Name: Subcutane toediening van muscarine antagonisten en Triple-Immunokleuring van de Levator Auris longus in Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Leer subcutane toediening van muscarine-antagonisten aan de levator auris longus bij muizen. Deze methode combineert triple-immunokleuring met confocale microscopie om morfologische veranderingen in neuromusculaire verbindingen te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door Vereniging voor Musculaire Dystrofie, NIH (NS062320).

1. Subcutane toediening van muscarine acetylcholine receptor (mAChR) antagonisten <ol><li> Bereiden onder aseptische omstandigheden de juiste dosis van mAChR antagonist, (cf. tabel) door het oplossen van het geneesmiddel in steriele fysiologische zoutoplossing in 1,5 ml reactie buis. De volgende antagonisten werden gebruikt: atropine, Methoctramine, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7. </li><li> Teken 50μl van de oplossing in a1cc insulinespuit en gebruik een aparte spuit voor elke muis. Ook voorbereiden spuiten met fysiologisch zout alleen voor elke muis in de controle groep. Blijven spuiten op ijs pas klaar om te injecteren. </li><li> Verdoven muizen met ketamine-xylazine cocktail (120 mg / kg ketamine, 8 mg / kg xylazine) Controleer voor de juiste verdoving diepte door het observeren van het gebrek aan reactie op knijpen teen. </li><li> Na een goede sedatie, scheren haar met betrekking tot de rostrale regio van het hoofd naar de caudale regio van de nek, veeg de resterende haar weg met 70% ethanol. </li><li> Plaats de muis onder stereomicroscoop, en steek de naald parallel aan LAL spieren tijdens het omhoog te trekken licht op de naald van de spuit (afb. 1A, B). Dit zorgt ervoor dat de naald wordt ingebracht in bovenliggende bindweefsel en niet direct schade aan de LAL spier zelf. Steek de naald, zodat het uiteinde dekt de caudale aspect van de LAL spier. </li><li> Heel langzaam beginnen te oplossing te injecteren in de juiste LAL spier, terwijl intrekking van de spuit, de totale injectie tijd moet ongeveer 1 minuut. Als dit goed wordt geïnjecteerd, moet de oplossing vormen een 'koepel', dat is ongeveer 1 cm in diameter, in de bovenliggende huid die zal blijven gedurende ten minste een uur. Een uniform geïnjecteerde oplossing betrekking op de gehele rostrale en caudale regio van de juiste LAL spier. </li><li> Herhaal de procedure om de 12 uur gedurende 1 tot 7 dagen. Voor andere studies1, gebruikten we hetzelfde protocol te injecteren groeifactoren elke 12 uur gedurende maximaal 21 dagen. Geen abnormale respons waargenomen van muizen toegediend met anesthesie 2x per dag gedurende maximaal 21 dagen. </li></ol> 2. Dissectie van LAL spieren <ol><li> Euthanaseren muizen met een overdosis natriumpentobarbital (390 mg / kg). De dood is verzekerd door beoordeling van het gebrek van de hartslag na een thoracotomie wordt uitgevoerd. </li><li> Vastpinnen de muis in een dissectie schaal-, rug-kant naar boven met een pin in elke poot en een pin door de neus. </li><li> Maak de eerste incisie door de huid alleen met behulp van kleine lente schaar te snijden langs de linkeroever LAL uit de regio net proximaal van het oor naar de regio rond de linker schouderblad. </li><li> Verwijder voorzichtig de huid in deze regio, maar vermijd het snijden te dicht bij de rechter oor als deze is een van de bevestigingspunten voor de juiste LAL spier. </li><li> Zoek de centraal geplaatste vetweefsel strook van lipide over de middellijn, op het oppervlakkige oppervlak van het hoofd, waar de rechter en linker LAL spieren te voldoen. Met behulp van kleine lente een schaar, knip 1 cm aan de rechterkant van het vetweefsel (in de richting van het linker oor) van