Immunoprecipitation of Target Protein-DNA Complexes from Motor Neuron Lysate
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 2:55 min • July 8th, 2025
Begin with a tube containing pre-treated magnetic beads coated with antibodies specific to a target protein cross-linked to the DNA.
Add a motor neuron lysate containing DNA fragments and incubate with agitation.
The DNA fragments interact with antibody-coated beads, forming bead-DNA complexes.
Centrifuge to collect the liquid from the cap and place it on a magnetic separator to precipitate the bead-DNA complexes.
Remove the supernatant containing unbound DNA fragments.
Introduce a detergent-based lysis buffer to solubilize non-specifically bound DNA fragments.
Centrifuge and perform the magnetic separation, then remove the supernatant.
Wash with a high salt buffer to disrupt non-specific interactions. Centrifuge, perform the magnetic separation, and remove the supernatant.
Wash with LiCl buffer to remove the remaining non-specific interactions. Centrifuge, perform the magnetic separation, and remove the supernatant.
Finally, wash with Tris-HCl buffer, centrifuge, and perform the magnetic separation.
Remove the supernatant and collect the beads containing the target protein-DNA complexes.
To begin the chromatin immunoprecipitation, wash the antibody-coated beads in 1 milliliter of blocking solution. Place the tube containing the antibody-coated beads on a rocking platform at 4 degrees Celsius for 5 minutes. After briefly spinning, place the tube on a magnetic rack, and remove the supernatant.
Resuspend the antibody-coated beads in 50 microliters of blocking solution. Add 1 milliliter of sonicated lysates to the antibody-coated beads. Then, incubate the sample on a rocking platform at 4 degrees Celsius overnight. After allowing the sample to incubate overnight, collect liquid from the cap by briefly spinning the tube. Then, place the tube on a magnetic rack, and after 1 minute, remove the supernatant carefully with a pipette.
Next, perform a series of washes as follows. Add 1 milliliter of cold wash buffer containing CPI to the sample. Mix the sample on a rocking platform at 4 degrees Celsius for 5 minutes. Briefly spin the sample tube. Then, place on a magnetic rack. After 1 minute, remove the supernatant with a pipette.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van magnetische beads die zijn gecoat met antilichamen die specifiek zijn voor doeleiwitten. De methode omvat verschillende was- en centrifugatiestappen om eiwit-DNA-complexen te isoleren uit een lysaat van motorneuronen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Genetica
Achtergrond
- Chromatine-immunoprecipitatie is een techniek die wordt gebruikt om interacties tussen eiwitten en DNA te bestuderen.
- Magnetische beads vergemakkelijken de isolatie van specifieke complexen uit complexe mengsels.
- Het begrijpen van deze interacties is cruciaal voor inzichten in genregulatie.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende celtypen, waaronder neuronen.
Doel van de studie
- Om eiwit-DNA-complexen in motorneuronen te isoleren en te analyseren.
- Om het begrip van genregulatiemechanismen in neuronale contexten te verbeteren.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers in dit vakgebied.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van magnetische beads gecoat met specifieke antilichamen.
- Incubatie van lysaten met beads om bead-DNA-complexen te vormen.
- Meerdere wasstappen om aspecifiek gebonden DNA te verwijderen.
- Magnetische scheiding om de doelcomplexen te isoleren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van eiwit-DNA-complexen uit lysaten van motorneuronen.
- Demonstratie van effectieve wasstechnieken om aspecifieke binding te minimaliseren.
- Optimalisatie van het protocol voor een verhoogde opbrengst en zuiverheid van complexen.
- Inzichten in de interacties tussen eiwitten en DNA in neuronale cellen.
Conclusies
- Het beschreven protocol is effectief voor het bestuderen van eiwit-DNA-interacties in neuronen.
