Immunofluorescent Staining of Neuronal Populations in the Embryonic Murine Gastrointestinal Tract
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 2:58 min • July 8th, 2025
Take a fixed, transgenic embryonic mouse gastrointestinal tract at the desired developmental stage.
The gastrointestinal tract's enteric nervous system includes enteric neurons and cholinergic neurons expressing choline acetyltransferase.
These cholinergic neurons also express a fluorescent protein driven by the choline acetyltransferase promoter.
Incubate the tract with a non-ionic detergent and proteins to permeabilize cells and prevent non-specific antibody binding.
Replace with primary antibodies. Incubate for the antibodies to bind their target proteins in neurons, respectively.
Remove the unbound antibodies and wash with buffer.
Incubate with fluorophore-conjugated secondary antibodies to specifically bind the primary antibodies bound to target proteins.
Remove the excess antibodies and wash with buffer.
Immerse the labeled tract in mounting media containing a nuclear dye to stain the nuclei. Now, mount a coverslip.
Using confocal microscopy, visualize and analyze the distribution of cholinergic neurons in the gastrointestinal tract.
Place the GI tracts into a 0.2-milliliter tube containing blocking solution, consisting of 1x PBS, 3% bovine serum albumin, 0.1 Triton X-100, and rock for 1 hour at room temperature. After blocking, aspirate the blocking solution with a fine-tipped Pasteur pipette and replace with the optimal dilution of primary antibodies diluted in blocking solution.
Incubate for either four hours at room temperature or overnight at 4 degrees Celsius on the rocking platform. Following the primary antibody incubation, aspirate the antibody solution and rinse the GI tracts in PBS three times for five minutes each, and then for one hour at room temperature with rocking.
After the last wash, replace the PBS with fluorophore-conjugated secondary antibodies diluted in blocking solution, and place the tubes on the rocking platform in the dark for four hours at room temperature, or overnight at 4 degrees Celsius.
After washing the GI tracts as before, place a few drops of fluorescence mounting media with DAPI onto a glass slide, then, immerse the GI tract into the mounting medium and add a cover glass. Finally, capture images of each fluorophore using a confocal microscope, then perform computer-aided image analysis using appropriate software.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het visualiseren van cholinerge neuronen in het enterisch zenuwstelsel van transgene embryonale muizen. De techniek maakt gebruik van immunofluorescentiekleuring en confocale microscopie om de distributie van deze neuronen in het maag-darmkanaal te analyseren.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Het enterisch zenuwstelsel speelt een cruciale rol bij de gastro-intestinale functie.
- Cholinerge neuronen zijn belangrijk voor de neurotransmissie in dit systeem.
- Transgene modellen maken specifieke labeling van deze neuronen mogelijk.
- Immunofluorescentie is een krachtige techniek voor het visualiseren van cellulaire componenten.
Doel van de studie
- Om cholinerge neuronen in het gastro-intestinale tract te visualiseren en te analyseren.
- Om de distributie van deze neuronen tijdens de ontwikkeling te begrijpen.
- Om confocale microscopie te gebruiken voor gedetailleerde beeldvorming.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van transgene embryonale gastro-intestinale tracts van muizen.
- Gebruik van een niet-ionisch detergent voor celpermeabilisatie.
- Toepassing van primaire en secundaire antilichamen voor immunofluorescentie.
- Confocale microscopie voor visualisatie en analyse van gelabelde neuronen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle labeling van cholinerge neuronen in het gastro-intestinale tract.
- Duidelijke visualisatie van de neuronale distributie met behulp van confocale microscopie.
- Effectief gebruik van immunofluorescentietechnieken voor neuronale analyse.
- Inzichten in de ontwikkelingsstadia van enterische cholinerge neuronen.
