Profiling Voltage-gated kalium kanaal mRNA expressie in Nigral Neuronen met behulp van Single-cell RT-PCR-technieken

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van messenger-RNA's in individuele neuronen. Dit wordt bereikt door middel van patchclamping en het registreren van individuele neuronen, waarna het cytoplasma van elk geregistreerd neuron volledig wordt geaspireerd om het mRNA uit het cytoplasma te verkrijgen. Er wordt cDNA gemaakt en geamplificeerd via PCR.

Uiteindelijk kunnen specifieke mRNA's voor receptoren, ionkanalen en enzymen worden gedetecteerd via een conventioneel gel-beeldstelsel. Mijn naam is, ik werk bij het University of Tennessee Health Science Center. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de hoeveelheid mRNA in een enkele neuron extreem klein is en gemakkelijk verloren gaat.

Begin dit protocol door een vibratoom te gebruiken om coronale hersensnijden van 300 micrometer dik te maken die het mid-rostrale deel van de substantia nigra bevatten. Hersenen kunnen worden geïsoleerd van 15 tot 40 dagen oude Sprague-Dawley ratten. De procedure voor het snijden van de coupes wordt ijskoud uitgevoerd in een sucrose-rijke snijoplossing, oxygenatie met 95% zuurstof en 5% kooldioxide, bij een pH van 7,4; incubeer de coupes in kunstmatig cerebrospinaal vocht dat is gebubbelled met een gasmengsel van 5% kooldioxide en 95% zuurstof.

Houd de temperatuur op 34 °C en laat de plakjes daar 45 minuten rusten. Bewaar de hersenplakjes vervolgens bij kamertemperatuur tot aan de registratie. Begin met het overbrengen van één hersenplakje naar een patchclamp-registratiekamer.

Continu doorstroomd met oxygenatie-kunstmatig cerebrospinaal vocht bij 32 °C. Vul de patchpipetten met geautoclaveerde intracellulaire oplossing bereid met DNA- en RNA-vrij water. Laat een gevulde pipet in het bad zakken.

Controleer of de weerstand tussen twee en drie mega ohm ligt. Lokaliseer eerst de substantia nigra aan de hand van de kenmerkende anatomische locatie. Selecteer vervolgens met behulp van namar-optiek en een 60x objectief grote cellen in de SNC en SNR voor registratie.

Dit zijn zonder twijfel mogelijke dopaminerge of GABAerge neuronen. Gebruik een conventionele giga-seal whole-cell configuratie voor current-clamp en voltage-clamp metingen. Deze opnames moeten over het algemeen in minder dan vijf minuten worden uitgevoerd om mRNA-degradatie te minimaliseren.

Binnen ongeveer een minuut is het mogelijk om elektrofysiologische vingerafdrukken van de neuronen van belang te verkrijgen door enkel hun membraan- en spiking-eigenschappen te registreren. Nadat de gegevens van een neuron van belang zijn verkregen, dient het cytoplasma voorzichtig met de mond te worden weggezogen. De nauwe afsluiting mag niet worden verbroken, aangezien dit anders.

Extracellulair debris, waaronder mRNA, kan in de patchpipet worden gezogen en de celinhoud contamineren. Expelleer de celinhoud in een PCR-buisje van 0,2 milliliter door de pipetpunt af te breken en een lichte positieve druk uit te oefenen. Plaats het buisje na afloop onmiddellijk in een vriezer van -20 °C om contaminatie door extracellulair debris dat mRNA's kan bevatten uit te sluiten.

Maak een negatieve controle door de inhoud van een patchpipet op te vangen die in het weefsel is gebracht zonder aspiratie toe te passen. Begin direct met de reverse transcriptie-reactie na het verzamelen van de celinhoud van 10 tot 20 neuronen. Om degradatie van de mRNAs te minimaliseren, begint men met het verteren van eventueel contaminerend genomisch DNA met DNase I gedurende vijf minuten bij 25 °C.

