Profiling Voltage-gated kalium kanaal mRNA expressie in Nigral Neuronen met behulp van Single-cell RT-PCR-technieken

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van messenger-RNA's in individuele neuronen. Dit wordt bereikt door middel van patch-klemmen en het registreren van individuele neuronen, waarna het cytoplasma van elk geregistreerd neuron volledig wordt geaspireerd uit het Mr.mRNA en het cytoplasma. Er wordt cDNA gemaakt en geamplificeerd via PCR.

Uiteindelijk kunnen specifieke mRNA's voor receptoren, ionkanalen en enzymen worden gedetecteerd via een conventioneel gel-imagingsysteem. Mijn naam is, ik werk bij het University of Tennessee Health Science Center. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de hoeveelheid mRNA in een enkele neuron extreem klein is en gemakkelijk verloren gaat.

Begin dit protocol door een vibratoom te gebruiken om coronale hersensecties van 300 micrometer dik te snijden die het mid-rostrale deel van de substantia nigra bevatten. De hersenen kunnen worden geïsoleerd van Sprague-Dawley ratten in de leeftijd van 15 tot 40 dagen. De procedure voor het snijden van de secties wordt ijskoud uitgevoerd in een snijoplossing met een hoog sucrosegehalte, geoxygeneerd met 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide, bij een pH van 7.4; incubeer de secties vervolgens in kunstmatig hersenruggenmergvloeistof dat wordt belucht met een gasmengsel van 5% koolstofdioxide en 95% zuurstof.

Houd de temperatuur op 34 °C en laat de coupes daar 45 minuten liggen. Bewaar de hersencoupes vervolgens bij kamertemperatuur tot aan de opname. Begin met het overbrengen van één hersencoupe naar een patchclamp-opnamekamer.

Continu doorstroomd met geoxygeneerd kunstmatig cerebrospinaal vocht bij 32 °C. Vul de patchpipetten met autoclaaf-behandelde intracellulaire oplossing bereid met DNA- en RNA-vrij water. Breng een gevulde pipet in het bad.

Controleer of de weerstand tussen de twee en drie mega ohm ligt. Lokaliseer eerst de substantia nigra aan de hand van de kenmerkende anatomische ligging. Selecteer vervolgens met behulp van namar-optica en een 60 x objectief grote cellen in de SNC en SNR voor registratie.

Dit zijn zonder twijfel mogelijke dopaminerge of GABAerge neuronen. Gebruik een conventionele giga-seal whole-cell configuratie voor current clamp- en voltage clamp-metingen. Deze registraties moeten over het algemeen in minder dan vijf minuten worden uitgevoerd om mRNA-degradatie te minimaliseren.

Binnen ongeveer een minuut is het mogelijk om elektrofysiologische vingerafdrukken van de neuronen van belang te verkrijgen door enkel hun membraan- en spiking-eigenschappen te registreren. Nadat de gegevens van een neuron van belang zijn verkregen, wordt het cytoplasma voorzichtig met de mond weggezogen. De nauwe afsluiting mag niet worden verbroken, anders.

Extracellulair debris, waaronder mRNA, kan in de patchpipet worden gezogen en de celinhoud contamineren. Breng de celinhoud over in een 0,2 milliliter PCR-buisje door de tip van de pipet af te breken en een lichte positieve druk uit te oefenen. Plaats het buisje na afloop onmiddellijk in een vriezer van -20 °C om contaminatie door extracellulair debris dat mRNA's kan bevatten uit te sluiten.

Maak een negatieve controle door de inhoud van een patchpipet op te vangen die in het weefsel is gebracht zonder aspiratie toe te passen. Nadat de celinhoud van 10 tot 20 neuronen is verzameld, wordt de reverse transcriptie-reactie onmiddellijk gestart. Om de degradatie van de mRNAs te minimaliseren, wordt eerst elk contaminerend genomisch DNA gedigesteerd met DNase, gedurende vijf minuten bij 25 °C.

Deze stap is cruciaal voor het verminderen van potentiële fout-positieven en mag niet worden overgeslagen. Inactiveer vervolgens de DNA's met 1,2 µL 25 mM EDTA en incubeer de monsters gedurende vijf minuten bij 70 °C. Gebruik nu een commercieel verkrijgbare kit om cDNA te synthetiseren om te verifiëren dat het genomisch DNA volledig is verwijderd.

Voer voor elk monster een controlereactie uit zonder reverse transcriptase, terwijl alle overige reactiecomponenten gelijk blijven. Bewaar de producten bij -20 °C totdat ze nodig zijn voor het PCR-ontwerp.

Primers volgens de sequenties in Genbank; maak indien mogelijk T intro spanning prime repairs om detectie van genomisch DNA-contaminatie te vergemakkelijken. Om de effectiviteit van de primerparen te controleren, worden deze in de eerste fase getest op cDNA van het gehele brein. PCR-amplificeer 5 µL van de 30 µL cDNA's gedurende 35 cycli met gebruik van een standaard thermische cyclusprotocol.

Voor de tweede fase wordt één µL van het PCR-product uit de eerste fase geamplificeerd met dezelfde primers, waarbij een licht aangepast cyclusprofiel wordt gebruikt. Scheid de producten vervolgens op een 2,5% AGROS-gel en visualiseer deze met ethidiumbromide of GelGreen. Snijd onder UV-licht de positieve DNA-banden uit en sequenceer deze met behulp van een commercieel verkrijgbare kit om het DNA te verzamelen.

De elektrofysiologische kenmerken van neuronen in de substantia nigra, pars compacta en pars reticulata werden vergeleken. GABAerge SNR-neuronen vertoonden spontane spiking met een hogere frequentie van rond de 10 hertz. De spikes hadden een basisduur van ongeveer één milliseconde bij injectie van hyperpolariserende stroom.

SNR GABAerge neuronen vertoonden een subtiele SAG-respons, wat wijst op een zwak geactiveerde stroom. In contrast hiermee vertoonden de nigrodopaminerge neuronen spontane spikes met een lage frequentie en een basisduur van ongeveer drie milliseconden. Dopaminerge neuronen vertoonden ook een uitgesproken SAG als reactie op hyperpolarisatie, wat wijst op een sterke expressie van IH-stroom in SNR GABAerge neuronen, maar niet in dopaminerge neuronen.

Single-cell RT-PCR detecteerde mRNA voor glutaminezuurdecarboxylase 1, een sleutelenzym bij de GABA-synthese. In contrast hiermee detecteerde single-cell RT-PCR mRNA voor tyrosinehydroxylase, een sleutelenzym voor dopamine-synthese, in geïdentificeerde SNC- en SNR-dopaminerge neuronen, maar niet in GABAerge neuronen.

Vervolgens werd single-cell RT-PCR gebruikt om de expressie van spanningsgestuurde KV3-kanaalsubunits te profileren, die de eigenschappen van spanningsgestuurde kaliumkanalen beïnvloeden. In het voorbeeld van SNR gaba werden neuronale mRNA's voor KV3.1, 3.2, 3.3 en 3.4 uitsluitend gedetecteerd in een voorbeeld van een SNRD-neuron. KV3.2, 3.3 en 3.4 werden aangetroffen in de samengevoegde gegevens.

KV 3.1 werd vaker aangetroffen in GABAerge neuronen in de SNR dan in dopaminerge neuronen in de substantia nigra, wat wijst op een hoger expressieniveau van KV 3.1 in de snelvurende GABAerge SNR-neuronen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om handschoenen te dragen en de instrumenten na gebruik schoon te houden. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de neurowetenschappen om de expressie en functie van receptoren en ionkanalen in het zenuwstelsel te onderzoeken.