtypen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content"&gt; Wij danken DD Zhang voor inzichtelijke discussie en royaal voorzien reagentia. MJ wordt ondersteund door de NIH Cardiovasculaire Training Grant, de Arizona Technology Research Initiative Fund, en Achievement Beloningen voor College wetenschappers. Dit werk wordt ondersteund door New Innovator Award van de NIH directeur (1DP2OD007161-01), de National Science Foundation (0.855.890) en de James S. McDonnell Foundation.</p

1. Creatie van mallen gebruikt voor patronen <ol><li> Conceptueel ontwerp van patronen. Patronen worden gecreëerd, die dienen om netwerken te vormen cel-, controle-cel contact, cellen te isoleren, natuurlijke structuren na te bootsen, of anderszins gids celadhesie en plaatsing. </li><li> Computer-aided design-of CAD-gebaseerde creatie van patronen en het creëren van fotomasker. Het gewenste patroon is ontworpen in CAD-software, zoals AutoCAD, en wordt vervolgens verstuurd naar een extern bedrijf voor het produceren van een fotomasker. </li><li> Fotolithografie de knie te krijgen patroon te produceren. Glazen dia's zijn patroon met ofwel een dunne positief weerstaan ​​of een dikke negatieve weerstand te bieden, afhankelijk van de grootte van de structuur wordt gecreëerd. Glazen dia's worden gebruikt voor hun voordelen van lage kosten, sterker dan silicium wafers en niet de productie van zo veel stof wanneer gebroken. Als alternatief kunnen andere handige structuren zoals diffractie roosters worden gebruikt als de master-patroon. </li><li> Het patroon slide is bevestigd aan een stapel dia's die niet zijn patroon. Alle stappen worden uitgevoerd in een schone stroom kap om stof te minimaliseren. </li><li> Creatie van meester schimmels. Een container van zilverpapier iets groter dan de stapel van dia's is gemaakt om de 30 g Polydimethylsiloxaan (PDMS), die vervolgens wordt uitgegoten over de photolithographically patroon oppervlak een eerste mal maken vast te houden. Het PDMS is ontgast en mag remedie voor een tot twee dagen. </li><li> Eenmaal genezen van de PDMS is afgepeld van de master-patroon en vormen een mal voor de volgende stap. </li><li> 6 g van de twee componenten epoxy (Devcon # 14310 (6 g) wordt gemengd gedurende 1 minuut en vervolgens uitgegoten in de master-mal, ontgast en toegestaan ​​om te genezen. Ontgassen van de epoxy moet snel gebeuren (&lt;8 min) met behulp van vele bubble breken cycli en met alleen een dun laagje voordat de epoxy sets en bel het verwijderen wordt het onmogelijk het verwijderen van de bubbels. De gebruikte 6 g geeft een dunne laag die snel bubble verwijderen vergemakkelijkt. </li><li> Na een uur, zullen de twee componenten epoxy gedeeltelijk te genezen en nog veel meer epoxy kunnen worden toegevoegd op de top, zonder ontgassing om een ​​dikkere structuur die is easer te verwerken in latere stappen te produceren. De epoxy is dan toegestaan ​​om genezing voor een tot twee dagen. </li><li> Eenmaal uitgehard, wordt de epoxy verwijderd uit de PDMS meester mal en tape is gewikkeld rond de epoxy mal om een ​​container te vormen. Een werkende mal wordt vervolgens gemaakt door het gieten van PDMS op de epoxy mal, het ontgassen van de PDMS, en uitharden voor een tot twee dagen. </li><li> Eenmaal uitgehard, wordt de werkende mal afgepeld van de epoxy en opgeslagen om netheid te behouden. </li></ol> 2. Patroonvorming van oppervlakken met mallen voor mobiele begeleiding <ol><li> Kleine delen van de arbeidersklasse schimmel zijn uitgesneden en geplaatst op een polystyreen petrischaal. De locaties van deze schimmel secties zijn gelabeld. </li><li> Een statief is gevormd uit de kleine afdelingen en gewogen om te conformal contact tussen de werkende mal en de petrischaal oppervlak te verkrijgen. Een goede plaatsing kan worden waargenomen door te kijken naar de bodem van de schotel. </li><li> De montage is geplaatst in het plasma kamer. Plasmabehandeling wordt gestart en voortgezet op 150 Pa bij 29,6 W (max. vermogen) gedurende 10 minuten met lucht plasma. </li><li> Na de plasma behandeling, zijn de matrijs en het gewicht voorgeleiding verwijderd. </li><li> De