Name: Neurale buis sluiting in Mouse Whole Embryo Cultuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Leer neurale buis sluiting bestuderen in muizenembryo's met behulp van whole embryo cultuur. Deze methode maakt directe farmacologische manipulatie mogelijk zonder moederlijke metabolisme.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag naar het lab van A. Hadjantonakis (Sloan-Kettering Institute) en het lab van L. Niswander (U van de Colorado-Denver) bedanken voor de nuttige adviezen met dissectie en cultuur technieken. Dit werk werd ondersteund door NRSA NS059562 naar JDG en RO1NS05897 om MER in samenwerking met L. Niswander en J. Nadeau (Institute for Systems Biology).

1. De voorbereiding van de cultuur media - alle reagentia zijn vermeld in tabel 1 <ol><li> Dooi mannelijke rat serum bij 37 ° C. </li><li> Warmte-Inactiveer rat serum gedurende 30 minuten bij 55 ° C </li><li> Centrifugeer rat serum op 10K gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur </li><li> Verwijder supernatant en meng 50:50 met fenol-rood vrij DMEM w / High Glucose </li><li> Steriliseer de media met een 0,45 um spuitfilter </li><li> Minstens 1 ml van de media / embryo moet worden voorbereid </li></ol> 2. Isolatie van de baarmoeder van de zwangere dam <ol><li> Met behulp van procedures die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC), de zwangere dam wordt eerst verdoofd en daarna gedood door cervicale dislocatie </li><li> Steriliseer de buik met 70% EtOH </li><li> Knijp een klein pad van de huid langs de middellijn, net boven de tepel lijn, met grote tangen en open de buik onder je tangen met grote schaar. Wees voorzichtig dat u geen interne structuur schades </li><li> Gebruik je schaar om zijwaarts gesneden uit de eerste opening naar de zijkanten van de muis, zodat de hele buik open is </li><li> Darmen en overtollig vet pads kunnen vaak obscure de baarmoeder en deze moet worden verplaatst opzij, zodat de bovenkant van de baarmoeder en eierstokken kan worden waargenomen aan elke kant </li><li> Knijp de bovenkant van de baarmoeder onder de eierstokken en gebruik je schaar om de baarmoeder te scheiden van het vet, het snijden van het ene eind van de baarmoeder naar de andere eierstok </li><li> Til de baarmoeder met je pincet en plaats in een petrischaal met een zoutoplossing </li></ol> 3. Verwijdering van embryo&#39;s uit de baarmoeder <ol><li> Spoel de baarmoeder met een zoutoplossing om eventuele overtollige bloed te verwijderen en het overtollige vet versiering aan de buitenkant </li><li> Transfer naar een schone schotel met room temp. Tyrodes zoutoplossing om visualisatie te verbeteren </li><li> Met behulp van een stereomicroscoop, een aparte elk embryo met behulp van een klein schaartje of, indien nodig fijne (# 5) tang zorgvuldig verwijderen van de baarmoeder uit elkaar. </li> &lt;li&gt; Invoegen fijn pincet in de ruimte tussen de baarmoederwand en de decidua en pel de rug van de baarmoederwand, en let niet te doorboren het embryo </li></ol> 4. Verwijdering van decidua uit embryo&#39;s <ol><li> Plaats de decidua, zodat de donkere gedeelte (placenta) is van u af naar </li><li> Maak een incisie met je tang langs de lijn tussen de donkere gedeelte van de decidua van het lichtere gedeelte, waarbij je niet te diep ingesneden </li><li> Vul de scheiding van de placenta van de bovenkant van de dooierzak, zorg dat u de ectoplacental kegel (EPC) scheuren. Op dit punt moet je in staat om de Reichert de membraan te visualiseren op de dooierzak </li><li> Blijf de hele decidua (lichtere gedeelte) en let niet te doorboren de dooierzak te verwijderen </li><li> Knijp voorzichtig in en verwijder de Reichert met het schillen van uit de buurt van de EPC. Als het EPC is beschadigd of gescheiden van de dooierzak, zal embryo&#39;s niet normaal te keren van E8.5-E9.5 </li><li&gt; Met de Reichert verwijderd van de embryo moet goed zichtbaar zijn door de dooierzak en kan worden opgevoerd door het tellen van somities. </li></ol> 5. Het opzetten van de cultuur-systeem <ol><li> Snij het uiteinde van een plastic overdracht pipet met een schaar aan de diameter van de opening te verhogen, zodat een embryo kan worden gepipetteerd zonder beschadiging van de dooierzak </li><li> Vul schone roller flesjes met 1 ml van media per embryo. Afhankelijk van het type van de rolflessen gebruik gemaakt van een maximum van 3-6 embryo&#39;s kunnen worden geladen in elke fles. </li><li> Breng de embryo&#39;s met behulp van uw gesneden pipet om de media-roller gevulde fles, met meer dan zo weinig Tyrodes mogelijk om niet aan de media te verdunnen </li><li> Bevestig de rubberen plug (stop) naar de top van het glas roller fles </li><li> Steek de roller flessen in de rol cultuur trommel, zodat een goede afdichting wordt gevormd tussen de stekker en de trommel </li><li> Als alle flessen zijn aangesloten, en de eventuele lege plekken in de trommel zijn verzegeld wet rubber stoppers, activeert u de roller </li><li> Open CO 2 en O 2 tanks en stel ze tot ongeveer 2 psi, zodat de uitlaatklep is een zeepbel per seconde los te laten. Voor E8.5-E10 embryo&#39;s, zou 20% O 2 en 5% CO 2 worden gebruikt. </li><li> Zorg ervoor dat de incubator is ingesteld op 37 ° C en deksel of de incubator, zodat de embryo&#39;s worden afgeschermd van licht te sluiten. </li><li> Embryo&#39;s moeten regelmatig worden gecontroleerd om hun ontwikkeling te beoordelen door de toevoeging van somities, de progressie van het draaien, en de mate van neurale buis sluiting </li><li> Na 2-3 uur in de cultuur, kunnen farmacologische remmers of andere behandelingen worden toegevoegd aan de media </li><li> De opzet van het onderzoek moeten controles worden opgenomen, zoals het voertuig of inactieve analogen van de studie reagens. </li></ol> 6. Evaluatie van ontwikkeling na hele embryo cultuur <ol><li> Schakel gas, stop roller, en verwijder