de proximale rand van de linker LAL spier tot het bereiken van de schouder (Fig. 1C). </li><li> Nadat de incisie wordt gemaakt, schil de rug van de juiste LAL spier met kleine tang aan de ventrale zijde van de spier bloot te leggen. Trim het bindweefsel en de fascia terwijl zorgvuldig omhoog te trekken aan de rechterkant LAL spier met een pincet (Fig. 1C). </li><li> Snijd rond het caudale einde van de juiste LAL aan de basis van het oor. Blijven snijden, op weg naar de rostrale einde van het rechteroor, het bijhouden van de juiste LAL omgedraaid (afb. 1C).. Het is beter om meer weefsel ten deze stap is dan het risico beschadiging van de LAL zelf. Als de spier begint te drogen, pipet 1X PBS over de spier. </li><li> Plaats ontleed recht LAL in 30mm cultuur Sylgard schotel met 1X PBS-, rug-kant naar boven. Vastpinnen vier de hoeken van de spier met kleine insect pinnen. </li><li> Met kleine tang en de lente schaar, schone bindweefsel van de dorsale en ventrale oppervlak van de juiste LAL spier. Draai de spieren om en re-pin, om schoon te buikoppervlakte. 2-3 spieren kunnen worden geplaatst in dezelfde 30mm schotel. </li></ol> 3. Triple immunokleuring van LAL NMJs: Dag 1 <ol><li> Voor het begin van immunokleuring, bereiden alle benodigde reagentia. 1X PBS, 2% boviene serumalbumine BSA) / PBS, 0,1 M glycine in 2% BSA / PBS, 0,2% Triton X100 in 2% BSA / PBS, en 4% paraformaldehyde (PFA) in 1X PBS nodig zal zijn. Pre-cool methanol in -20 ° C vriezer. </li><li> Laat LAL spieren gespeld in de schotel dorsale zijde tijdens dit proces. Gooi 1X PBS-oplossing en voeg genoeg 4% (PFA) om de spier te dekken. Plaats schaal op shaker ingesteld op snelheid 2 of 3 voor 20 minuten. Tenzij anders vermeld, dient de schotel worden geplaatst op een shaker voor de volgende stappen. </li><li> Weggooien 4% PFA en was de spier met 1X PBS 3 keer, 10 'per stuk. </li><li> Gooi laatste 1X PBS wassen en 0,1 M Glycine toe te voegen in 2% BSA / PBS-oplossing voor 30 '. </li><li> Gooi 0,1 Glycine-oplossing eend toe te voegen 1X PBS met rhodamine geconjugeerde α-bungarotoxin bij een concentratie van 1:200 voor de 15 '. </li><li> Gooi α-bungarotoxin oplossing weg en was spier in 1X PBS, 3 maal 10 'per stuk. </li><li> Permeabilize weefsel door het toevoegen van pre-cooled methanol en plaats de schaal in de -20 ° C vriezer voor precies 5 minuten, geen schudden nodig. </li><li> Verwijder de methanol en was drie keer 10 'elk met 1X PBS. Gooi laatste wassen en te blokkeren weefsel met 0,2% Triton X-100 in 2% BSA / PBS gedurende 1 uur. Het wassen en het blokkeren van stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. </li><li> 'S nachts Incubeer de spieren, beven, bij 4 ° C in een cocktail van primaire antilichamen verdund in de blockingbuffer (cf. tabel). </li></ol> 4. Triple immunokleuring van LAL NMJs: Dag 2 <ol><li> Was de spieren in 1X PBS 3 keer, 10 'elk op kamertemperatuur. </li><li> Voeg cocktail van secundaire antilichamen in het blokkeren van oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (cf. tabel). De spieren moeten beschermd worden tegen het licht van deze stap verder naar foto-bleken van Alexa Fluor 647-fluorescentie te voorkomen. </li><li> Was de spieren in 1X PBS 3 keer, 10 'per stuk. </li><li> Veeg eventueel resterende bindweefsel in 1X PBS, snijd de laterale grenzen van de LAL spieren en monteren op dia's dorsale kant naar boven, met behulp van glazen cover-slips en montage media. Gebruik duidelijke nagellak te dekken slip in plaats veilig te stellen. </li><li> Bescherm dia's van licht en bewaar bij -20 ° C tot aan analyse. </li></ol> 5. Confocale beeldvorming van LAL NMJs <ol><li> Hoge-resolutie confocale beelden worden verkregen met een Leica Apo Plan 