petrischaal is geplaatst onder UV-licht gedurende 10 minuten van de sterilisatie in de bioveiligheid kast en daar opgeslagen totdat gezaaid met cellen. </li></ol> 3. Zaaien oppervlakken met cellen <ol><li> SH-SY5Y CRL-2266 Human Neuroblastoom of andere cellen worden gekweekt met behulp van standaard protocollen voor het celtype. </li><li> De samenloop van de SH-SY5Y CRL-2266 Menselijke cellen Neuroblastoom is visueel gemeten vóór het zaaien op het patroon oppervlak. </li><li> Standaard cel splitsen wordt uitgevoerd om de cellen van het oppervlak van hun Petrischaal te verwijderen. </li><li> De cellen, een keer vrij zwevend, worden gezaaid op het oppervlak van het patroon petrischaal na zijn verdund tot de gewenste samenvloeiing bereiken wanneer geplaatst op de patroon oppervlak. </li><li> De cellen mogen vestigen en naar de oppervlakte te bevestigen. </li><li> Het patroon petrischaal wordt gedurende enkele uren tot enkele dagen, terwijl de cellen monteren op het patroon gecreëerd door het plasma. </li><li> Wanneer het kweken van de neuroblastoom cellen, retinoïnezuur (10 uM) wordt dagelijks toegevoegd om de cellen te induceren om te differentiëren in een neuron-achtige toestand. De toevoeging van de retinoïnezuur wordt gedaan in het donker. </li><li> Retinoïnezuur wordt dagelijks toegevoegd voor enkele dagen, waarna de differentiatie zal worden waargenomen. </li><li> Media is vervangen om de 3-4 dagen. </li></ol> 4. Observatie en analyse <ol><li> Periodieke beelden van de levende cellen of video's worden genomen om de cel gedrag te observeren in de tijd. Voor de live-beelden, zijn de cellen in een microscoop fase top incubator, die de cellen houdt bij 37 ° C, 100% vochtigheid, en 5% CO 2. Cellen kunnen ook worden gefixeerd en gekleurd voor observatie onder fluorescentie </li><li de beelden of video van cellen die zijn gevangen genomen worden ge in een beeldanalyse systeem en metingen uitgevoerd met inbegrip groei celgrootte migratie snelheid differentiatie afstemming locatie specifieke eiwitten anderen.></ol> 5. Representatieve resultaten: Een typisch resultaat van de uitvoering van de plasma-lithografie techniek is de vorming van een patroon van cellen die lijkt op sommige willekeurige of natuurlijke structuur. Dit is te zien in figuur 1a-b, waar lijnen en netwerken van neuronen zijn gemaakt. Andere celtypes gebruik kunnen worden gebruikt als te zien in figuur 1c-d, die de menselijke navelstreng endotheel cellen (HUVEC) en C2C12 skeletspiercellen de vorming van netwerken laat zien. Materialen zoals poly-L-lysine kan ook patroon, figuur 1e tot de bevestiging van bepaalde celtypes en voor andere doeleinden te vergemakkelijken. In het geval van de getoonde neuronen, wat was geschapen zijn netwerken van cellen die verbindingen tussen hen. Deze replica van wat er komt van nature in de hersenen waar de zenuwcellen hebben discrete verbindingen tussen naburige cellen die de werking van de hersenen beïnvloedt. Met de oprichting van een dergelijke structuur in het lab, kan het aantal, plaats, frequentie en andere factoren van de aansluitingen systematisch worden gecontroleerd. Het resultaat van deze arraignments kan visueel worden gemeten en extra ingangen, zoals chemische of elektrische stimulatie kan worden geïmplementeerd op het netwerk gedrag sonde. Een negatief resultaat zou een overwoekerd of onvolledige patroon of een besmet monster. Een onvolledige of overwoekerd patroon zou het gevolg zijn van het zaaien van het substraat met ofwel te weinig of te veel cellen die het patroon zou niet voorzien van een ideale hoeveelheid cellen. Bovendien, als het patroon is niet goed ontworpen (bijvoorbeeld, lijnen te smal), de cellen niet in staat te bevestigen en succesvol te groeien. In het geval van een besmette monster, zou een goede hygiëne niet zijn gehandhaafd tijdens een van de stappen hoewel dit zeldzaam is bij het volgen van de juiste celkweek-protocol te wijten aan het feit dat de plasma-patronen ook de ondergrond steriliseert. <img src="/files/ftp_upload/3115/3115fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Patterning van cellen en eiwitten.