de flessen van incubator </li><li> Transfer embryo&#39;s terug naar Tyrodes of PBS in een petrischaal voor de evaluatie in het kader stereomicroscoop </li><li> De dooierzak moet ballon-achtige verschijnen, een hartslag moeten zichtbaar zijn en de hartslag moet&gt; 120 slagen per minuut, en het verkeer moet worden duidelijk </li><li> Foto embryo&#39;s voorafgaand aan de dooierzak verwijderen indien nodig </li><li> Verwijder de dooierzak uit embryo door een gat in de buurt van de EPC en flippen de dooierzak en amnion over het hoofd en de romp van het embryo. </li><li> De navelstreng kan worden gesneden om de dooierzak te scheiden van het embryo en de dooierzak kan worden gebruikt voor genotypering van de embryo indien nodig. </li><li> Onderzoek van de embryo voor somiet aantal en neurale buis defecten, zoals een open schedel plooien, onvolledige sluiting van het gezicht en / of een open caudale neuropore. Embryo&#39;s kunnen worden opgevoerd op basis van de Theiler indeling van meerdere morfogenetische wijzigingen ( <a href="http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Databases/Anatomy/MAstaging.html">http://www.emouseatlas.org/ eMap / home.html</a> ) Nogmaals, een fotografisch verslag vanontwikkeling van het embryo is nuttig. </li></ol> 7. Opmerkingen <ol><li> Een hoge kwaliteit dissectie is essentieel, omdat elke nick of scheuren in de dooierzak succesvol zal draaien voorkomen en remmen de normale ontwikkeling. De EPC kan ook worden beschadigd tijdens het verwijderen van de membraan van de Reichert&#39;s (RM), en als de EPC is zelfs gedeeltelijk gescheiden van de dooierzak, embryo&#39;s niet normaal ontwikkelen. Echter, onvolledige verwijdering van de RM oorzaak embryo&#39;s aan elkaar plakken en / of RM cellen kunnen overwoekeren in cultuur en vernauwen dooierzak expansie, die beide zou een normale ontwikkeling te voorkomen. </li><li> Schoon en scherpe tangen zijn het geheim aan het krijgen van een goede dissectie, want saai of gebogen tang maken de procedure aanzienlijk moeilijker. Eiwit deposito&#39;s op instrumenten zal leiden tot weefselschade. </li><li> Schoon, steriele glazen flessen zijn ook essentieel om embryo&#39;s te voorkomen dat het vasthouden aan de zijwand en het wordt beschadigd. Vóór het begin van het experiment, moeten flessen worden scrubbed met water en zeep, gespoeld in dH 2 O, en de magnetron met een kleine hoeveelheid water in elke fles tot het water kookt. Flessen worden vervolgens gespoeld met 70% EtOH en liet aan de lucht drogen. </li><li> Werk zo snel mogelijk, want hoe sneller het embryo kan worden overgedragen aan de cultuur media en verwarmd terug naar 37 ° C is de betere overleving. </li><li> Vul het ontleden van de hele nest alvorens een embryo&#39;s rolflessen zodat elk embryo is op kamertemperatuur voor dezelfde hoeveelheid tijd om te voorkomen dat eventuele verschillen in groei embryo </li><li> Handhaven van een steriele omgeving om bacteriële besmetting van de culturen te voorkomen. Onze cultuur experimenten zijn uitgevoerd zonder antibiotica, maar veel laboratoria toe te voegen aan hun antibiotische media om bacteriegroei te voorkomen. Het medium moet zo duidelijk aan het einde van het experiment zoals het was in het begin van het experiment. Als media is troebel of er is een zichtbare neerslag, is er waarschijnlijk een conbesmetting die is geïnfecteerd jouw cultuur. </li><li> Ineffectief gasuitwisseling kan ook vertragen embryo&#39;s ontwikkeling, dus zorg ervoor dat een betrouwbare regelaar die continue levering te verzekeren. </li><li> Embryo&#39;s ontwikkelen ongeveer 50% langzamer in ex vivo cultuur, daarom is het essentieel om somieten tellen om ervoor te zorgen dat u de juiste fase van ontwikkeling heeft bereikt voor de voltooiing van het experiment. </li></ol> 8. Representatieve resultaten: De verschijning van embryo&#39;s pre-en post-roller cultuur wordt geïllustreerd in figuur 1. Op het moment van dissectie, moeten embryo&#39;s worden in een unturned configuratie (Fig. 1A, D), waar de staart achter het hoofd vouwen. Na 36 uur in de cultuur, moeten embryo&#39;s dus afgerond hebben draaien dat ze in de C-gebogen, foetale houding, waarbij de staart is in de voorkant van het hoofd (afb. 1B, C, E, F). Farmacologische manipulatie met RhoA kinase remmer (Y-27632), een bekende remmer van convergente uitbreiding tijdens deneurulatie (Ybot-Gonzalez, 2007), resulteert in een verkorting van de embryo&#39;s langs hun rostraal-caudaal as (fig. 1E, F) en remt de craniale neurale plooi sluiting. Onze gegevens tonen aan dat toenemende doses van Y-27,632 geleidelijk craniale vouw sluiting schaadt (Figuur 2A) en verkort het lichaam as (Fig. 2B), in overeenstemming met de rol van downstream RhoA signalering in craniale neurulatie en convergente extensie. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig1.jpg" /> Figuur 1. Verschijning van culturen embryo&#39;s en manipulatie met de farmacologische remmer Y-27632. (A, D) ontleed embryo&#39;s op E8.5 voorafgaand aan de hele embryo cultuur (B, E) Embryo&#39;s op E10 met de dooierzak nog steeds intact, na 36hrs van rol cultuur. (C, F) De dooierzak is verwijderd om succesvol te draaien en neurale buis sluiting illustreren. Embryo&#39;s die werden behandeld met de Rho kinase remmer Y-27632 (E, F) niet naar behoren convergente uitbreiding ondergaan en illustrereneen verkorte lichaamsas. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig2.jpg" /> Figuur 2. Effect van RhoA kinase remmer op craniale neurale buis sluiting en as rek. (A) Het percentage van de embryo&#39;s die in staat waren om met succes sluiten hun craniale plooien (NTC% = percentage neurale buis sluiting) wordt vergeleken met de dosis van Y-27632 toegevoegd aan cultuur media. (B) De afstand tussen de otic blaasje en voorpoot was significant lager bij hogere doseringen van Y-27632 (p &lt;0,05).