63x olie doelstelling (1.4NA) op een Leica TCS 4D confocale microscoop. </li><li> Fluoresceïne en Alexa 647 signalen werden tegelijkertijd gescand met een laser-lijnen 488 nm (Argon, 488 nm, 20 mW) en 633 nm (HeNe, 633 nm, 10 mW), respectievelijk. Sequentieel, is Rhodamine signaal vervolgens gescand met de laserlijn 561 nm (DPSS, 561, 20 mW). Optische secties werden verzameld bij 0,3 micrometer intervallen en het aantal beelden in de z-plane varieerde 60 tot 80. De pinhole wordt aangepast aan een Airy (107,97 um). Het beeld formaat 1024 x 1024 (X, Y), met een zoom factor van 1, bij 400Hz snelheid resulteert in een beeldgrootte van 234.32 x 234.32 um um en de pixelgrootte van 229,05 nm x 229,05 nm. </li><li> Leica TCS-NT acquisitie software wordt vervolgens gebruikt om z-serie beelden te reconstrueren tot maximale intensiteit projecties. </li><li> Multipanel beelden worden aangepast voor de helderheid en het contrast met behulp van Adobe Photoshop. </li><li> Voor een typische LAL spier, moet men in staat zijn om ongeveer 75 tot 100 en face NMJs te analyseren. Synaptische stabiliteit wordt bepaald door kenmerken zoals ruimtelijke afstemming van pre-, peri-en postsynaptische elementen (dat wil zeggen, zenuw-, Schwann-cellen en spieren), en metingen van synaptische gebied (dat wil zeggen, synaps grootte). </li></ol> Representatieve resultaten: Bij de volwassen zoogdieren NMJ, een enkele motor axon gaat in fijne takken die zeer gedifferentieerde cilinders van een zenuw klem (afb. 2, Green) vormen op een enkele spiervezel, juist apposed aan de postsynaptische clusters van nicotinezuur AChRs (Fig. 2; Rood) . Perisynaptically, terminal Schwann-cellen goed voor alle takken van presynaptische zenuwuiteinden (afb. 2, Blauw). De structurele en functionele integriteit van deze tripartiete organisatie wordt ernstig verstoord door de dagelijkse toepassing van de subtype-specifieke mAChR remmers. In het voorbeeld hier gepresenteerde (afb. 3), 4-DAMP, een mAChR antagonist met een hoge affiniteit voor M1, M3, M4 en M5 mAChR subtypes, roept selectieve eliminatie van zenuwuiteinden uit talrijke NMJs de hele spier oppervlak (Fig. 3B, C). Daarnaast terminal Schwann-cellen zijn abnormaal latente 8, zoals blijkt uit heldere S100 etikettering zonder proces extensie (Fig. 3B ", 3C"). Postsynaptically, spiervezels zijn normaal en er is geen verlies van nAChRs (Fig. 3B ", 3C '). <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Anatomische locatie en de organisatie van de LAL spier. Locatie van de rostrale (rLAL), caudaal (cLAL), en de LAL zenuw (LALn) en de bijbehorende eindplaat banden worden weergegeven (A, inzet). De locatie en oriëntatie van de naald ten opzichte van de LAL spier wordt getoond voor de injectie procedure (B). Incisie punten worden weergegeven voor de dissectie procedure (C). <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Tripartiete organisatie van de NMJ. High-vergroting confocale opvattingen van een muis NMJ. Een enkele axon gaat in fijne takken klem (A), stevig onder de terminal Schwann-cellen en hun processen (A ', sterretjes punt klem Schwann cellichamen). Postsynaptically in een spier vezel, is een cluster van nicotine AChRs precies apposed aan de takken van de zenuw termisignalen en terminal Schwann-cellen. <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. LAL spieren die behandeld worden met 4-DAMP, een mAChR antagonist. Lage en hoge vergroting confocale opvattingen van LAL spieren die werden behandeld met het voertuig of 4-DAMP. In tegenstelling tot de auto-behandelde spier (A-A'''), talrijke NMJs in de 4-DAMP-behandelde spier gebrek zenuwuiteinden (B-B''', C-C'''). Een omkaderde gebied in Figuur 2B is ingezoomd figuur 2C.