<ol><li>Junkin, M., Watson, J., Vande Geest, J. P., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-Guided+Self-Assembly+of+Colloidal+Quantum+Dots+Using+Plasma+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Template-Guided Self-Assembly of Colloidal Quantum Dots Using Plasma Lithography.</a> Adv Mater. 21, 1247-1251 (2009).</li>
<li>Junkin, M., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cell+migration+in+confined+environments+by+plasma+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Probing cell migration in confined environments by plasma lithography.</a> Biomaterials. 32, 1848-1855 (2011).</li>
<li>Keyes, J., Junkin, M., Cappello, J., Wu, X., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaporation-induced+assembly+of+biomimetic+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Evaporation-induced assembly of biomimetic polypeptides.</a> Appl Phys Lett. 93, 023120-023 (2008).</li>
<li>Langowski, B. A., Uhrich, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+Plasma-Initiated+Patterning+%28%CE%BCPIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microscale Plasma-Initiated Patterning (μPIP).</a> Langmuir. 21, 10509-10514 (2005).</li>
<li>Tourovskaia, A., Barber, T., Wickes, B. T., Hirdes, D., Grin, B., Castner, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterns+of+Chemisorbed+Cell+Adhesion-Repellent+Films+Using+Oxygen+Plasma+Etching+and+Elastomeric+Masks%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Micropatterns of Chemisorbed Cell Adhesion-Repellent Films Using Oxygen Plasma Etching and Elastomeric Masks.</a> Langmuir. 19, 4754-4764 (2003).</li>
<li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li>
<li>Johansson, B. -L., Larsson, A., Ocklind, A., Ohrlund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Air+Plasma-Treated+Polymer+Surfaces+by+ESCA+and+Contact+Angle+Measurements+for+Optimization+of+Surface+Stability+and+Cell+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of Air Plasma-Treated Polymer Surfaces by ESCA and Contact Angle Measurements for Optimization of Surface Stability and Cell Growth.</a> Journal of Applied Polymer Science. 86, 26185-26185 (2002).</li>
<li>Murakami, T., Kuroda, S. -i, Osawa, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Polymeric+Solid+Surfaces+Treated+with+Oxygen+Plasma%3A+Effect+of+Aging+Media+after+Plasma+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Polymeric Solid Surfaces Treated with Oxygen Plasma: Effect of Aging Media after Plasma Treatment.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 202, 37-44 (1998).</li>
<li>Strobel, M., Lyons, C. S., Mittal, K. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrobel%2C+M+%22Plasma+surface+modification+of+polymers%3A+Relevance+to+adhesion%22">Plasma surface modification of polymers: Relevance to adhesion</a>. , VSP. Utrecht, Netherlands. (1994).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Materials+Science%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 37, 550-575 (1998).</li>
<li>Song, M., Uhrich, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+Micropattern+Dimensions+Enhance+Neurite+Outgrowth+Rates%2C+Lengths%2C+and+Orientations%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Optimal Micropattern Dimensions Enhance Neurite Outgrowth Rates, Lengths, and Orientations.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 1812-1820 (2007).</li>
<li>Zhao, F., Wu, T., Lau, A., Jiang, T., Huang, Z., Wang, X. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+promotes+neuronal+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nrf2 promotes neuronal cell differentiation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 47, 867-879 (2009).</li>
<li>Ohl, A., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-induced+chemical+micropatterning+for+cell+culturing+applications%3A+a+brief+review%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+and+Coatings+Technology%22%5BJournal%5D)">Plasma-induced chemical micropatterning for cell culturing applications: a brief review.</a> Surface and Coatings Technology. 116-119, 820-830 (1999).</li>
<li>van Kooten, T. G., Spijker, H. T., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-treated+polystyrene+surfaces%3A+model+surfaces+for+studying+cell-biomaterial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Plasma-treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions.</a> Biomaterials. 25, 1735-1747 (2004).</li>
<li>Loesberg, W. A., te Riet, J., van Delft, F., Schön, P., Figdor, C. G., Speller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+threshold+at+which+substrate+nanogroove+dimensions+may+influence+fibroblast+alignment+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion.</a> Biomaterials. 28, 3944-3951 (2007).</li>
</ol>

