Generation of Spontaneous and On-Demand Ictal Events in Mouse Brain Cortical Slices
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 3:10 min • July 8th, 2025
Take a cortical slice from a transgenic mouse brain that expresses light-activated cation channels in excitatory pyramidal neurons of the cortex.
Secure the slice in a recording chamber and perfuse it with artificial cerebrospinal fluid to maintain tissue viability.
Insert a recording electrode into the superficial cortical layer and record baseline neuronal activity.
Introduce a seizure-inducing drug that blocks voltage-gated potassium channels, preventing potassium outflow and maintaining the neurons in a hyperexcitable state.
The hyperexcitable neurons spontaneously generate bursts of action potentials, termed ictal events, for a prolonged duration.
To generate ictal events on-demand, apply a brief light pulse to activate the cation channels on the excitatory pyramidal neurons.
The resulting cation influx generates action potentials, triggering the release of excitatory neurotransmitters.
These neurotransmitters bind to receptors on postsynaptic neurons, causing an influx of cations.
The influx results in bursts of action potential, generating ictal events for a short duration.
In this procedure, cut out lens paper that is slightly larger than the brain slice. Use a wide bore pipette or a detailing brush to transfer a brain slice onto the cut out lens paper that is held in place using a dental tweezer. Then, transfer the lens paper with a brain slice to the recording chamber and secure it in position with a harp screen.
Subsequently, perfuse the brain slice in the recording chamber with carbogenated ACSF at 35 degrees Celsius, at a rate of three milliliters per minute. Use a digital thermometer to ensure the recording chamber is 33 to 36 degrees Celsius. Then, backfill the glass electrodes with 10 microliters of ACSF, using a Hamilton syringe.
Under the 20 times stereomicroscope, guide the recording glass electrode into the superficial cortical layer 2/3, using manual manipulators. View the electrical activity of the brain slice with standard software. To induce electrographic seizure-like activities, perfuse the brain slice with ACSF containing 4-AP at 100 micromolar. View the electrical activity of the brain slice with standard software.
To generate electrographic seizure-like events using optogenetic strategy on the brain slices from optogenetic mice, use a manual manipulator to position a 1,000 micron core diameter optical fiber directly above the recording region. Apply a brief pulse of blue light to initiate an ictal event.
Overzicht
Deze studie demonstreert een optogenetische benadering om ictale events te induceren in corticale coupes van transgene muizen. Door gebruik te maken van lichtgeactiveerde kationkanalen kunnen onderzoekers de neuronale exciteerbaarheid manipuleren en epileptische activiteiten observeren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Optogenetica
Achtergrond
- insulten worden gekenmerkt door hyperexciteerbare neuronale activiteit.
- Optogenetica maakt precieze controle van neuronale vuring mogelijk met behulp van licht.
- Transgene muizen die lichtgeactiveerde kanalen tot expressie brengen, bieden een model voor het bestuderen van insulten.
- Spanningsafhankelijke kaliumkanalen spelen een cruciale rol bij de neuronale exciteerbaarheid.
Doel van de studie
- Om de mechanismen te onderzoeken die ten grond liggen aan ictale gebeurtenissen in corticale neuronen.
- Om optogenetische technieken te gebruiken voor het induceren van gecontroleerde epileptische activiteit.
- Om de effecten van farmacologische middelen op de neuronale exciteerbaarheid te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van corticale coupes van transgene muizen.
- Registratie van neuronale activiteit met glaselektroden.
- Toediening van een epileptisch-inducerend middel (4-AP) om de exciteerbaarheid te verhogen.
- Gebruik van optische vezels voor het afgeven van lichtpulsen voor optogenetische activatie.
Belangrijkste resultaten
- Inductie van ictale gebeurtenissen door lichtactivatie van kationkanalen.
- Demonstratie van langdurige bursts van actiepotentialen in hyperexciteerbare neuronen.
- Succesvolle manipulatie van neuronale activiteit met behulp van farmacologische en optogenetische methoden.
- Observatie van neurotransmitterafgifte en de effecten hiervan op postsynaptische neuronen.
Conclusies
- Optogenetische technieken bieden een krachtig instrument voor het bestuderen van seizure-dynamiek.
- Farmacologische middelen kunnen de neuronale exciteerbaarheid en het ontstaan van ictale events moduleren.