<ol><li>Wright, M. C., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+is+not+required+for+terminal+sprouting+and+compensatory+reinnervation+of+neuromuscular+synapses%3A+re-evaluation+of+CNTF+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice.</a> Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).</li>
<li>Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+motor+neuron+sprouting+in+vivo+by+ciliary+neurotrophic+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).</li>
<li>Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+neuronal+determinants+locally+regulate+extrasynaptic+and+synaptic+growth+at+the+adult+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).</li>
<li>Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+factors+regulate+AChR+subunit+mRNAs+at+rat+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses.</a> J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).</li>
<li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse%3A+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).</li>
<li>Lanuza, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-+and+postsynaptic+maturation+of+the+neuromuscular+junction+during+neonatal+synapse+elimination+depends+on+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase.</a> C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).</li>
<li>Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+effects+of+beta-amyloid25-35+peptide+aggregates+on+transmitter+release+in+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).</li>
<li>Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+patterns+of+motor+nerve+terminal+sprouting+induced+by+ciliary+neurotrophic+factor+vs.+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin.</a> J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).</li>
<li>Wright, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth%2C+but+not+compensatory+plasticity%2C+of+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li>
<li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+inhibits+chloride+channels+in+mature+mammalian+skeletal+muscle+by+activating+P2Y1+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors.</a> J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).</li>
<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).</li>
<li>Dorje, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonist+binding+profiles+of+five+cloned+human+muscarinic+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).</li>
<li>Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Union+of+Pharmacology.+XVII.+Classification+of+muscarinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors.</a> Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De methode maakt hier gepresenteerde onderzoek van niet eerder opgenomen rollen van subtype-specifieke mAChR signalering in de stabiliteit en het onderhoud van zoogdieren NMJs. Deze methode zal ook nuttig zijn om de effecten van neurotrofe factoren en farmacologische stoffen te testen. Bijvoorbeeld: ons laboratorium bleek dat ciliaire neurotrofe Factor (CNTF) veroorzaakte ontspruit uit bijna alle LAL zenuwuiteinden in volwassen muizen <a>1</a> . Dit resultaat in contrast met eerdere studies van CNTF behandelde achterste...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> ketamine </td><td> Hospira </td><td> NDC0409-2051-05 </td><td> Dosis: 120mg/kg </td></tr><tr><td> xylazine </td><td> Lloyd Laboratories </td><td> LA33806 </td><td> Dosis: 8mg/kg </td></tr><tr><td> atropine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0132 </td><td> (&gt; 98% zuiverheid); Dosis: 0.2mg/kg - 20mg/kg </td></tr><tr><td> atropine </td><td> Voigt Global Distribution </td><td> AT105 </td><td> Farmaceutische kwaliteit </td></tr><tr><td> Methoctramine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M105 </td><td> Dosis: 100 - 400M </td></tr><tr><td> 4-DAMP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D142 </td><td> Dosis: 2.5mg/kg </td></tr><tr><td> AFDX-116 </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 1105 </td><td> 250M </td></tr><tr><td> AFDX-384 </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 1345 </td><td> 50M - 500M </td></tr><tr><td> MT 7 </td><td> Peptiden International </td><td> PMT-4340-s </td><td> 0,1 M - 1M </td></tr><tr><td> 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Visser </td><td> T353-500 </td><td> Maak 10% oplossing eerst door het oplossen van 10g/100mL gedeïoniseerd gedistilleerd water, maak 4% met 1X PBS, de pH instellen op 7,4 </td></tr><tr><td> Natrium pentobarbitol </td><td> Virbac Animal Health </td><td> NDC-051311-050-01 </td><td> Dosis: 390mg/kg </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> Part # 184 </td><td> Volg de instructies die bij kit, kunnen meerdere grote cultuur schotel te gebruiken (30mm, 60mm, 100mm), afhankelijk van de behoeften </td></tr><tr><td> 0,1 M Glycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-7126 </td><td> Voeg 0.185g aan 25ml van 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> 2% Bovine serum albumine (2% BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-100g </td><td> Los 2g BSA in 100 ml 1X PBS </td></tr><tr><td> 0,2% Triton X100 in 2% BSA / PBS (Blocking Buffer) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-100ml </td><td> Los 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> α-bungarotoxin </td><td> Invitrogen </td><td> T1175 </td><td> Het gebruik bij een concentratie van 1:200 </td></tr><tr><td> SMI-312 </td><td> Sternberger monoklonalen </td><td> SMI312 </td><td> Het gebruik bij een concentratie van 1:1000 </td></tr><tr><td> SV2 </td><td> Developmental Studies Hybridoma Bank </td><td> SV2-Supernatant </td><td> Het gebruik bij een concentratie van 1:10 </td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td> Het gebruik bij een concentratie van 1:400 </td></tr><tr><td> FITC-geit anti-muis lgG1 </td><td> Roche </td><td> 03117731001 </td><td> Het gebruik bij een concentratie van 1:200, maar als achtergrond hoog is, probeer dan 1:400 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647-geconjugeerd geit anti-konijn </td><td> Invitrogen </td><td> A21244 </td><td> Het gebruik bij een concentratie van 1:200 </td></tr><tr><td> Vectashield fluorescerende montage media </td><td> Vector laboratoria </td><td> H-1000 </td><td> Dit is geen hard-set media, moet u het dekglas met heldere nagellak te beveiligen. </td></tr><tr><td> Kleine Spring Schaar </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 15002-08 </td><td></td></tr><tr><td> Dissection pincet </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr></tbody></table>