<ol><li>Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCockroft%2C+DL+%22Mammalian+Postimplantation+Embryos+A+Practical+Approach%22">Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach</a>. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. (1990).</li>
<li>Gray, J. D., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+folate+supplementation+from+Crooked+tail+and+other+NTD-prone+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+A.+Clin.+Mol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+Atlas+of+Mouse+Development%22">The Atlas of Mouse Development</a>. , Academic Press Limited. San Diego. (1992).</li>
<li>Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+extension%2C+planar-cell-polarity+signalling+and+initiation+of+mouse+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure.</a> Development. 134, 789-799 (2007).</li>
<li>Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-environment+interactions%2C+folate+metabolism+and+the+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De mogelijkheid om de moeder, intra-uteriene factoren die los van degenen die inherent zijn aan het embryo zijn tijdens de ontwikkeling is een belangrijk instrument voor het bestuderen van alle stadia van de embryogenese. Hier hebben we hebben de effecten van een kleine molecule inhibitor van RhoA kinase op de schedel neurulatie ex utero, waardoor het verwijderen van de variabele van de maternale metabolisme van het geneesmiddel. Deze farmacologische manipulatie heeft een diepgaand effect op craniale neurulatie en convergente extensie. Gevoeligheid voor deze stof is te vergelijken tussen verschillende genetische muizenmutanten. De methode hier gepresenteerde kan ook toegepast worden op studies van andere moleculaire pathways in ontwikkeling, waardoor de directe manipulatie van cellulaire functie in embryo&#39;s met behulp van een verscheidenheid van reagentia.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Stereomicroscoop voor Dissection </td><td> Leica </td><td> M165 </td><td></td></tr><tr><td> Precisie Incubator </td><td> BTC Engineering (VK) </td><td> BTC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Roterende Bottle eenheid Cultuur </td><td> BTC </td><td> BTC 003 </td><td></td></tr><tr><td> Glazen flessen voor roterende eenheid </td><td> BTC </td><td> BTC 005 </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Rubber Bung </td><td> BTC </td><td> BTC 007 </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Rubber Cork </td><td> BTC </td><td> BTC 008 </td><td></td></tr><tr><td> Gas Bubbler Inlet </td><td> BTC </td><td> BTC 012 </td><td></td></tr><tr><td> Gas Bubbler Inlet Trap </td><td> BTC </td><td> BTC 013 </td><td></td></tr><tr><td> Gas Bubbler Outlet </td><td> BTC </td><td> BTC 014 </td><td></td></tr><tr><td> Gascilinder </td><td> TechAir </td><td></td><td> 20% O 2, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> Gas Regulator </td><td> TechAir </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Man Rat Serum </td><td> Harlan Labs </td><td> 4520 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM w / o fenolrood </td><td> Invitrogen </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ml spuit </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> Spuitfilter </td><td> Nalgene </td><td> 190-2545 </td><td></td></tr><tr><td> Grote ontleden van Schaar (Blunt tip) </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td><td></td></tr><tr><td> Extra Fine Bonn Schaar </td><td> Fijn wetenschappelijke instrumenten (FST) </td><td> 14084-08 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Dumot # 5 pincetten </td><td> FST </td><td> 11252-50 </td><td></td></tr><tr><td> Tyrode&#39;s Saline </td><td></td><td></td><td> Zoals beschreven in Cockroft 1990 </td></tr><tr><td> 10 cm Wegwerp Petri Dish </td><td> BD </td><td> 351029 </td><td></td></tr></tbody></table>

