Installation of Optical Windows in the Brain of Transgenic Mice to Image Neural Activities
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 4:49 min • July 8th, 2025
Begin with an anesthetized, genetically altered mouse with its head secured in a head-holding adaptor.
The mouse brain expresses a fluorescent protein that enables the detection of neural activities.
Shave and sequentially sterilize the scalp before cutting it open.
Remove connective tissue to expose the skull.
Mark the target areas and apply a layer of glue.
Use a microdrill to thin the skull on the marked area.
Remove the piece of the skull to expose the brain.
Apply artificial cerebrospinal fluid to keep the brain moist.
Install an optical window in the area and seal it with glue, which provides a base for the cement attachment.
Apply black dental cement to block the light.
Repeat the procedure on the other side of the skull.
Allow the animal to recover.
To image neural activity, place the secured anesthetized mouse under the microscope and acquire images.
Confirm a lack of response to toe pinch on an anesthetized 20 to 25 gram, 1 and 1/2 to 2 and 1/2-month-old Thy1-GCaMP6s mouse and apply ointment to the animal's eyes. Place the mouse on a heating pad covered with a sterile drape, and use a head-holding adapter for mice to stabilize the head. Shave most of the scalp with a double-edged razor, and clean the exposed skin with sequential sterile alcohol preparation pads and povidone-iodine solution scrubs. Then, use a pair of scissors to make a rectangular 2-by-3-millimeter cut in the scalp.
Using a cotton swab, push the skin aside to create an exposure area of greater than 3 millimeters in diameter, and use a blunt microsurgical blade to gently remove the connective tissue attached to the skull. With a dental drill, gently mark a 3-millimeter diameter circle around the S1 area. After making a similar circle on the left side of the skull, apply a thin layer of cyanoacrylate superglue to both sides of the bone to provide a base for dental cement application.
Under a dissecting microscope, use a high-speed micro-drill to thin down a circular groove in the right side of the skull around the S1 area to create a smooth edge, aspirating the bone debris with a vacuum as necessary. After an approximately 2/3rd bone depth has been achieved, slowly and carefully thin the remaining one-third of bone until a circular bone flap has been completely freed from the surrounding skull. Use a pair of # 5/45 forceps to slowly and carefully remove the circular piece of bone to expose the dura, taking care to avoid damaging the pial vessels.
After removing a bone flap from the left side of the skull in the same manner, rinse the optical window for the right side of the skull with sterile saline and check for imperfections under a stereomicroscope. Install the optical window over the craniotomy region with the top portion of the window resting on the skull and the bottom portion within the craniotomized opening, resting on the dura in the presence of cerebral spinal fluid. Use the cyanoacrylate super glue to seal the top portion of the optical window edge to the skull.
When the glue has dried, apply black dental cement to the edge of the glass, the rest of the right side of the exposed skull, and the wound margins to block the light. Then, install the left optical window and allow the animal to recover with monitoring until full recumbency. 7 to 10 days after the procedure, place the anesthetized animal into the head-holding adapter on a heating pad, under a two-photon microscope, taking care that the optical window and the right side of the skull are oriented perpendicular to the optical axis of the microscope.
Acquire an initial reference map image of the cranial window using brightfield illumination at the 4 times magnification. After acquiring multiple images of the same region of interest, image the calcium dynamics within the S1 area in the left hemisphere and calculate the changes in the fluorescence from each region of interest on both sides of the skull.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het in beeld brengen van neurale activiteit in genetisch gemodificeerde muizen met behulp van een tweefotonenmicroscoop. De procedure omvat het maken van een craniële window om directe observatie van de hersenactiviteit mogelijk te maken, terwijl de veiligheid en het comfort van het dier worden gewaarborgd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Beeldvormingstechnieken
- Diermodellen
Achtergrond
- Het begrijpen van neurale activiteit is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Genetisch gemodificeerde muizen bieden inzicht in specifieke neurale mechanismen.
- Tweefotonmicroscopie maakt resolutiebeelden van breinactiviteit met een hoge resolutie mogelijk.
- Correcte chirurgische technieken zijn essentieel voor succesvolle beeldvorming.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het in beeld brengen van neurale activiteit in levende muizen.
- Om het begrip van de hersenfunctie te verbeteren door middel van directe observatie.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers in dit vakgebied.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van de muis, inclusief anesthesie en stabilisatie van de kop.
- Chirurgische creatie van een craniële window voor beeldvorming.
- Toepassing van kunstmatig cerebrospinaal vocht om de gezondheid van de hersenen te behouden.
- Gebruik van tweefotonmicroscopie voor het verkrijgen van beelden van neurale activiteit.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van calciumnamiek in het S1-gebied van de hersenen.
- De haalbaarheid van de techniek met het schedervenster is aangetoond.