subcutane toediening van muscarine antagonisten en triple-immunokleuring van de levator auris longus in muizen

Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Achterste ledematen spieren van knaagdieren, zoals de gastrocnemius en de m. tibialis anterior, worden vaak gebruikt voor in vivo farmacologische studies van de signalen essentieel voor de vorming en instandhouding van zoogdieren NMJs. Echter, drugs penetratie in deze spieren na subcutane of intramusculaire toediening is vaak onvolledig of oneffen en vele NMJs kunnen blijven onaangetast. Hoewel de systemische toediening met apparaten zoals mini-pompen kunnen het verbeteren van de spatiotemporele effecten, kan het invasieve karakter van deze aanpak leiden tot verwarrende ontstekingsreacties en / of directe spierschade. Bovendien is het volledige analyse van de NMJs in een achterste ledematen spier een uitdaging, want het vereist tijdrovende serie snijden en uitgebreide immunokleuring. De muis LAL is een dunne, vlakke plaat van de spieren oppervlakkig gelegen op het dorsale gedeelte van de nek. Het is een fast-twitch spier die functies te bewegen de oorschelp. Het bevat rostrale en caudale delen die afkomstig zijn van de middellijn van de schedel en uit te breiden zijdelings aan de kraakbenige gedeelte van elk oorschelp. De spier wordt geleverd door een tak van de nervus facialis die caudaal projecten dat uit de stylomastoid foramen. Wij en anderen hebben gevonden LAL naar een geschikte preparaat dat voordelen voor het onderzoek van zowel korte als lange termijn in vivo effecten van drugs op NMJs en spieren aanbiedingen zijn. De eerste, de oppervlakkige ligging maakt meerdere lokale toepassingen van drugs onder lichte narcose. Ten tweede, de dunheid (2-3 lagen van spiervezels) staat visualisatie en analyse van bijna alle NMJs binnen de spier. Ten derde, het gemak van ontleden met zijn zenuw intact, samen met het patroon van de innervatie vergunningen aanvullende elektrofysiologische analyse in vitro 9,5. Laatste, en misschien wel het allerbelangrijkste, een klein toegepaste volume (~ 50μl) dekt met gemak de hele spier oppervlak, zorgt voor een uniforme en langdurige blootstelling van al haar NMJs om het geneesmiddel en elimineert de noodzaak voor een systemische benadering 1,8.

We beschrijven de procedures voor de herhaalde toediening van remmers van muscarine-signalering naar de levator Auris longus (LAL) spier van jong volwassen muizen en voor de daaropvolgende immunokleuring van de neuromusculaire verbindingen (NMJs) in wholemounts. De LAL spier heeft unieke voordelen voor het openbaren van<em&gt; In vivo</em&gt; Farmacologische effecten op de NMJs.