neurale buis sluiting in mouse whole embryo cultuur

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Genetische muismodellen zijn een belangrijk instrument in de studie van zoogdieren neurale buis sluiting (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). Echter, is de studie van muis embryo&#39;s in utero beperkt door ons onvermogen om direct farmacologisch de embryo&#39;s los manipuleren van de effecten van maternale metabolisme op het reagens van belang. Of het nu gaat met behulp van een klein molecuul, recombinant eiwit of siRNA, de levering van deze stoffen aan de moeder, via de voeding of door injectie zal onderwerpen deze instabiele verbindingen aan een verscheidenheid van lichamelijke afweer die hen kon verhinderen het bereiken van de embryo. Onderzoeken in culturen van hele embryo&#39;s kunnen worden gebruikt om afzonderlijke maternale van intrinsieke foetale effecten op de ontwikkeling. Hier presenteren we een methode voor het kweken van muizenembryo&#39;s met behulp van hoog verrijkt media in een roller incubator apparaat die het mogelijk maakt voor de normale neurale buis sluiting na dissectie (Crockett, 1990). Eenmaal in cultuur, embryo&#39;s kunnenworden gemanipuleerd met behulp van conventionele in-vitro-technieken die niet anders mogelijk zou zijn indien de embryo&#39;s nog in de baarmoeder. Embryo broers en zussen kunnen afgehaald worden op verschillende tijdstippen op verschillende aspecten van neurulatie, die voortkomen uit E7-7.5 (neurale plaat formatie, net voor de aanvang van neurulatie) onderzoek om E9.5-10 (aan het einde van craniale vouwen en caudale neuropore sluiting, Kaufman, 1992). In dit protocol, tonen we onze methode voor het ontleden van embryo&#39;s op tijdstippen die optimaal zijn voor de studie van craniale neurulatie. Embryo&#39;s worden ontleed in E8.5 (ca. 10-12 somities), na de inleiding van de neurale buis sluiten, maar voorafgaand aan de embryo draaien en craniale neurale vouwen sluiting, en onderhouden in cultuur tot E10 (26-28 somities), wanneer craniale neurulatie moet volledig zijn.

