Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells into Neural Progenitor Cells
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 4:22 min • July 8th, 2025
Take a microplate containing an adherent culture of mouse embryonic fibroblasts, or MEFs, in a medium.
The adhered MEFs function as a feeder layer, providing a supportive cell culture microenvironment.
Remove the medium and introduce human induced pluripotent stem cells, or hiPSCs, in an hiPSC medium supplemented with small molecules that enhance cell survival.
Incubate to allow hiPSCs to adhere to the feeder layer, which secretes growth factors that facilitate hiPSC proliferation.
Remove the medium and add an enzyme solution to detach the cells. Transfer the cells and centrifuge them, then remove the supernatant and resuspend them in the hiPSC medium.
Transfer the cells to a biopolymer-coated plate. Incubate to allow the MEFs to adhere.
Transfer the suspended hiPSCs to a V-bottom microplate. Centrifuge the cells and incubate them, inducing cell aggregate formation.
Replenish with a differentiation medium. The medium's nutrients and cell-cell interactions within the aggregate facilitate hiPSC differentiation into neural progenitor cells.
For this protocol, begin with establishing feeder cells. To establish this culture, plate 600,000 feeder cells into each well of a six-well plate, with 300 milliliters of medium per well. After culturing the feeder cells for 48 hours, replace the medium, and incubate the plates for an hour, while preparing the stem cells.
Thaw the stem cells in a 37 degrees Celsius water bath. Once thawed, transfer the cells to a 15-milliliter conical tube and fill the tube to 5 milliliters with culture medium, added dropwise. Next, gently centrifuge the cells for four minutes. Aspirate the supernatant, and gently resuspend the pellet in 1 milliliter of stem cell medium with ROCK inhibitor.
After quantifying the cell density, plate 300,000 stem cells onto the feeder cells. Then, grow and expand the cultures, periodically selecting for healthy cells. After expansion and freezing cells for backup, grow the stem cells' colonies on standard plates until they reach 50% to 70% confluence.
Then, use a mild enzymatic treatment and gentle titration with a 1-milliliter pipette tip to harvest the HIPSCs for neural precursor cell differentiation. Gently centrifuge the suspension, aspirate the supernatant, and resuspend the pellet in 5 milliliters human iPSC medium. Then, transfer the cell suspension to a 0.1% gelatin-coated 5-centimeter cell culture dish, and incubate the plate for one hour.
After an hour, transfer the non-adherent cells to a 15-milliliter centrifuge tube. Then, gently rinse the plate with 3 milliliters of medium, and transfer it to the same tube. Next, repeat the resuspension step with gentle centrifugation.
Then, determine the cell density and plate the cells into a 96-well, low-adhesion V-bottom plate at 9,000 cells per well. Now, spin the plate for three minutes and start culturing the cells. Over the next 14 days, every other day, replace half the medium with fresh differentiating medium one.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het differentiëren van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) naar neurale progenitorcellen met behulp van embryonale fibroblasten van muizen (MEFs) als feederlaag. Het proces omvat verschillende stappen, waaronder celkweek, detachering en incubatie om celaggregatie en differentiatie te bevorderen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Stamcelbiologie
- Neurowetenschappen
- Celkweektechnieken
Achtergrond
- hiPSCs hebben het potentieel om te differentiëren in diverse celtypen.
- MEF's bieden een ondersteunende omgeving voor de groei van stamcellen.
- Celaggregatie is cruciaal voor het bevorderen van differentiatie.
- Het begrijpen van differentiatieroutes is essentieel voor de regeneratieve geneeskunde.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode vast te stellen voor het differentiëren van hiPSCs naar neurale progenitorcellen.
- Om MEF's te gebruiken als feederlaag om de overleving en proliferatie van cellen te verbeteren.
- Om de effecten van kweekcondities op de differentiatie van stamcellen te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Kweek van MEF's in een plaat met zes putjes.
- Ontdooien en uitplaten van hiPSC's op de MEF-feederlaag.
- Induceren van celaggregatie in een V-bodem microplaat.
- Aanvullen van het medium met differentiatiefactoren om de vorming van neurale progenitorcellen te bevorderen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vestiging van een feederlaag voor hiPSC-kweek.
- Efficiënte differentiatie van hiPSC's naar neurale progenitorcellen is waargenomen.
- Celaggregatie was cruciaal voor het verbeteren van de differentiatieresultaten.
- Optimale kweekcondities zijn geïdentificeerd voor de groei en differentiatie van stamcellen.
Conclusies
- Het protocol biedt een robuuste methode voor het genereren van neurale progenitorcellen uit hiPSCs.
- MEF's dienen als een effectieve feederlaag ter ondersteuning van de stamcelkweek.