- Er is een referentiekaart opgeleverd voor toekomstige beeldvormingsstudies.
- De effectiviteit van de methode bij geanestheseerde muizen is bevestigd.
Conclusies
- De techniek van het schedelvenster is een waardevol instrument voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Deze methode maakt real-time observatie van neurale activiteit mogelijk.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op dit protocol om diverse neurale mechanismen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het vestigen van betrouwbare beeldvorming van neurale activiteit in transgene modellen ondersteunt de validatie van targets en het mechanistisch verminderen van risico's bij de ontdekking van geneesmiddelen voor het centrale zenuwstelsel. De techniek van het craniële venster maakt longitudinale, kwantitatieve monitoring van neuronale dynamiek mogelijk, waardoor het voorspellend vertrouwen in therapeutische hypothesen in een vroeg stadium wordt verbeterd. Deze aanpak vermindert biologische onzekerheid door directe, vertaalbare read-outs te bieden van target-interactie en modulatie van signaalpaden in ziekterelevante systemen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door real-time observatie van neurale activiteit in genetisch gedefinieerde circuits.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar platform voor functionele targetvalidatie met calciumflux als mechanistische readout.
- Strategische waarde: Ondersteunt voorspellend vertrouwen en portfolioselectie door targetmodulatie te koppelen aan meetbare fenotypische veranderingen in neurale netwerken.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op compound screening door neurale activiteitsmetingen in de tijd te stabiliseren.
- Operationele waarde: Standaardiseert beeldvormingscondities door schedelstabilisatie en lichtblokkerend cement, wat de reproduceerbaarheid van de assay verbetert.
- Strategische waarde: Maakt betrouwbare evaluatie van compounds mogelijk door omgevings- en procedurele variabiliteit in longitudinale studies te minimaliseren.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij ziekte-relevante systemen door beeldvorming mogelijk te maken in Thy1-GCaMP6s-muizen, een model voor neuronale exciteerbaarheid en netwerkfunctie.
- Operationele waarde: Waarborgt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via chronische stabiliteit van het venster en herhaalde beeldvormingssessies.
- Strategische waarde: Onderbouwt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door het leveren van kwantitatieve, longitudinale gegevens over target engagement en effecten op circuitniveau.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische werkzaamheidstesten, ondersteund door de capaciteit voor herhaalde, kwantitatieve metingen van neurale activiteit.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door directe observatie van calciumdynamiek mogelijk te maken als reactie op farmacologische of genetische perturbaties.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid en kwantitatieve resultaten door gestabiliseerde fluorescentie-baselines en tracking van region-of-interest over de hemisferen.
- Analytics: Genereert statistische output, zoals berekeningen van fluorescentieveranderingen, wat vergelijkingen tussen groepen en de bepaling van de effectgrootte mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit via longitudinale imaging-mogelijkheden en biomarker-afstemming met neuronale activiteitspatronen.
- Enterprise hergebruik: Fungeert als een herbruikbaar platform voor meerdere studiearmen, waardoor de opstartlast per experiment wordt verminderd en de consistentie tussen projecten wordt verbeterd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen, validatie van targets, vermindering van mechanistische ambiguïteit in CNS-routes.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over verschillende laboratoria en tijdspunten.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium bij neurotherapeutica.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van longitudinale neurale activiteitsprofielen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microchirurgie, anesthesiebeheer en het werken met transgene dieren.
- Is afhankelijk van precisie-instrumentarium, waaronder microboren, pincetten, stereomicroscopen en twee-foton-beeldvormingssystemen.
- Vereist standaardisatie van chirurgische protocollen, postoperatieve zorg en beeldvormingsparameters tussen teams.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan verschillende muizenstammen, leeftijden en genetische achtergronden om de integriteit van het venster en de signaalkwaliteit te behouden.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van chirurgische vaardigheden, risico's op postoperatieve ontsteking en de behoefte aan gespecialiseerde veterinaire en technische ondersteuning.
Veelgestelde vragen over biopharma
Imaging neurale activiteit in de primaire somatosensorische Cortex met behulp van Thy1-GCaMP6s transgene muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Visualisering van proteïne kinase een activiteit in hoofd-vaste muizen die in vivo twee-fotonen fluorescentie levensduur beeld microscopie gebruiken
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Multi-Fiber fotometrie om neurale activiteit op te nemen in vrij bewegende dieren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een gepolijste en gewapend verdund-schedel Venster voor de lange termijn beeldvorming van de hersenen van muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Spinal Cord Window Implantation in a Mouse for In Vivo Imaging
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Simultane twee-foton
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Optogenetische manipulatie van neuronale activiteit om gedrag te moduleren in vrij bewegende muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Craniotomie procedure voor het visualiseren van neuronale activiteiten in Hippocampus van zich gedragende muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026