Een methode waardoor de directe farmacologische manipulatie van muis embryo&#39;s tijdens neurulatie dat maternale metabolisme omzeilt wordt beschreven. De techniek kan worden aangepast aan de verschillende aspecten van de neurulatie studie door het variëren van het tijdstip en farmacologische agent.

Neurale buis sluiting in Mouse Whole Embryo Cultuur

Genetische muismodellen zijn een belangrijk instrument bij de studie van de sluiting van de neurale buis bij zoogdieren (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). De studie naar de muis...

Het algemene doel van deze procedure is om de gebeurtenissen van het muisembryo te monitoren, waarbij de verlenging van de neurale as en de sluiting van de neurale buis plaatsvinden in een extra-uteriene omgeving waarin de omstandigheden gedefinieerd kunnen worden. Dit wordt bereikt door eerst de uterine hoorns te verwijderen uit de geanestheseerde drachtige muis op gestationele of embryonale dag 8.5. Vervolgens worden individuele muisembryo's uit de uterus verwijderd, waarbij de dooierzak intact blijft en een groot deel van de decidua behouden blijft.Vervolgens wordt het extra-embryonale decidua-weefsel weggesneden, waarbij de ectoplacentaire kegel intact blijft. De laatste stap van de procedure is het overbrengen van de embryo's in hun dooierzak naar roller bottles die media bevatten met of zonder de geteste farmacologische middelen, en het kweken van de embryo's gedurende 18 tot 24 uur in een incubator met continue gastoevoer. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de progressieve toevoeging van somieten, de appositie van neurale plooien en de sluiting met het draaien van het embryo in de bekende c-kromming van de foetale positie laten zien.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied, zoals welke moleculaire pathways betrokken zijn bij een normale sluiting van de neurale buis. Welke stoffen of supplementen kunnen een normale ululatie bevorderen, vooral bij embryo's met genetische mutaties die hen predisponeren voor neuralebuisdefecten of NTDs. Een visuele demonstratie van deze techniek is essentieel, aangezien de stappen bij de dissectie zeer uitdagend kunnen zijn.De embryo's zijn klein en kunnen gemakkelijk beschadigd raken; schade aan de dooierzak kan de toevoeging van somaten, de draaibeweging en tevens de ontwikkeling van het bloedvatenstelsel belemmeren, waardoor een succesvol resultaat wordt voorkomen. Bereid ter beginne het kweekmedium door serum van mannelijke ratten te ontdooien bij 37 °C. Inactiveer vervolgens het rattenserum gedurende 30 minuten bij 55 °C.Centrifugeer het vervolgens bij 10,000 RPM gedurende vijf minuten. Verwijder bij kamertemperatuur het supernatant en meng dit in een verhouding van één-op-één met fenolroodvrij DMEM met een hoog glucosegehalte. Steriliseer het medium met een spuitfilter van 0,45 micron.Isoleer de uterus en plaats deze in een Petrischaal met fysiologisch zout om de embryo's te verwijderen. Spoel eerst de uterus met fysiologisch zout om overtollig bloed te verwijderen en trim eventueel overtollig vet aan de buitenkant weg. Verplaats de uterus naar een schone schaal met tyro-saline op kamertemperatuur om de visualisatie onder een stereomicroscoop te verbeteren, terwijl de handen op de tafel worden gestabiliseerd.Gebruik een kleine schaar of fijne pincet om de baarmoeder open te pellen en elk embryo te scheiden. Steek een fijne pincet in de ruimte tussen de baarmoederwand en de decidua en pel de baarmoederwand terug met minimale spanning om ruptuur van de dooierzak te voorkomen. Richt vervolgens de decidua zo dat de placenta van u af is gericht.Maak vervolgens met de pincet een incisie langs de lijn, waarbij het donkere gedeelte van de decidua van het lichtere gedeelte wordt gescheiden. Let erop dat u niet te diep snijdt. Voltooi de scheiding van de placenta van de bovenkant van de vruchtzak.Zorg ervoor dat de ectoplacentaire kegel of EPC niet scheurt. Op dit punt zou het Riker-membraan op de dooierzak zichtbaar moeten zijn. Het verwijderen van het Riker-membraan van de dooierzak is het moeilijkste deel van de procedure en vereist geduld en een vaste hand.Om de riker voorzichtig te verwijderen zonder de onderliggende dooierzak te beschadigen, dient