- Verdere studies kunnen de toepassingen van gedifferentieerde cellen in onderzoek en therapie verkennen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De differentiatie van hiPSCs tot neurale progenitorcellen maakt mechanische risicoreductie mogelijk bij vroege targetvalidatie in de neurowetenschappen door een mensrelevant, schaalbaar systeem te bieden voor het onderzoeken van signaalpaden. Deze benadering versterkt het voorspellend vertrouwen bij de identificatie van lead-candidates door neurodevelopmentale mechanismen in een fysiologische context te modelleren. Dit pakt een cruciaal omslagpunt in het ontdekkingsproces aan, waarbij biologische relevantie en de reproduceerbaarheid van assays van invloed zijn op beslissingen over de triage van de portfolio.
Strategische Toepassingen in Biofarma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken in een neuraal systeem van menselijke oorsprong om target-interactie en padmodulatie te verduidelijken.
- Operationele waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit door gestandaardiseerde differentiatie van hiPSCs naar NPC's met behulp van gedefinieerde feeder-lagen en aggregatiestappen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt preklinische risicoreductie door ziekterelevante neurale cellen te genereren voor target-validatie voorafgaand aan lead-optimalisatie.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert schaalbare, reproduceerbare aggregaten van neurale progenitorcellen die geschikt zijn voor compound screening in V-bodem microplaten.
- Operationele waarde: Vestigt een serumvrije, feeder-onafhankelijke aggregatiestap die de standaardisatie van de assay verbetert en variabiliteit minimaliseert.
- Klaar voor assay: Maakt kwantitatieve read-outs van differentiatie-efficiëntie en markerexpressie mogelijk voor integratie in screeningcampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Slaat een brug van discovery naar prekliniek door menselijke neurale cellen te genereren met potentieel voor ziekte-modellering voor target-validatie.
- Mechanistische risicoreductie: Biedt een menselijk relevant systeem om de modulatie van target-pathways en de fenotypische respons in de vroege discovery-fase te beoordelen.
- Continuïteit: Ondersteunt longitudinale beoordeling vanaf NPC-differentiatie tot downstream neuronale rijping voor predictieve modellering.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot lead-identificatie door het leveren van een schaalbaar, menselijk neuraal systeem voor mechanistische en fenotypische screening.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en padverduidelijking via gerichte differentiatie van hiPSCs naar NPCs met behulp van gedefinieerde aggregatie en mediumwisseling.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk door reproduceerbare aggregaatvorming in V-bodemplaten met lage adhesie met een gedefinieerd differentiatiemedium.
- Analytics: Faciliteert kwantitatieve meting van neurale markerexpressie en differentiatie-efficiëntie als functionele read-outs.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door menselijke neurale cellen te genereren die toepasbaar zijn voor ziekte-modellering en targetvalidatie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een schaalbaar, feeder-ondersteund differentiatieplatform dat toepasbaar is op meerdere neuroscience-targets en projecten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door de generatie van menselijk relevante neurale progenitorcellen en een verminderd risico op translatieverschillen tussen soorten.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde stappen voor het verwijderen van de feederlaag, aggregatie en differentiatie.
- Strategische waarde: Ondersteunt betere go/no-go-beslissingen door een vroege beoordeling van target-effecten in een menselijke neurale context mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk door mechanische risicoreductie en voorspellende modellering binnen de neurowetenschappelijke discovery.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, beheer van feederlagen en neurale differentiatietechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot biopolymeer-gecoate en low-adhesion V-bottom platen voor aggregaatvorming.
- Necessiteert cross-team standaardisatie van het differentiatiemedium en de timing voor een reproduceerbare NPC-opbrengst.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het opschalen van 96-well platen naar grotere formaten voor screening-applicaties.
- Beperkt door de differentiatieperiode van 14 dagen en de frequentie van mediumverversingen, wat de planning van de doorvoercapaciteit beïnvloedt.
Veelgestelde vragen over Biofarmaceutica
Chondrogenische Pelletvorming van Koord Bloed afgeleide geïnduceerde Pluripotente Stamcellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment met Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Generatie van menselijke neuronen en oligodendrocyten uit pluripotente stamcellen voor het modelleren van neuron-oligodendrocyteninteracties
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Snelle en efficiënte generatie van de neuronen van menselijke pluripotente stamcellen in een Multititre Plate Format
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Differentiating Human Embryonic Stem Cells into Neural Progenitors
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Differentiating Non-Transgenic and Transgenic Human Pluripotent Stem Cells into Neural Progenitor Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Differentiating Induced Neural Progenitor Cells into Astrocytes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neurons
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Direct Inductie van Human neurale stamcellen uit perifeer bloed hematopoïetische voorlopercellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026