Immunofluorescence Staining for Visualizing Proliferated Neural Stem Cells in Mouse Brain Sections
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 3:59 min • July 8th, 2025
Take fixed mouse brain sections containing neural cells, including proliferated neural stem cells labeled with EdU, a thymidine analog.
Outline the sections with a hydrophobic marking to prevent solution spread.
Add a detergent to permeabilize the tissue. Wash to remove excess detergent.
Add a fluorophore to label the EdU. Remove the excess fluorophores.
Using a fluorescence microscope, confirm proper staining of the EdU-labeled cells.
Apply a blocking buffer containing proteins to prevent non-specific antibody binding. Remove the excess proteins.
Incubate with primary antibodies that bind to specific proteins in neural stem cells. Remove the unbound antibodies.
Add fluorophore-conjugated secondary antibodies to bind the primary antibodies. Wash off the unbound antibodies.
Stain the nuclei with a dye and remove the excess dye.
Remove the hydrophobic marking, apply mounting media, and place a coverslip.
Using a confocal microscope, observe the sections to visualize the labeled neural stem cells.
To stain the tissue sections with thymidine analog, remove the tissue sections from the citrate buffer. Let the tissue sections dry and completely adhere to the slides before drawing a border with a hydrophobic pen. Next, permeabilize the sections with permeabilization buffer for 20 to 30 minutes. Wash the sections twice using TBS Triton for 5 minutes each time. Then, prepare an EdU reaction solution.
Incubate the sections in EdU reaction solution for 30 minutes to an hour. Subsequently, wash them three times in TBS Triton for 5 minutes each time. At this stage, check if the EdU reaction works by using a fluorescent microscope. EdU-labeled cells should be observed if the reaction works. Now, block the mounted tissue sections using blocking buffer raised in the same animal as the secondary antibody for 30 minutes to an hour. Then, wash them twice in TBS Triton for 5 minutes each time.
During the blocking step, prepare primary antibody solution by mixing the primary antibody in blocking buffer. Subsequently, add 250 microliters of primary antibody solution per slide to ensure the tissue sections are completely submerged, and incubate them overnight at room temperature. The next day, wash the tissue sections three times in TBS Triton for 5 minutes each to remove excess primary antibody.
Then, incubate the tissue sections in fluorophore-conjugated secondary antibody prepared in blocking buffer solution for two hours at room temperature. Wash the tissue sections three times in TBS Triton for 5 minutes each to remove excess secondary antibody. Next, apply 300 micromolar DAPI solution at 1-to-100 in PBS for 15 minutes at room temperature. Afterward, wash the tissue sections three times in PBS for five minutes each to remove excess DAPI, and remove the PAP pen circle around the tissue using a cotton swab. Let the sections dry before applying mounting media and covering them with coverslips.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het kleuren van neurale stamcellen in gefixeerde hersensecties van muizen met behulp van EdU en specifieke antilichamen. De methode omvat meerdere stappen, waaronder permeabilisatie, blokkering en fluorescentiemicroscopie om de gelabelde cellen te visualiseren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Neurale stamcellen zijn cruciaal voor de ontwikkeling en het herstel van de hersenen.
- EdU is een thymidine-analoog die wordt gebruikt om prolifererende cellen te labelen.
- Fluorescentiemicroscopie maakt de visualisatie van specifieke eiwitten en celtypen mogelijk.
- Correcte kleuringstechnieken zijn essentieel voor een nauwkeurige observatie van neurale cellen.
Doel van de studie
- Om een uitgebreid protocol te bieden voor het kleuren van neurale stamcellen.
- Om visualisatietechnieken te verbeteren voor het bestuderen van neurale celproliferatie.
- Om een beter begrip van de biologie van neurale stamcellen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van gefixeerde hersensecties van muizen.
- Gebruik van EdU voor het labelen van geprolifereerde neurale stamcellen.
- Toepassing van primaire en secundaire antilichamen voor specifieke proteïnedetectie.
- Fluorescentie- en confocale microscopie voor visualisatie van gekleurde cellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle labeling van neurale stamcellen met EdU.
- Effectieve blokkerings- en kleuringsprotocollen om aspecifieke binding te verminderen.
- Visualisatie van specifieke eiwitten in neurale stamcellen.
- Bevestiging van de EdU-reactie via fluorescentiemicroscopie.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van neurale stamcellen.
