Waarom is het meten van de basale luminescentie belangrijk vóór de toevoeging van het geurelement?

Het meten van de basale luminescentie stelt een basissignaal van cAMP vast om specifieke receptoractivatie te onderscheiden van achtergrondruis, wat een nauwkeurige kwantificering van door odorant geïnduceerde veranderingen waarborgt.

Hoe ondersteunt het isoleren van het odorant als de onafhankelijke variabele de validatie van het doelwit?

Door alleen de concentratie van de geurstof te variëren terwijl de receptorexpressie en de biosensorwaarden constant worden gehouden, isoleert de assay ligand-specifieke effecten, waardoor veranderingen in luminescentie duidelijk kunnen worden toegeschreven aan receptoractivatie.

Wat maken real-time luminescentiemetingen mogelijk in GPCR-signaleringsstudies?

Real-time luminescentie-tracking biedt kinetische resolutie van de cAMP-productie, waardoor onderzoekers het begin, het hoogtepunt en de duur van receptor-signalering kunnen beoordelen voor mechanistische profilering.

Waarom zijn replicatie-eisen belangrijk voor crossfunctionele samenwerking bij de ontwikkeling van assays?

Replicatie over wells en experimenten waarborgt de consistentie van het signaal, wat essentieel is voor het met vertrouwen in de betrouwbaarheid van de gegevens overdragen van de assay tussen teams voor discovery biology en screening.

Welke statistische analyse is vereist voordat deze assay in een screeningscascade wordt geïmplementeerd?

Vóór de implementatie moeten dosis-responscurves worden gegenereerd en geanalyseerd voor de bepaling van de EC50 en de berekening van de Z'-factor om de robuustheid van de assay en de geschiktheid voor hit-identificatie te bevestigen.

Measuring Odorant Receptor Activation using a Real-Time Cyclic Adenosine Monophosphate Assay

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurowetenschap

0 weergaven • 3:30 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Take a multiwell plate containing transfected mammalian cells.

These cells express the olfactory neuron's odorant receptor (OR), a G-protein-coupled receptor, along with a cAMP biosensor containing a cAMP binding domain fused to a mutant luciferase.

Remove the medium and wash with buffer to remove the residual medium.

Add a buffer containing a cAMP biosensor substrate. Incubate to facilitate substrate uptake into the cells.

Using a chemiluminescence plate reader, measure the basal luminescence of the cells.

Add increasing concentrations of the test odorant to the wells, leaving one well untreated as a control.

The odorant binds to the OR and triggers a signaling cascade that produces cAMP.

This cAMP binds to the biosensor's binding domain, activating luciferase, which interacts with the substrate to emit light.

Measure the luminescence in real time. An increase in luminescence with higher odorant concentrations indicates OR activation by the odorant.

Before stimulation, observe the transfected cells under a phase-contrast microscope to ensure a proper confluence of 50% to 80% per well before returning to the incubator. Then, prepare stimulation medium by adding 10 millimolar HEPES and 5 millimolar glucose to Hank's Balanced Salt Solution. Thaw 55-microliter aliquots of real-time cyclic AMP assay substrate reagent aliquots on ice.

Prepare 2% equilibration solution by mixing 55 microliters of the substrate reagent and 2,750 microliters of stimulation medium. After spreading out a thick layer of paper towels on the bench, gently and repeatedly tap the plate upside down on the paper towels so that the transfection medium is absorbed by the paper towels. Wash the cells by pipetting 50 microliters of stimulation medium to each well.

Gerelateerde video's

0 Bekeken

Laatst bijgewerkt: 1 augustus 2026

Measuring Odorant Receptor Activation using a Real-Time Cyclic Adenosine Monophosphate Assay

Overzicht

Belangrijkste studiecomponenten

Wetenschapsgebied

Achtergrond

Doel van de studie

Gebruikte methoden

Belangrijkste resultaten

Conclusies

Veelgestelde vragen

Industriële relevantie voor directie

Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D

Vroege ontdekking & targetvalidatie

Screening & Assay-ontwikkeling

Translationeel & Preklinisch Onderzoek

Integratie van Pijplijn & Workflow

Operationele & Bedrijfsimpact

Overwegingen voor implementatie

Veelgestelde vragen over biofarmacie

Lokalisatie van Receptorgenen van Reukstof in Locustantenne door RNA In situ Hybridisatie

Real-Time In Vitro Monitoring van Odorant Receptor activering door een Odorant in de damp-fase

Real-Time Monitoring van Aurora kinase A Activatie met behulp van Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Het testen van oppervlakte-expressie van receptoren Chemosensory in heterologe cellen

Imaging G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR)-gemedieerde Signaling Gebeurtenissen die controle Chemotaxis van Dictyostelium discoideum

Odorant-geïnduceerde responsen Opgenomen van olfactorische receptor neuronen met behulp van de zuignap Pipet Techniek

Real-Time Monitoring of Odorant Receptor Activation in Recombinant Cells

Drug-geïnduceerde Overgevoeligheid van adenylylcyclase: Assay stroomlijning en miniaturisatie voor Small Molecule en siRNA screening Toepassingen

High-throughput analyse van zoogdieren reukreceptoren: Meting van de Receptor Activering via Luciferaseactiviteit

Het meten van G-eiwit-gekoppelde Receptor Signaling via Radio-gelabeld GTP Binding