Subcutane toediening van muscarine antagonisten en Triple-Immunokleuring van de Levator Auris longus in Muizen

Achterpotspieren van knaagdieren, zoals de musculus gastrocnemius en de musculus tibialis anterior, worden vaak gebruikt voor in vivo farmacologische studies naar de signalen ...

Het algemene doel van deze procedure is om muscarine-antagonisten toe te dienen aan de LAL-spieren van volwassen muizen en de morfologische veranderingen van nj's te onderzoeken als reactie op de inhibitie van muscarine acetylcholine-receptoren. Eerst worden de muscarine-antagonisten subcutaan toegediend met de gewenste frequentie en duur. Na euthanasie worden de behandelde LAL-spieren zorgvuldig gedisseceerd en wordt eventueel bindweefsel verwijderd.Het spierweefsel wordt vervolgens drievoudig immunogelabeld om de Schwanncellen van de motorische zenuwen en nicotinische acetylcholinereceptoren te visualiseren met behulp van standaard immunohistochemische methoden. Ten slotte wordt confocale microscopie gebruikt om morfologische veranderingen van de nj's in spieren te onderzoeken die zijn behandeld met muscarinische antagonisten. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat de morfologische organisatie van de tripartite NMJ ernstig wordt verstoord door remming van muscarinische acetylcholinereceptoren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de toediening van farmaceutische verbindingen aan de skeletspieren van de achterpoot van knaagdieren (zoals de gastrocnemius en tibialis anterior), is dat de LAL-spier toegankelijker en relatief dun is. Dit maakt herhaalde lokale toediening van geneesmiddelen en visualisatie van bijna alle njs binnen de spier mogelijk. Los de juiste dosis van de muscarine acetylcholine receptor antagonist op in steriele fysiologische zoutoplossing in een reactiebuisje van 1,5 milliliter op een werkblad dat is gereinigd met ethanol. Trek 50 microliters van de oplossing op in een insulinespuit van 1 cc, waarbij voor elke muis een aparte spuit wordt gebruikt.Bereid daarnaast spuiten voor met uitsluitend fysiologisch zout voor elke muis in de controlegroep en bewaar alle spuiten op ijs tot het moment van injectie. Narcoseer de muizen vervolgens met een ketamine-xylazine-cocktail. Bevestig de anesthesie na adequate sedatie met de toe-pinch-techniek, scheer het haar weg dat het rostrale deel van de kop tot aan de caudale regio van de nek bedekt en verwijder het overgebleven haar met 70% ethanol. Plaats de muis onder een stereomicroscoop en steek de injectienaald parallel aan de LAL-spier zodanig dat de punt het caudale aspect bereikt.Trek de naald van de spuit voorzichtig iets terug om er zeker van te zijn dat de naald in het bovenliggende bindweefsel is geplaatst en de LAL-spier zelf niet direct beschadigt. Begin zeer langzaam met het injecteren van de oplossing over de rechter LAL-spier, terwijl de spuit gedurende ongeveer één minuut wordt teruggetrokken. Bij een correcte injectie moet de oplossing een koepelvorm vormen in de bovenliggende huid die gedurende ten minste één uur aanhoudt.Herhaal de procedure elke 12 uur gedurende één tot zeven dagen voorafgaand aan de dissectie van de spieren; euthanaseer de muis en spel deze vervolgens met de rugzijde naar boven vast in een dissectieschaal. Maak de eerste incisie uitsluitend door de huid met een kleine veerschaar, waarbij u langs de linker LAL snijdt vanaf het gebied vlak proximaal van het oor tot het gebied rond het linker schouderblad. Verwijder voorzichtig de huid in dit gebied, maar vermijd het snijden te dicht bij het rechteroor, aangezien dit een van de aanhechtingspunten is voor de rechter LAL-spier.Lokaliseer met een kleine veerschaar de centraal gelegen strook vetweefsel op het oppervlakkige