de volledige decidua te worden verwijderd. Knijp voorzichtig en verwijder het riker-membraan door het van de EPC af te pellen, waarbij u er op let dat de dooierzak niet wordt doorboord. Als de EPC beschadigd is of is gescheiden van de dooierzak, zullen embryo's niet normaal draaien van E 8.5 naar E 9.5.Zodra het riker-membraan is verwijderd, moet het embryo gemakkelijk zichtbaar zijn door de eierzak. Bepaal het stadium van het embryo door de somieten langs één zijde te tellen, beginnend onder de otische vesikel en eindigend bij de staart met een schaar. Knip het uiteinde van een plastic transferpipet af om deze op het embryo te gebruiken zonder de eierzak te beschadigen.Vul schone rollerflessen met één milliliter medium per embryo. Afhankelijk van het gebruikte type rollerflessen kunnen er maximaal drie tot zes embryo's in elke fles worden geplaatst. Draag de embryo's met de afgesneden pipet over naar de met medium gevulde rollerfles, waarbij zo weinig mogelijk tyros wordt meegevoerd om verdunning van het medium te voorkomen.Bevestig de rubberen stop aan de bovenkant van de glazen rolfles. Plaats de rolflessen in de rolcultuurtrommel, zodat er een nauwe afsluiting ontstaat tussen de stop en de trommel. Nadat alle flessen zijn geplaatst, moeten eventuele lege posities in de trommel met rubberen stoppers worden afgesloten.Activeer vervolgens de roller. Open daarna de premix CO2 O2-tank en stel deze in op ongeveer twee PSI, zodat het uitlaatventiel één bel per seconde afgeeft. Voor E 8.5 en E 10 embryo's moet 20%O2 en 5%CO2 worden gebruikt.Zorg ervoor dat de incubator is ingesteld op 37 °C en dek de incubator af of sluit deze, zodat de embryo's worden afgeschermd van licht. Controleer de embryo's periodiek op de vorming van somieten, de voortgang van de draaiing en de mate van sluiting van de neurale buis om de embryonale ontwikkeling te beoordelen; voeg na twee tot drie uur in kweek, indien gewenst, farmacologische inhibitoren of andere behandelingen toe. Wanneer de incubatie is voltooid, schakel dan het gas uit, stop de roller en haal de flessen uit de incubator.Breng de embryo's terug naar tyros of PBS in een Petrischaal. Onder de stereomicroscoop moet de dooierzak ballonachtig verschijnen, een hartslag moet zichtbaar zijn en de circulatie moet duidelijk waarneembaar zijn. Verwijder de dooierzak van het embryo door een gat vlakbij de EPC te knippen en de dooierzak en het amnion over het hoofd en de achterzijde van het embryo te klappen. Knip de navelstreng door om de dooierzak van het embryo te scheiden.Onderzoek tot slot het embryo op het aantal en op neurale buisdefecten, zoals open craniale plooien, onvolledige sluiting van het gezicht en/of een open caudale neuropore. Embryo's kunnen worden gestageerd volgens de Tyler-classificatie van meerdere morfogenetische veranderingen. Het uiterlijk van embryo's vóór en na roller-kweek is hier geïllustreerd op het moment van dissectie. Het embryo moet zich in een ongedraaide configuratie bevinden, waarbij de staart zich achter de hoofdlappen bevindt.Na 24 uur in cultuur zouden de embryo's het draaien hebben moeten voltooid, zodat ze zich in een C-gebogen foetale positie bevinden waarbij de staart zich vóór de kop bevindt. Deze afbeelding laat in de bovenste rij de ontwikkeling van embryo's zien zonder toevoeging van inhibitoren. De onderste rij toont het effect van farmacologische manipulatie met de row A kinase-inhibitor Y 2 76 32, een bekende inhibitor van convergente extensie tijdens alatie.Deze remmer resulteert in een verkorting van de embryo's langs de caudale as en remt de sluiting van de craniale neurale plooien. Onze gegevens tonen aan dat toenemende doses Y 2 7 6 3 2 de sluiting van de craniale plooien progressief belemmeren en de lichaamsas verkorten, in overeenstemming met de rol van downstream Wnt-signalering in craniale neurulatie en convergente extensie. Zodra de dissectietechniek onder de knie is, kan deze in 60 tot 90 minuten worden voltooid voor een nest van zes tot 12 embryo's.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van de stappen die nodig zijn om muisembryo's van gestatiedag acht en een half tot 10 te kweken voor het bestuderen van ontwikkelingsmechanismen op systeemniveau.