De cel onderzoeksmethode hier gepresenteerde kunnen maken van complexe patronen van meercellig netwerken die biologische structuren na te bootsen en biedt een methode om prikkels die zijn subcellulaire in de natuur die dan vergemakkelijkt onderzoek van zowel gegroepeerd cel gedrag en single cell reacties op omgevingsfactoren te produceren. Het gebruik van deze methode is eenvoudig maar toch robuust als het kan snel worden uitgevoerd met lage kosten apparatuur in hetzelfde lab als de cel cultuur. Het is ook sterk cel gevoelig, maakt een eenvoudige observatie van de resulterende gedrag en is van nature stabiel lange perioden, waarin onderzoek naar de lange termijn cel gedrag mogelijk maakt. Het staat bovendien voor een breed scala aan experimenten uit te voeren zoals het is compatibel met vele soorten cellen en kan creëren willekeurige patronen. De lange termijn stabiliteit van de techniek is afgeleid van het feit dat het oppervlak functionalisering bijgebracht door de plasma is een deel van het oppervlak en is geen coating of een andere laag die kan worden verwijderd of afgebroken. Indien bewaard onder vloeistof, kan dit type van wijziging behoudt zijn cel leiden mogelijkheid voor maand. Het meest kritische deel van het experiment noodzakelijk om zinvolle resultaten te waarborgen is dat het creëren van de master-patroon die uiteindelijk gebruikt zal worden voor mobiele begeleiding. Als dit patroon niet goed is ontworpen, zal cellen niet goed reageren op de patroon en kan mogelijk niet zinvol gedrag. Parameters, zoals de lijndikte, patroon afstand, en anderen kunnen grote invloed op de cel compatibiliteit met een bepaald patroon, en meestal een reeks van dergelijke parameters kunnen worden gemaakt op het eerste fotomasker om te screenen voor het meest geschikte ontwerp. Andere belangrijke parameters met betrekking tot het uitvoeren van patronen zijn schimmel creatie, het onderhouden van een stofvrije omgeving, cel seeding en algemene steriliteit van celkweek. Mold creatie kan worden uitgevoerd door de verschillende stappen die overschrijving worden ondernomen om te zorgen voor herhaalde PDMS afkanten een epoxy mal. De epoxy mal is gemaakt, omdat het niet zal worden afgebroken in de dezelfde manier als een mal verzetten met kleine, high aspect ratio structuren onder herhaalde gieten. Indien de overdracht spuitgieten is dit juist gebeurt, zal de afmetingen en de opbrengst niet worden aangetast maar als het verkeerd gedaan, zoals door slecht ontgassen, onvolledige genezen, of overmatige verhitting, bubbels, ruwheid en vervorming van een patroon kan optreden, die invloed op het uiteindelijke resultaat. Met betrekking tot het behoud van een stofvrije omgeving, moet de mallen worden gehouden zo schoon mogelijk als elke stof kunnen interfereren met de juiste contact tussen de werkende PDMS vorm en het oppervlak en daarmee een goede plasma afscherming en chemische patronen. Het zaaien dichtheid van de cellen ook moet worden geoptimaliseerd om ervoor te zorgen dat noch te weinig of te veel cellen van het patroon gebied bewonen en steriliteit moet worden gehandhaafd om bacteriën en andere verontreinigingen van de cellen wordt gebruikt te voorkomen. De techniek kan ook worden geïntegreerd met andere elementen, zoals microfluidics, micro-elektroden, en mechanische sondes. Dit zorgt voor extra prikkels om de cellen om beter te kunnen verschillende fysiologische omstandigheden repliceren tijdens het experimenteren en toekomstige werkzaamheden is gericht op het bestuderen van de effecten van deze combinaties