- Deze aanpak vergroot ons begrip van de mechanismen van insulten in corticale neuronen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Deze optogenetische methode maakt een precieze, on-demand inductie van epileptische activiteit in corticale coupes mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie bij de validatie van targets voor epilepsie. Door farmacologische hyperexcitabiliteit te combineren met lichtgestuurde neuronale activatie, biedt het een reproduceerbaar platform voor het evalueren van de effecten van antiepileptische verbindingen op de hyperexcitabiliteit van netwerken. Deze aanpak vergroot de voorspellende betrouwbaarheid in de vroege ontdekkingsfase door de modulatie van neuronale exciteerbaarheid te koppelen aan meetbare outputs van ictale events.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen met betrekking tot neuronale exciteerbaarheid en de dynamiek van epileptische netwerken.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie mogelijk van ionkanaal- en receptor-targets die betrokken zijn bij hyperexciteerbaarheid.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolios door de effecten van verbindingen op spontane en opgewekte ictale gebeurtenissen te kwantificeren.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert kwantificeerbare elektrographische epileptische events als fenotypische readout voor het screenen van verbindingen.
- Reproduceerbaarheid: Gestandaardiseerde lichtpulsen en drugperfusiecondities maken een consistente inductie van events mogelijk over verschillende replicates.
- Schaalbaarheid: Compatibel met multi-electrode array-systemen voor een verhoogde throughput bij de identificatie van lead-verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Modelleert corticale hyperexcitabiliteit die relevant is voor focale epilepsiesyndromen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro mechanistische bevindingen en in vivo preklinische werkzaamheidsstudies.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert go/no-go-beslissingen op basis van dosisafhankelijke onderdrukking van optisch opgewekte ictale gebeurtenissen.
Integratie van pijplijn & workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie en vormt een mechanistische brug naar de preklinische evaluatie van antiepileptische kandidaten.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetests van epileptische mechanismen via gecontroleerde inductie van hyperexcitabelen netwerktoestanden.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve elektrographische resultaten voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op neuronale synchronie.
- Analytica: Maakt meting van de frequentie, duur en amplitude van ictal events mogelijk als belangrijke farmacodynamische uitkomstmaten.
- Translationeel onderzoek: Verbindt excitabiliteitsmodulatie op snede-niveau met de vatbaarheid voor epileptische aanvallen van het gehele netwerk.
- Bedrijfbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar optogenetisch-farmacologisch platform voor de validatie van epilepsie-doelen over diverse projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in de pathogenese van insulten door precieze temporele en ruimtelijke controle van neuronale activatie.
- Operationele waarde: Standardiseert de inductie van insulten via gedefinieerde lichtpulsen en farmacologische concentraties, wat de reproduceerbaarheid tussen laboratoria verbetert.
- Strategische waarde: Verhoogt de kapitaalefficiëntie door vroege detectie mogelijk te maken van verbindingen die geen anti-epileptische activiteit vertonen.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van dosis-responskrelaties bij de onderdrukking van ictale events.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie, optogenetica en de omgang met transgene weefsels.
- Afhankelijk van optische vezelbezorgingssystemen en lichtbronnen die in staat zijn tot blauwe lichtpulsen op millisecondenschaal.
- Vereist standaardisatie van de 4-AP-concentratie en perfusieparameters over experimentele batches heen.
- Aanpassing aan menselijke corticale coupes kan validatie van kanaalexpressie en lichtpenetratiediepte vereisen.
- Beperkt tot acute coupe-preparaten; chronische epilepsiemodellering vereist aanvullende in vivo-benaderingen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Opname en moduleren van Epileptiform activiteit in knaagdier hersenen plakjes gekoppeld aan micro-elektrode Arrays
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een model van epileptogenese in rhinale cortex-hippocampus organotypische plakculturen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Generation of Medial Thalamus-Anterior Cingulate Cortex Slices from Mouse Brains
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Electrophysiological Recordings of Reprogrammed Neurons in a Mouse Brain Slice
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Impact of Direct Current Stimulation on Evoked Epileptic Seizures in Mouse Brain Slices
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Generatie van Local CA1 γ Oscillations door Tetanische Stimulation
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Direct-current stimulatie en multi-elektrode Array Registratie van Inbeslagneming-achtige activiteit in de muizen Brain Slice Voorbereiding
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Voorbereiding van Acute hersenen segmenten met behulp van een geoptimaliseerde N-Methyl-D-glucamine beschermende herstelmethode
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Generatie en On-Demand inleiding van Acute Ictale activiteit in knaagdier en menselijk weefsel
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Acute muis hersenen snijden om spontane Hippocampal Netwerk activiteit te onderzoeken
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026