- Fluorescentiemicroscopie is effectief voor het visualiseren van gelabelde cellen.
- Deze aanpak kan worden toegepast op diverse studies binnen de neurowetenschappen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit protocol maakt een nauwkeurige visualisatie van geprolifereerde neurale stamcellen in hersenweefsel mogelijk, wat de validatie van doelwitten in onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten ondersteunt. Door EdU-labeling te combineren met immunofluorescentie, biedt het kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste gegevens over celproliferatie en eiwitexpressie. Dit verbetert de mechanistische risicoreductie in vroege discovery-fasen door cellulaire fenotypen in ziekterelateerde systemen te bevestigen.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door geprolifereerde neurale stamcellen in situ te visualiseren.
- Operationele waarde: Bevestigt target-engagement en modulatie van signaalpaden in hersensecties die relevant zijn voor de ziekte.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe observatie van de dynamiek van cellulaire proliferatie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare kleuringsprotocollen voor de detectie van neurale precursorcellen.
- Kwantitatieve output: Maakt meting van EdU-incorporatie mogelijk als maatstaf voor proliferatiesnelheden.
- Hergebruik van het platform: Aanpasbaar aan meerdere antilichaamdoelen voor multiplexe screening van neurale fenotypes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Toepasbaar op hippocampus-afhankelijke ziektemodellen waarbij neurogenese een rol speelt.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en ex vivo weefselvalidatie in preklinische workflows.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Levert histopathologisch bewijs ter ondersteuning van go/no-go-criteria bij targetvalidatie.
Integratie van pipeline en workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van doelwit-hypotheses tot preklinische validatie, waardoor iteratieve verfijning van verbindingen die neurale stamcellen moduleren mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door EdU-gelabelde prolifererende cellen in reactie op perturbaties te visualiseren.
- Screening: Levert assay-klare weefselcoupes met gestandaardiseerde permeabilisatie en blocking voor consistente antilichaamskleuring.
- Analytics: Genereert fluorescentiegebaseerde read-outs voor co-lokalisatieanalyse van proliferatiemarkers en celtype-specifieke eiwitten.
- Translationeel Onderzoek: Maakt continuïteit mogelijk van celcultuurmodellen naar intacte weefselarchitectuur in ziekte-relevante systemen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare histologie-pipeline voor meerdere neurowetenschappelijke targets over verschillende discovery-projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door directe visualisatie van cellulaire proliferatie.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde permeabilisatie-, blokkerings- en wasstappen.
- Strategische waarde: Vermindert uitval in een laat stadium door mechanistische effecten te bevestigen in fysiologisch relevant weefsel.
- Impact op portfolio: Informeert de risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen die de dynamiek van neurale stamcellen moduleren.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in histologie, immunofluorescentie en fluorescentiemicroscopie.
- Is afhankelijk van confocale microscopie en compatibele filtersets voor gemultiplexte detectie.
- Vereist standaardisatie van blokkeringsbuffers en antilichaamverdunningen tussen gebruikers.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten weefselfixatiemethoden en antigeen-retrieval voor verschillende targets.
- Praktische beperkingen omvatten weefselautofluorescentie en antilichaamspecifiteit, waarvoor passende controles vereist zijn.
Veelgestelde vragen over Biofarmaceutica
Immunohistochemie en Multiple Labeling met antilichamen van dezelfde Host te onderzoeken soorten volwassen hippocampus Neurogenese
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Cell Cycle analyse in de C. elegans Germline met de Thymidine analoge EdU
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Immunohistochemische technieken om cellulaire proliferatie en neurogenese bij ratten te analyseren met behulp van de Thymidine Analog BrdU
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Ex vivo Live-Imaging van Single Cell Divisies in Muis neuroepithelium
Gerelateerde video's
0 Bekeken
An Immunofluorescence Staining Technique to Detect Adult Hippocampal Neurogenesis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Immunostaining of Fluorescently Labeled Astrocytes in a Mouse Brain Tissue Section
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Immunostaining of Neurons in Mouse Brain Slices Following Fluorescence In Situ Hybridization
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Time-Lapse Imaging of Mouse Neural Stem Cell Division Using Confocal Microscopy
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regio's van de Adult knaagdierhersenen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het beoordelen van de celcyclus van neurale stamcellen en stamcellen in de Mouse ontwikkeling van de hersenen na genotoxische stress
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026