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Plasma Cleaner En vacuümkamer </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-001 </td><td></td></tr><tr><td> Omgekeerde fluorescentie en fasecontrastmicroscoop </td><td> Nikon </td><td> TE2000-U </td><td></td></tr><tr><td> Microscoop stadium top incubator </td><td> AmScope </td><td> Model TCS-100 </td><td> Aangepast aan een behuizing die een juiste sfeer leveringen omvatten </td></tr><tr><td> Polystyreen petrischaal </td><td> VWR </td><td> 25384-090 </td><td></td></tr><tr><td> Polydimethylsiloxaan (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> Epoxy </td><td> DevCon </td><td> 2 ton heldere epoxy # 14310 </td><td></td></tr><tr><td> Celcultuur media </td><td> Verschillende </td><td></td><td> Media volgt de standaard formuleringen voor celtype </td></tr><tr><td> Retinoïnezuur </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td></td></tr></tbody></table>

plasma lithografie surface patterning voor de schepping van cell networks

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematische manipulatie van een cel micro-omgeving met micro-en nanoschaal resolutie is vaak nodig voor het ontcijferen van de verschillende cellulaire en moleculaire fenomenen. Om aan deze eis, hebben we een plasma lithografie techniek om de cellulaire micro-omgeving te manipuleren door het creëren van een patroon oppervlak met functie maten variërend van 100 nm tot millimeter. Het doel van deze techniek is om te kunnen studeren, op een gecontroleerde manier, het gedrag van individuele cellen als groepen van cellen en hun interacties. Deze plasma lithografie methode is gebaseerd op de selectieve wijziging van de oppervlakte chemie op een substraat door middel van het afschermen van het contact van een lage-temperatuur plasma met een lichamelijke mal. Deze selectieve afscherming laat een chemische patroon dat celhechting en beweging kunnen begeleiden. Dit patroon, of het oppervlak sjabloon, kan vervolgens worden gebruikt om de netwerken van cellen waarvan de structuur kan nabootsen, dat in de natuur gevonden en produceert een controleerbare omgeving voor experimenteel onderzoek te creëren. De techniek is zeer geschikt voor het bestuderen van biologisch fenomeen als het produceert stabiel oppervlak patronen op transparante polymere substraten in een biocompatibele manier. Het oppervlak patronen duurt weken tot maanden en kan zo leiden interactie met de cellen voor lange perioden waarin de studie van de lange termijn cellulaire processen, zoals differentiatie en aanpassing mogelijk maakt. De wijziging van het oppervlak is vooral chemische stof in de natuur en dus doet topografische of fysieke storing niet te voeren voor de interpretatie van de resultaten. Het maakt ook niet tot een agressieve of giftige stoffen om patronen te bereiken en geschikt is voor de weefselkweek. Bovendien kan het worden toegepast op verschillende soorten van polymère substraten, die als gevolg van de mogelijkheid om hun eigendommen af ​​te stemmen zijn ideaal voor en worden veel gebruikt in biologische toepassingen te wijzigen. De resolutie haalbaar is ook goed, als isolatie van specifieke processen, zoals migratie, adhesie, of bindend zorgt voor discrete, heldere waarnemingen aan het single multi-niveau. Deze methode is gebruikt om diverse netwerken van de verschillende celtypen vormen voor het onderzoek met betrekking tot migratie, signalering, weefsel en de vorming van het gedrag en de interacties van neuronen aangeklaagd in een netwerk.