Deze stap is cruciaal voor het verminderen van potentiële fout-positieven en mag niet worden overgeslagen. Inactiveer vervolgens het DNA met 1,2 µL 25 mM EDTA en incubeer de monsters vijf minuten lang bij 70 °C. Gebruik nu een commercieel beschikbare kit om CD NA te synthetiseren om te verifiëren dat het genomisch DNA volledig is verwijderd.

Voer voor elk monster een controle-reactie uit zonder reverse transcriptase, terwijl alle overige reactiecomponenten gelijk blijven. Bewaar de producten bij -20 °C tot ze nodig zijn voor het PCR-ontwerp.

Gebruik primers volgens de sequenties in Genbank en maak, indien mogelijk, intronspanning-primers om detectie van genomisch DNA-contaminatie te vergemakkelijken. Om de effectiviteit van de primerparen te controleren, worden deze in de eerste fase getest op cDNA van het hele brein. Amplificeer via PCR 5 µL van de 30 µL cDNA's gedurende 35 cycli met behulp van een standaard thermische cyclingsprotocool.

Voor de tweede fase wordt één microliter van het PCR-product uit de eerste fase geamplificeerd met dezelfde primers en wordt een licht aangepast cyclingschema gebruikt. Scheid de producten vervolgens op een 2,5% AGROS-gel en visualiseer deze met AUM-bromide of gel-green. Snijd onder UV-licht de positieve DNA-banden uit en sequenceer deze met behulp van een commercieel beschikbare kit om het DNA te verzamelen.

De elektrofysiologische kenmerken van neuronen in de substantia nigra, pars compacta en pars reticulata werden vergeleken. GABAerge neuronen in de SNR vertoonden spontane spikes met een hogere frequentie van ongeveer 10 hertz. De spikes hadden een basisduur van ongeveer één milliseconde bij injectie van hyperpolariserende stroom.

GABAerge neuronen in de SNR vertoonden een subtiele SAG-respons, wat wijst op een zwak geactiveerde stroom. In contrast hiermee vertoonden de nigrodopaminerge neuronen spontane spikes met een lage frequentie en een basisduur van ongeveer drie milliseconden. Dopaminerge neuronen vertoonden ook een uitgesproken SAG als reactie op hyperpolarisatie, wat duidt op een sterke expressie van de IH-stroom in GABAerge neuronen in de SNR, maar niet in dopaminerge neuronen.

Single-cell RT-PCR detecteerde mRNA voor glutaminezuurdecarboxylase 1, een sleutelenzym bij de GABA-synthese. In contrast hiermee werd mRNA voor tyrosinehydroxylase, een sleutelenzym voor dopaminesynthese, gedetecteerd in geïdentificeerde SNC- en SNR-dopaminerge neuronen, maar niet in GABAerge neuronen. Single-cell RT-PCR detecteerde mRNA voor tyrosinehydroxylase, een sleutelenzym voor dopaminesynthese.

Vervolgens werd single-cell RT-PCR gebruikt om de expressie van spanningsafhankelijke KV3-kanaalsubeenheden te profileren, die de eigenschappen van spanningsgestuurde kaliumkanalen beïnvloeden. In het voorbeeld van SNR-gaba werden neuronale mRNA's voor KV 3.1, 3.2, 3.3 en 3.4 uitsluitend gedetecteerd in een voorbeeld van een SNR-DA-neuron. KV 3.2, 3.3 en 3.4 werden gedetecteerd in gepoolde gegevens.

KV 3.1 werd vaker gedetecteerd in GABAerge neuronen van de SNR dan in dopaminerge neuronen van de substantia nigra, wat duidt op een hoger expressieniveau van KV 3.1 in de snelvuur GABA-neuronen van de SNR. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om handschoenen te dragen en de instrumenten na gebruik vrij van contaminatie te houden. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de neurowetenschappen om de expressie en functie van receptoren en ionkanalen in het zenuwstelsel te onderzoeken.