Inducing Axonal Varicosities with a Micromechanical Stimulus on Neurons
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 3:04 min • July 8th, 2025
Begin by securing a micropipette with attached tubing to a micromanipulator.
Attach the other end of the tubing to a syringe filled with a salt buffer via a connector with a turnable valve.
Set the syringe at a height that provides sufficient pressure to induce varicosities in axons.
Axonal varicosities are bead-like swellings that occur along the length of an axon.
Position the micropipette at the desired angle relative to the culture dish.
Use fluorescent light from the microscope to align the micropipette tip and lower it near the surface of the cell culture dish containing salt buffer.
Now, turn on the transmitted light and turn off the fluorescent filter.
Place a coverslip with neurons onto the dish.
First, focus on the micropipette and adjust its position.
Then, focus on the region containing the target neurons.
Open the valve to apply fluid pressure. This micromechanical stimulus induces varicosities in these neurons.
In this procedure, insert the pipette into the screw top of the micromanipulator to hold it into place. Angle the pipette at a 45-degree angle with the surface to the cell culture dish. Turn on the fluorescence filter. Open the aperture, and ensure a fluorescent spot can be seen coming through the objective.
Using the micromanipulator, move the pipette into a position that lines up the tip with the fluorescent spot, and lower the pipette into a position just above the height of the cell culture dish. Once it is in position, turn on the transmitted light and turn off the fluorescence. Using tweezers, transfer one coverslip with the cells facing toward the pipette from the cell culture plate to the cell culture dish containing 2 milliliters of Hank's buffer at room temperature.
Using the fine focus knob and 20-fold objective, focus on a plane about four full turns above the cells. Subsequently, use the micromanipulator to position the pipette tip so that it is focused and in the center left-hand side of the plane, as seen through the eyepieces. Once the pipette is in position, focus the microscope on a plane that contains the region of interest.
In the imaging of 7DIV, GFP-transfected mouse hippocampal neurons showed an axon pre- and post-puffing.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode om axonale varicositeiten in neuronen op te wekken met behulp van een micropipet en vloeistofdruk. De procedure omvat de precieze positionering van de micropipet en het aanbrengen van een zoutbuffer om de neuronen te stimuleren.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Micromanipulatietechnieken
Achtergrond
- Axonale varicositeiten zijn kraalachtige zwellingen langs axonen.
- Het induceren van varicositeiten kan helpen bij het bestuderen van neuronale functies en connectiviteit.
- Micropipet-technieken worden veelvuldig gebruikt in de neurobiologie.
- Fluorescente beeldvorming helpt bij het visualiseren van neuronale structuren.
Doel van de studie
- Om een methode aan te tonen voor het induceren van axonale varicositeiten in gecultiveerde neuronen.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers in de neurowetenschappen.
- Om het begrip van de neuronale morfologie en het gedrag te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Het bevestigen van een micropipet aan een micromanipulator.
- Het verbinden van de micropipet met een spuit gevuld met zoutbuffer.
- Het positioneren van de micropipet onder een specifieke hoek ten opzichte van de kweekschaal.
- Het uitoefenen van vloeistofdruk om varicositeiten in neuronen te induceren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle inductie van axonale varicositeiten in hippocampale neuronen van muizen.
- Fluorescentie-imaging bevestigde de aanwezigheid van varicositeiten.
- De methode bleek reproduceerbaar in neuronale culturen.
- Bood inzichten in de mechanische stimulatie van neuronen.
Conclusies
- De beschreven methode is effectief voor het bestuderen van axonale varicositeiten.
- Manipulatie met micropipetten is een waardevol instrument in neurowetenschappelijk onderzoek.
- Verdere studies kunnen de functionele implicaties van geïnduceerde varicositeiten onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Modellen van mechanisch geïnduceerde axonale varicositeiten stellen biofarmaceutische teams in staat om de neuronale respons op fysieke stress te onderzoeken, wat vroege targetvalidatie bij onderzoek naar neurodegeneratie en letsel ondersteunt. Kwantitatieve inductie en visualisatie van varicositeiten bieden een gecontroleerd systeem voor het evalueren van neuronale kwetsbaarheid en veerkracht, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid van ziekterelateerde pathways. Deze aanpak versterkt de mechanistische risicoreductie op het kantelpunt van de ontdekking voor activa in het CZS-portfolio.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe toetsing mogelijk van de neuronale gevoeligheid voor mechanische stressfactoren die relevant zijn voor aandoeningen van het centrale zenuwstelsel.
- Ondersteunt functionele validatie van targets door fysieke stimuli te koppelen aan axonale pathologie.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door acute neuronale beschadiging in vitro te modelleren.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een reproduceerbaar systeem voor het induceren en kwantificeren van axonale varicositeiten in gekweekte neuronen.
- Standaardiseert de inductie van neuronale fenotypes voor downstream compound screening.
- Maakt kwantitatieve imaging-outputs mogelijk voor assay-ontwikkeling en -optimalisatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Komt overeen met ziekterelevante modellen van axonale beschadiging en neurodegeneratie.
- Ondersteunt de continuïteit van in vitro mechanistische studies naar de preklinische validatie van neuroprotectieve strategieën.
- Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen voor de verdere ontwikkeling van therapeutica gericht op het centraal zenuwstelsel.
Integratie van pipeline en workflow
Deze micromechanische inductiemethode past binnen het continuüm van vroege ontdekking tot identificatie van lead-verbindingen voor onderzoek naar het CZS, en biedt een platform voor hypothesetoetsing en fenotypische screening.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothese-gestuurd onderzoek mogelijk naar de axonale respons op mechanische stress.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare inductie van varicositeiten voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytica: Ondersteunt kwantitatieve beeldvorming en meting van neuronale fenotypes.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische modellen van axonale pathologie.
- Zakelijk hergebruik: Biedt een herbruikbare workflow voor diverse neurobiologische en neurotoxicologische studies.
Operationele & Ondernemingsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in mechanismen van neuronaal letsel en doelvalidatie.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van assays voor neuronale stress.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen voor de voortgang van CNS-middelen door mechanisch risico te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van neuroprotectieve en neuroregeneratieve kandidaten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in neuronale kweek, micromanipulatie en fluorescentie-imaging.
- Vereist toegang tot micromanipulatoren, micropipetten en imaging-infrastructuur.
- Vereist standaardisatie van stimulusparameters en imaging-protocollen tussen teams.
- Aanpasbaar aan diverse neuronale subtypen en kweeksystemen via protocoloptimalisatie.
- Beperkt tot in vitro modellering; translationele relevantie is afhankelijk van de afstemming met ziektemechanismen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een eenvoudige neurologische mechanische letselmethode om te bestuderen Drosophila Motor Neuron Degeneration
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Morfologische en functionele evaluatie van Axons en hun Synapsen tijdens Axon Death in Drosophila melanogaster
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Bekijk de historische en fysiologie demonstratie op het NMJ van de rivierkreeft Opener Muscle
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Mechanische Manipulatie van Neuronen om axonale Development Controle
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Fysiologische, morfologische en neurochemische Karakterisering van neuronen gemoduleerd door Movement
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Vibrodissociation van de neuronen van knaagdieren Brain Slices synaptische transmissie en Image presynaptische Terminals Study
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Bacteriële Immobilisatie for Imaging door Atomic Force Microscopy
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Externe excitatie van neuronen Met behulp van elektrische en magnetische velden in een-en twee-dimensionale culturen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Rewiring Neuronal Circuits: een nieuwe methode voor snelle neuritische verlenging en functionele neuronale verbinding
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026