Een veelzijdige plasma lithografie techniek is ontwikkeld om stabiel oppervlak patronen te genereren voor de begeleiding van cellulaire bevestiging. Deze techniek kan toegepast worden op mobiele netwerken, inclusief degenen die natuurlijke weefsels na te bootsen en is gebruikt voor het bestuderen van meerdere, verschillende celtypes te creëren.

Plasma Lithografie Surface Patterning voor de schepping van Cell Networks

Systematische manipulatie van een celmicro-omgeving met micro- en nanometerschaal-resolutie is vaak vereist voor het ontrafelen van diverse cellulaire en moleculaire...

Het algemene doel van het volgende experiment is het creëren van cellulaire micro-omgevingen om biologische vraagstukken te bestuderen met betrekking tot individueel en collectief celgedrag dat plaatsvindt op micro- en nanoschaal. Dit wordt bereikt door eerst templates te ontwerpen die uiteindelijk de plaatsing van cellen zullen sturen. Vervolgens worden deze ontwerpen via fotolithografie vertaald naar patroonoppervlakken, wat de creatie van plasma-afschermingsmallen via soft-lithografie mogelijk maakt.Ten slotte worden deze afschermmalen als een driepoot in een Petrischaal geplaatst om selectieve blootstelling van de onderliggende oppervlakken aan plasma mogelijk te maken, waardoor er op de gebieden onder elke mal een celgevoelig chemisch patroon ontstaat. Hiermee kunnen resultaten worden verkregen die aantonen hoe het gedrag van een cel afhangt van de micro-omgeving en de interactie met naburige cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de effecten van micro-omgevingen op het celgedrag, zoals de vraag hoe interacties tussen groepen cellen invloed hebben op fenomenen van hogere orde.En hoe beïnvloeden subcellulaire cues op nanoschaal functies zoals gezonde migratie en differentiatie? Gebruik eerst secondelijm om een patroonglasplaatje aan een stapel lege objectglazen te bevestigen. Maak vervolgens een bakje van aluminiumfolie dat iets groter is dan de stapel glasplaatjes en groot genoeg is om 30 gram polydimethylsiloxaan of PDMS te bevatten.Plaats de stapel objectglazen in de houder en giet vervolgens PDMS over de stapel objectglazen om een initiële mal te maken. Ontgas het PDMS door de houder in een vacuümkamer te plaatsen. Verwijder eventuele luchtbellen in het PDMS door een vinger meerdere keren snel van en op de slang van de inlaatklep te plaatsen, zodat er kortstondig lucht de kamer in kan stromen.Het ventiel wordt vijf minuten gesloten voor ononderbroken ontgassing. Laat het PDMS vervolgens één tot twee dagen uitharden in de cleanflow-kast bij kamertemperatuur. Zodra het is uitgehard, wordt het PDMS van het masterpatroon afgepeld, waardoor er een mal ontstaat.Giet vervolgens een dunne laag van zes gram twee-componenten epoxy, die zojuist gedurende één minuut is gemengd, in de mastermal. Ontgas de epoxy onmiddellijk met behulp van meerdere bellenbrekende cycli voordat de epoxy uithardt. Nadat de ontgaste epoxy een uur ongestoord heeft kunnen rusten, zal deze gedeeltelijk uitgehard zijn.Voeg meer epoxy toe aan de mal zonder te ontgassen om een dikkere structuur te verkrijgen die in latere stappen gemakkelijker hanteerbaar is. Laat de epoxy vervolgens één tot twee dagen uitharden. Zodra de epoxy-mal is uitgehard, wordt