deel van de kop, op de plek waar de rechter- en linkerm. LAL-spieren samenkomen. Maak een incisie één centimeter rechts van het vetweefsel en in de richting van het linkeroor, vanaf de proximale rand van de linker m. LAL tot aan de schouder. Zodra de incisie is gemaakt, wordt de rechter m. LAL met een kleine pincet teruggepeld om de ventrale zijde van de spier bloot te leggen.Trim het bindweefsel en de fascia terwijl u voorzichtig aan de rechter LAL-spier trekt met een pincet. Snijd rond het caudale uiteinde van de rechter LAL aan de basis van het oor en beweeg richting het rostrale uiteinde van het rechteroor. Houd de rechter LAL omgeslagen.Het is beter om in deze stap meer weefsel op te nemen dan het risico te lopen de LAL zelf te beschadigen. Als de spier begint uit te drogen, pipetteer dan 1 XPBS over de spier.Plaats de gedissecteerde rechter LAL met de dorsale zijde naar boven in een kweekschaaltje van 30 millimeter dat één XPBS bevat. Zet de vier hoeken van de spier vast met kleine insectenspelden met behulp van een kleine pincet en veerscharen. Verwijder het bindweefsel van het dorsale oppervlak van de rechter LAL-spier.Draai de spier om en zet deze opnieuw vast om het ventrale oppervlak schoon te maken. Twee tot drie spieren kunnen in hetzelfde schaaltje van 30 millimeter worden geplaatst voor triple immunokleuring na de overnachtse incubatie met het primaire antilichaam.Was de spieren drie keer gedurende 10 minuten in one XPB S3 en voeg vervolgens de cocktail van secundaire antilichamen in blokkeringsoplossing toe voor één uur. Houd de incuberende spieren bij kamertemperatuur afgeschermd van licht om fotobleken te voorkomen; was de spieren na een incubatie van een uur drie keer gedurende elk 10 minuten in one XPB S3. Houd de spieren na de laatste wasbeurt bedekt met verse one XPBS en verwijder onder de stereomicroscoop al het resterende bindweefsel, waarna de laterale randen van de LAL worden doorgesneden.Monteer het spierweefsel op het objectglas met de dorsale zijde naar boven. Voeg vervolgens twee of drie druppels monteermiddel toe. Plaats glazen dekglasjes en gebruik transparante nagellak om deze te fixeren.Bescherm de preparaten tegen licht en bewaar ze bij minus 20 degrees Celsius tot ze klaar zijn voor analyse. Confocale beelden bij hoge vergroting van een drievoudige immunokleuring van een muizen-NMJ tonen de tripartite organisatie ervan. De fijne terminale vertakkingen die voortkomen uit een enkel axon, gekleurd met NFS V two, zijn nauw omsloten door terminale Schwann-cellichamen en hun uitlopers, zoals onthuld door S 100-kleuring postsynaptisch.Bij een spiervezel bevindt een cluster van nicotinische acetylcholinereceptoren zich precies tegenover de vertakkingen van zenuwuiteinden en terminale Schwann-cellen. De LAL-spier van een met een vehikel behandelde muis vertoont nj's, waarvan de tripartite organisatie ongestoord is en die de typische, sterk gedifferentieerde vertakkingen van het zenuwuiteinde hebben, zoals aangetoond door triple immunokleuring. In tegenstelling hiermee wordt de structurele en functionele integriteit van deze tripartite organisatie ernstig verstoord door de dagelijkse toediening van vier damp.Een subtype-specifieke muscarine acetylcholinereceptor-remmer. Hier roept het op tot de selectieve eliminatie van zenuwuiteinden van talrijke nj's over het gehele spieroppervlak. Bovendien zijn terminale Schwann-cellen abnormaal quiescent, zoals blijkt uit een heldere S 100-labeling zonder procesextensie.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u muscarine-antagonisten toedient aan LAL-spieren en deze spieren drievoudig immunokleurt om morfologische veranderingen van nj's te onderzoeken als reactie op de inhibitie van deze receptoren.