Conclusies
- De methode biedt een betrouwbare manier om cholinerge neuronen in het enterische zenuwstelsel te bestuderen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de gastro-intestinale neurobiologie.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze techniek voor verdere exploratie van neuronale functies.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Immunofluorescente kleuring van neuronale populaties in het embryonale gastrointestinale tract van muizen maakt een precieze visualisatie en kwantificering van enterische neuronale subtypen tijdens de ontwikkeling mogelijk. Deze mogelijkheid ondersteunt vroege ontdekkingsteams bij het valideren van neuronale targets en het begrijpen van ontwikkelingspaden die relevant zijn voor gastrointestinale aandoeningen. De methode verhoogt het voorspellend vertrouwen bij ziektemodellering en informeert risicogebaseerde portfoliobeslissingen voor neurogastroenterologische programma's.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroegtijdige ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar de distributie van neuronale subtypes en de timing van de ontwikkeling in het enterische zenuwstelsel.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door de aanwezigheid en lokalisatie van cholinerge neuronen te verduidelijken.
- Faciliteert functionele targetvalidatie voor geneesmiddelenonderzoek gerelateerd aan enterische neuronen.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde neuronale weefselsystemen voor voor downstream fenotypische screeningworkflows.
- Standaardiseert immunofluorescentieprotocollen om reproduceerbaarheid en kwantitatieve imaging-outputs te waarborgen.
- Maakt een betrouwbare beoordeling mogelijk van de effecten van verbindingen op neuronale populaties in ex vivo modellen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt de ontwikkeling van neuronale mapping uit met ziekterelevante preklinische modellen voor translationele continuïteit.
- Ondersteunt de identificatie van biomarkers door ruimtelijke en kwantitatieve analyse van neuronale markers mogelijk te maken.
- Biedt mechanistische inzichten die de risico-gecorrigeerde voortgang van neurogastroenterologische assets informeren.
Integratie van pipeline en workflow
Deze immunofluorescentie-workflow is geïntegreerd in het vroege continuüm van discovery tot preklinisch onderzoek en ondersteunt zowel de validatie van targets als translationeel onderzoek in de enterische neurowetenschappen.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetoetsing mogelijk op het gebied van specificatie van neuronale subtypen en pathway-mapping in de ontwikkelende darm.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve imaging-outputs voor de vergelijkende analyse van experimentele condities.
- Analytics: Levert confocale beelden met een hoge resolutie en kwantitatieve gegevens over de neuronale distributie voor een robuuste statistische analyse.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen bevindingen uit de ontwikkelingsbiologie en preklinische ziektemodellen door relevante neuronale populaties in kaart te brengen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerd, herbruikbaar protocol voor de visualisatie van enterische neuronen over meerdere projecten en teams heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij de validatie van neuronale targets en vermindert mechanistische ambiguïteit in onderzoek naar de darm-hersenas.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare immunofluorescentie-workflows voor adoptie door verschillende teams.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming en kapitaalallocatie door vroeg in de pipeline robuust biologisch bewijs te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neurogastro-enterologische activa mogelijk op basis van gevalideerde neuronale fenotypen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in immunofluorescentie, confocale microscopie en het behandelen van neuraal weefsel.
- Vereist toegang tot hoogwaardige antilichamen, beeldvormingsplatforms en software voor beeldanalyse.
- Maakt protocolstandaardisatie noodzakelijk voor reproduceerbaarheid tussen teams en studies.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende ontwikkelingsstadia of neuronale subtypen.
- Afhankelijk van de beschikbaarheid van transgene modellen die fluorescentiemarkers tot expressie brengen onder specifieke promotoren.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Identificatie van de kritische Voorwaarden voor Immunokleuring in de erwtenbladluis Embryo's: Toenemende Tissue permeabiliteit en Afnemende Achtergrond kleuring
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het beoordelen van Primary neurogenese in
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Immunostaining van Whole-Mount Retinas met de CLARITY Tissue Clearing Method
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolating Enteric Glial Cells From the Submucosa and Lamina Propria of a Mouse
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Immunofluorescence Staining for Visualizing Proliferated Neural Stem Cells in Mouse Brain Sections
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Immunostaining of Neurons in Mouse Brain Slices Following Fluorescence In Situ Hybridization
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een kwantitatieve cel-migratie test voor Muriene Enterisch neurale voorlopercellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Immunokleuring om Murine Enteric Nervous System Development Visualiseer
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Verbeterde Swiss-rolling Techniek voor darmweefsel Voorbereiding voor Immunohistochemische en Immunofluorescentie Analyses
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026