neural-tube-closure-in-mouse-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hele embryo cultuur techniek stelt ons in staat om de cultuur muis en rat...

De Methode van Knaagdieren Hele Embryo Cultuur met behulp van de Rotator-type Bottle Cultuur System

Deze video toont protocol de toepassing van de neurosphere test voor de isolatie en de uitbreiding van neurale stamcellen van het ganglionisch eminenties van embryonale dag 14-hersenen van muizen.

Tot vaststelling van Embryonale Mouse Neural Stem Cell Culture Met behulp van de Neurosphere Assay

Isolatie van embryonale neurale lijst van de neurale buis vergemakkelijkt het gebruik...

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

De craniale mesenchym ondergaat dramatische morfogenische bewegingen die waarschijnlijk zorgt voor een drijvende kracht voor verhoging van de neurale...

Een Explantatie Assay voor het beoordelen van cellulair gedrag van de craniale mesenchym

Hier ontwikkelen we de instrumenten die nodig zijn voor...

Ex vivo Live-Imaging van Single Cell Divisies in Muis neuroepithelium

Serum gebruikt in embryocultures bevat onbekende componenten die het resultaat van experimenten vooral in studies met signalering interacties beïnvloeden. Hier gebruikte we een serumvrij zuurstof kweeksysteem aantonen dat mid-dracht muizenembryo's gekweekt gedurende 16-40 uur vertonen morfologische ontwikkeling vergelijkbaar embryo ontwikkeling in utero.

Muis embryonale ontwikkeling in een Serumvrij Hele Embryo Cultuur System

Cultuur van het hele embryo van zoogdieren (WEC) wordt veel gebruikt in de teratology en ontwikkelingsbiologie. Direct gecentrifugeerd rattenserum wordt vaak geleverd als medium voor zowel muis- als ratten-WEC. In deze video demonstreren we ons standaardprotocol voor de bereiding van hoogwaardig rattenserum dat geschikt is voor zoogdier-WEC.

Voorbereiding van de Rat Serum Geschikt voor zoogdieren Hele Embryo Cultuur

Hier introduceren wij een nieuwe microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de E13 muis embryo ganglionaire eminentie.

Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen

Dit protocol beschrijft de dissectie en de cultuur van craniale neurale Crest cellen van muismodellen, voornamelijk voor de studie van de Celmigratie. We beschrijven de gebruikte technieken voor Live Imaging en de analyse van veranderingen in snelheid en celvorm.

Dissectie, cultuur en analyse van primaire Cranial neurale Crest cellen van de muis voor de studie van neurale Crest Celdelaminatie en migratie

Dit protocol is ontwikkeld om de mechanische eigenschappen van neuraal plaatweefsel tijdens de neurulatie van kuikenembryo's longitudinaal te monitoren. Het is gebaseerd op de integratie van een Brillouin-microscoop en een incubatiesysteem op het podium, waardoor live mechanische beeldvorming van neuraal plaatweefsel in ex ovo gekweekte kuikenembryo's mogelijk wordt.

Monitoring van de mechanische evolutie van weefsel tijdens het sluiten van de neurale buis van kuikenembryo's

Leer neurale buis sluiting bestuderen in muizenembryo's met behulp van whole embryo cultuur. Deze methode maakt directe farmacologische manipulatie mogelijk zonder moederlijke metabolisme.

Neurale buis sluiting in Mouse Whole Embryo Cultuur

Meer video's verkennen