subcutaneous-administration-muscarinic-antagonists-triple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Herhaalde metingen van knaagdieren respiratoire fysiologie en bemonstering van de luchtwegen ontstekingscellen wenselijk zijn, maar over het algemeen niet haalbaar. Hier beschrijven we een herhaalbare methode voor het mondeling intuberen muizen dat herhaalde metingen van de luchtwegen hyperreactiviteit en de bemonstering van de luchtwegen ontstekingscellen vergunningen.

Een reversibele, niet-invasieve methode voor Airway Resistance Metingen en bronchoalveolaire lavage Fluid Sampling in Muizen

We hebben een eenvoudige, betrouwbare en relatief goedkope methode voor endotracheale intubatie bij muizen via directe laryngoscopie behulp van een otoscoop met een 2,0 mm speculum ontwikkeld. Deze techniek is atraumatische en kan worden gebruikt voor herhaalde metingen in chronische experimenten. We vinden het superieur aan tracheostomie of eerder gerapporteerde niet-chirurgische technieken.

Luchtpijpintubatie in Muizen<em&gt; Via</em&gt; Directe laryngoscopie behulp van een otoscoop

Dit huidige protocol maakt gebruik van fluorescente reporters, in vivo labeling en intravitale beeldvormingstechnieken om het dynamische proces van neutrofiel priming in levende dieren te kunnen monitoren.

Intravitale Imaging van neutrofielen Priming gebruik van IL-1β-Promoter gedreven DsRed Reporter Muizen

Twee microchirurgiebenaderingen voor lokale medicijntoediening aan het binnenoor worden hier beschreven en vergeleken in termen van impact op gehoorparameters, cochleaire cytoarchitectuur en expressie van inflammatoire markers.

Een vergelijkende studie van Drug Delivery Methoden Gericht op de Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Hier presenteren we een protocol om te veroorzaken verlamming en opticospinal ontsteking door overdracht van aquaporin-4 (AQP4)-specifieke T-cellen van de AQP4- / - muizen in WT muizen. Daarnaast tonen we hoe met seriële optische coherentie tomografie controleren visuele systeem dysfunctie.

Inductie van verlamming en visuele systeem schade in muizen door T cellen specifiek voor Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Het protocol beschreven in dit document maakt gebruik van de muis Musculus levator auris longus (LAL) spier graag spontane, zenuw-opgeroepen postsynaptisch potentieel (current-clamp) en stromingen (spanning-klem) op de motorische eindplaat. Gebruik van deze techniek kan belangrijke inzicht verwerven in de mechanismen van synaptische transmissie onder normale en zieke voorwaarden.

Musculus levator Auris Longus Voorbereiding onderzoek van zoogdieren neuromusculaire transmissie Voltage Clamp voorwaarden

We presenteren een gedetailleerde aanpak voor het uitvoeren van speeksel inzameling, met inbegrip van lymfkliertest tracheostomy en het isolement van de drie grote speekselklieren.

Gefractioneerde lymfkliertest speeksel functioneel-diagnostiek via Pilocarpine stimulatie volgende straling

Hier laten we zien hoe je intravitale microscopie uitvoert op postcapillaire venules van de muiscremaster spier. Vaak toegepast op verschillende modellen van ontsteking en sepsis, met name die veroorzaakt door chemokines en cytokines, benadrukken we de relevantie ervan in de studie van muscolopathies waarbij overdreven gespierde leukocyten infiltratie.

Leukocyten infiltratie van Cremaster Spier in muizen beoordeeld door Intravital Microscopie

Oculaire oppervlakteontsteking schaadt de oculaire oppervlakteweefsels en compromitteert vitale functies van het oog. Het huidige protocol beschrijft een methode om oogontsteking te induceren en gecompromitteerde weefsels te verzamelen in een muismodel van Meibomian gland dysfunction (MGD).

Inductie van oculaire oppervlakteontsteking en verzameling van betrokken weefsels

Hier presenteren we een protocol dat in vivo elektroporatie en denervatie van de craniale levator auris longus (LAL) spier combineert. Deze procedure maakt het mogelijk om de mogelijke rol van spiereiwitten bij de regeneratie van de neuromusculaire synaps te bestuderen.

Gecombineerde in vivo elektroporatie en kortdurende reïnnervatie van de skeletspier van de craniale levator Auris longus

Leer subcutane toediening van muscarine-antagonisten aan de levator auris longus bij muizen. Deze methode combineert triple-immunokleuring met confocale microscopie om morfologische veranderingen in neuromusculaire verbindingen te analyseren.

Subcutane toediening van muscarine antagonisten en Triple-Immunokleuring van de Levator Auris longus in Muizen

Meer video's verkennen