de epoxy uit de PDMS-moedermal verwijderd en wordt er tape om de epoxy-mal gewikkeld om een houder te vormen.Een werkmal kan vervolgens worden gemaakt door PDMS op de epoxy-mal te gieten, het PDMS te ontgassen en de nieuwe mal één tot twee dagen te laten uitharden. Zodra de werkmal is uitgehard, wordt de mal van de epoxy gepeld en worden beide in petrischalen in een afgesloten plastic container in de laminaire flowkast bewaard om de reinheid te waarborgen. Om een mal voor oppervlaktepatronering voor te bereiden, worden kleine secties van de werkmal met een scheermesje uitgesneden en in een petrischaal geplaatst.De posities van deze malsecties worden op de achterzijde van de Petrischaal gemarkeerd met een watervaste stift door een omtrek te tekenen rond de plek waar de malsecties liggen; vorm een driepoot met de secties en laat de driepoot rusten om een conform contact tussen de werkmal en het oppervlak van de Petrischaal te garanderen. Bekijk de bodem van de schaal om een goede plaatsing te bevestigen, wat blijkt uit de aanwezigheid van kanalen die met het blote oog of met een kleine vergrootglas zichtbaar zijn. Plaats de assemblage in een plasmakamer.Start de plasmabehandeling na de plasmabehandeling. Verwijder de mal en de gewichtenopstelling en plaats de Petrischaal gedurende 10 minuten onder UV-licht in een veiligheidskast voor sterilisatie. Bewaar de schaal daar totdat deze met cellen wordt gezaaid.Verdun de gekozen experimentele cellen in hun standaard kweekmedium om de gewenste confluentie te bereiken. Giet drie milliliters van de celoplossing in de gepatroonde Petrischaal zodra deze op het oppervlak is geplaatst. Incubeer de gepatroonde Petrischaal bij 37 °C, 5% CO2 en 100% vochtigheid gedurende enkele uren tot enkele dagen om de cellen toe te staan zich te assembleren op het patroon dat door de plasmacel is gecreëerd.Het patroon wordt gecontroleerd met fasecontrastmicroscopie. Voeg bij het kweken van neuroblastoomcellen dagelijks 10 micromolair retinoïnezuur toe totdat celdifferentiatie naar een neuron-achtige status wordt waargenomen. Vervang het standaard celkweekmedium elke drie tot vier dagen.Een typisch resultaat van de implementatie van de plasmalithografietechniek is de vorming van een celpatroon dat lijkt op een willekeurige of natuurlijke structuur. Een voorbeeld hiervan is hier in deze figuur te zien met neuronen die zijn gedifferentieerd met retinoïnezuur op een patroon van lijnen. En hier in deze figuur, waar lijnen en netwerken van neuronen zijn gecreëerd; andere celtypen dan neuronen kunnen ook worden gebruikt, zoals te zien is in de volgende twee figuren: deze figuur toont endotheelcellen van de menselijke navelstrengvene en deze figuur toont C2C12 skeletspiercellen die rasters vormen, zoals hier te zien is.Materialen zoals polylysine kunnen ook in patronen worden aangebracht om de hechting van bepaalde celtypen te vergemakkelijken en voor andere toepassingen. Na deze procedure kunnen aanvullende elementen worden geïntegreerd, zoals microfluidica, celonderzoek of genetische manipulatie van specifieke eiwitten, om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals op welke wijze combinaties van stimuli het gedrag van individuele cellen en cellen in hogere orde beïnvloeden.