- Het biedt een betrouwbare methode voor onderzoekers om genregulatie te verkennen.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar andere celtypen en condities.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Het in kaart brengen van eiwit-DNA-interacties in ziekte-relevante neuronale systemen ondersteunt de validatie van targets door transcriptionele regulatiemechanismen te verduidelijken. Deze op ChIP gebaseerde aanpak maakt een mechanistische risicoanalyse van therapeutische hypothesen in modellen voor neurodegeneratieve ziekten mogelijk. De methode biedt kwantitatieve, reproduceerbare gegevens voor de beoordeling van de betrouwbaarheid van targets in een vroeg stadium.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om transcriptiefactor-bindingsplaatsen te onderzoeken ter validatie van ziekterelevante targets in motorische neuronmodellen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van immunoprecipitatie met magnetische beads voor de schaalbare isolatie van specifieke eiwit-DNA-complexen uit lysaten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de prioritering van targets door eiwitbezetting te koppelen aan genregulerende pathways in neuronale contexten.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert resolutiekaarten van eiwit-DNA-interacties voor de ontwikkeling van assay-biomarkers.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde wasprotocollen (hoog zoutgehalte, LiCl, Tris-HCl) waarborgen de reproduceerbaarheid tussen experimentele batches.
- Voorspellende waarde: Maakt screening mogelijk van verbindingen die de binding van transcriptiefactoren aan DNA in neuronale systemen moduleren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verbindt target-engagement met stroomafwaartse transcriptionele effecten in ziekterelevante neuronen afgeleid van stamcellen.
- Operationele waarde: Biedt een continue workflow van target-validatie tot mechanistische follow-up in preklinische modellen.
- Voorspellende waarde: Informeert risico-gecorrigeerde voortgang door het target-mechanisme te bevestigen in menselijk relevante neuronale cellen.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen workflows van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek door mechanistisch inzicht te bieden in de targetfunctie in neuronale ziektemodellen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van de rollen van transcriptiefactoren in genreguleringspaden die relevant zijn voor neurodegeneratie.
- Screening: Levert kwantitatieve, gestandaardiseerde outputs voor het evalueren van de effecten van verbindingen op target-DNA-interacties.
- Analytiek: Levert verrijkingsgegevens ten opzichte van de input om specifieke bindingsgebeurtenissen te kwantificeren voor vergelijkende conditieanalyse.
- Translationeel onderzoek: Maakt gebruik van lysaten van motorneuronen om de relevantie voor de ziekte te behouden tijdens de overgang van ontdekking naar preklinisch onderzoek.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Immunoprecipitatie op basis van magnetische beads is aanpasbaar voor verschillende eiwitdoelen en neuronale modelsystemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door direct bewijs te leveren van target-DNA-binding in neuronale lysaten.
- Operationele waarde: Magnetische scheiding maakt gestandaardiseerde, high-throughput compatibele verwerking van lysaten mogelijk.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door het targetmechanisme in een vroeg stadium van de discovery-pipeline te bevestigen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van functionele validatie in ziekterelevante systemen.
Overwegingen bij implementatie
- Vereist expertise in chromatinepreparatie, immunoprecipitatie en het hanteren van magnetische beads.
- Is afhankelijk van toegang tot sonicatieapparatuur, magnetische separatoren en kwaliteitsgecontroleerde antilichamen.
- Vereist gestandaardiseerde formuleringen van wasbuffers (hoog zout, LiCl, Tris-HCl) voor reproduceerbare resultaten tussen teams.
- Moet rekening houden met variabiliteit in de kwaliteit van het lysaat van primaire neuronen en de efficiëntie van de crosslinking.
- Wordt beperkt door de specificiteit van het antilichaam en de efficiëntie van de crosslinking, wat de opbrengst en zuiverheid van het complex beïnvloedt.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Native chromatine Immunoprecipitation met behulp van lymfkliertest Brain Tumor Neurospheres
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Chromatine Immunoprecipitation van lymfkliertest bruin vetweefsel
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van labiele Multi-eiwit-complexen door In vivo Gecontroleerde Cellulaire Cross-Linking and Immuno-magnetische affiniteitschromatografie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Chromatine immunoprecipitatie van achterwortelganglia Tissue volgende axonale schade
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Lectine-based Isolatie en cultuur van de muis embryonale motoneuronen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Chromatin Immunoprecipitation Assay: A Technique to Study Protein-DNA Interactions in Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
On-Membrane Protein Digestion to Prepare Co-Immunoprecipitated Proteins for Interaction Studies
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Identificatie van MyoD Interactoomanalyse gebruik van Tandem Affinity Purification Gekoppeld aan massaspectrometrie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van Cognate RNA-eiwitcomplexen van cellen met behulp van oligonucleotide-gerichte Elution
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026