plasma-lithography-surface-patterning-for-creation-of-cell-networks

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Zelf-geassembleerde monolagen (SAM) gevormd uit lange keten alkaan thiolen op goud bieden goed gedefinieerde substraten voor de vorming van eiwit patronen en cel opsluiting. Microcontact printen van hexadecanethiol met behulp van een polydimethylsiloxaan (PDMS), stempel, gevolgd door opvulling met een glycol-beëindigde alkaan thiol monomeer produceert een patroon waarbij eiwitten en cellen adsorberen alleen aan de gestempelde hexadecanethiol regio.

Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

In dit protocol demonstreren we de fabricage van biomimetische hartcelcultuursubstraten gemaakt van twee verschillende polymere materialen met behulp van capillaire krachtlitografie.  De beschreven methoden bieden een schaalbare, kosteneffectieve techniek om de structuur en functie van macroscopische hartweefsels voor in vitro en in vivo toepassingen te ontwerpen.

Capillaire Force Lithografie voor Cardiac Tissue Engineering

Dit protocol beschrijft een microfabrication-compatible methode voor cel-patroon op SiO 2. Een vooraf gedefinieerde Parylene-C ontwerp wordt fotolithografische gedrukt op SiO 2 wafels. Na incubatie met serum (of andere activering oplossing) cellen specifiek hechten aan (en te groeien volgens de conformiteit van) onderliggende parylene-C, terwijl wordt afgestoten door SiO 2 regio's.

Cel Patterning op fotolithografisch Defined Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrates

Protocollen voor enkel neuron microfluïdische arraying en water maskeren voor de in-chip plasma patroonvorming van biomateriaal coatings worden beschreven. Sterk verbonden co-culturen kan worden bereid met minimale cel ingangen.

Voorbereiding van Neuronale Co-culturen met Single Cell Precision

Dit protocol beschrijft een bioprinting-methodologie met behulp van een geautomatiseerd robotsysteem voor het afzetten dat geëtste topografische geleidingssignalen combineert met de nauwkeurige afzetting van een hydrogel bio-inkt dat cellen bevat. De gedrukte cellen worden direct afgeleverd bij de geëtste kenmerken en kunnen deze waarnemen en er zich op oriënteren.

Geautomatiseerde Robotic Dispensing Techniek voor Surface Oriëntatie- en Bioprinting van Cellen

Een protocol voor het produceren van een groot gebied van nanogepatterreerde substraten uit kleine nanogepatterreerde mallen voor studie van nanotopografische modulatie van celgedrag wordt gepresenteerd.

Uitbreiding van nanopatterned Substrates met steek Techniek voor Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Dit rapport beschrijft een eenvoudige, gemakkelijk uit te voeren techniek, met behulp van lagedrukvacuüm, om microfluïdische kanalen te vullen met cellen en substraten voor biologisch onderzoek.

Een veelzijdige methode van patroonvorming Eiwitten en cellen

Hier presenteren we een protocol voor wide area scannen sonde nanolithography ingeschakeld door de iteratieve uitlijning van sonde arrays, evenals het gebruik van de lithografische patronen voor celoppervlak interactie studies.

Grote terrein Scanning Probe Nanolithography vergemakkelijkt door automatische uitlijning en de toepassing ervan op substraat Fabrication voor cel Cultuurwetenschappen

Dit protocol introduceert een lithografievrije micropatroonmethode die eenvoudig en toegankelijk is voor mensen met een beperkte bio-engineeringachtergrond. Deze methode maakt gebruik van aangepaste laser-cut stencils om micropatroon extracellulaire matrix eiwitten in een vorm van belang voor het moduleren van cel morfologieën. De procedure voor micropatterning wordt aangetoond met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten.

Eenvoudige lithografie-vrije single cell micropatterning met behulp van Laser-Cut Stencils

Het hier gepresenteerde protocol maakt geautomatiseerde fabricage van micropatterns mogelijk die de celvorm standaardiseert om cytoskeletstructuren in zoogdiercellen te bestuderen. Deze gebruiksvriendelijke techniek kan worden opgezet met in de handel verkrijgbaar beeldvormingssystemen en vereist geen gespecialiseerde apparatuur die niet toegankelijk is voor standaard celbiologielaboratoria.

Controle van celgeometrie door infrarood laserondersteunde micropatterning

Traditioneel wordt celkweek uitgevoerd op vlakke substraten die de natuurlijke omgeving van cellen in vivo slecht nabootsen. Hier beschrijven we een methode om celkweeksubstraten te produceren met fysiologisch relevante gebogen geometrieën en micropatterned extracellulaire eiwitten, waardoor systematisch onderzoek naar cellulaire detectie van deze extracellulaire signalen mogelijk is.

Generatie van multicue cellulaire micro-omgevingen door UV-fotopatterning van driedimensionale celcultuursubstraten

Leer plasma lithografie om celnetwerken te creëren die natuurlijke weefsels nabootsen. Deze techniek maakt gestuurde celhechting mogelijk voor onderzoek naar gedrag en differentiatie van verschillende celtypen.

Plasma Lithografie Surface Patterning voor de schepping van Cell Networks

Meer video's verkennen