Opheldering van Host-virus interactie in Lytische Replicatie van een Model Herpesvirus

Het algemene doel van het volgende experiment is om verschillende virologische en biochemische benaderingen te gebruiken om de rol van een gastheersignaleringsroute in de lytische replicatie van een model herpesvirus te onderzoeken. Hierbij onderzoeken we als voorbeeld de rol van het mitochondriale antivirale signaleringseiwit Mavs tijdens infectie met herpesvirus gamma HV 68. Om eerst de rol van Mavs tijdens acute infectie te onderzoeken, worden wild type en Mavs knockout muizen geïnfecteerd met gamma HV 68 na een acute virale infectie.

De muizenlong wordt verzameld en virale belastingen worden bepaald door een plaque-assay waarbij de monsters serieel worden verdund en worden geplateerd. Op monolagen wordt vervolgens het aantal plaques geteld. Verhoogde virale belastingen in de knockout muizen suggereren dat het gen van belang een antiviraal rol speelt.

In tegenstelling hiermee, wijzen verminderde virale belastingen in knockout muizen erop dat het gen vereist is voor virale infectie. Om deze bevindingen te valideren, worden in vitro virale multi-staps groeikinetiek onderzocht in muis embryonale fibroblasten, wild type en mavs knockout muis embryonale fibroblasten worden geïnfecteerd met gamma HV 68 en worden gedurende verschillende tijdsperioden geïncubeerd. De cellen worden vervolgens verzameld en plaque-assays worden uitgevoerd om de multi-staps groeikinetiek te vergelijken tussen wild type cellen en mavs-deficiënte cellen.

Om deze bevindingen verder te valideren, worden wild type en mavs knockout muis embryonale fibroblast cellen geïnfecteerd met gamma HV 68. Vervolgens worden DNA en RNA gescheiden uit de geïnfecteerde cellen geëxtraheerd en worden de virale genomische transcripten geanalyseerd door real-time PCR. We kregen eerst het idee voor dit protocol toen we de rol van een gastheerimmuniteitsroute onderzochten tijdens een lytische virusinfectie.

Dit protocol kan mogelijk worden toegepast om de regels van gastheersignaleringsroutes te onderzoeken tijdens de infectie door andere pathogenen. Begin deze procedure door zes tot acht weken oude, geslachtsgematchte muizen uit een nest in te laten acclimatiseren gedurende een periode van vier dagen na verzending. Het volgende experiment zal worden uitgevoerd in een biohazard faciliteit.

In voorbereiding, trek persoonlijke beschermingsmiddelen aan, waaronder een laboratoriumjas, handschoenen, een masker en schoentjes tijdens het werken in een bioveiligheidskast. Niveau twee. Bereid de virale suspensie voor met 40 tot 10.000 PFU van gamma HV 68 en 30 microliter steriele PBS voor elke muis die geïnfecteerd zal worden.

Bewaar de virale suspensie op ijs na een intraperitoneale injectie van ketamine Xylazine. Zorg ervoor dat de muizen zijn gesedateerd door een teenprik uit te voeren. Gebruik vervolgens een pipet om 30 microliter van de virale suspensie druppelsgewijs in de linker- of rechterneus te brengen.

Leg de muis gedurende vijf tot tien minuten op zijn zij om de luchtwegbezorging van het virus in de long te vergemakkelijken. Plaats de muizen vervolgens terug in hun kooi en bewaak ze totdat ze volledig zijn hersteld van de sedatie. Vervolgens wordt longweefsel verzameld van de geïnjecteerde muizen om een cellysaat voor te bereiden voor het beoordelen van virale titer op verschillende dagen na infectie.

Plaats de longen die zijn geoogst van geofferde muizen in steriele 1,5 milliliter schroefdopbuizen met 500 microliter 1,0 millimeter zirkoniumsilica-beadjes op ijs. Als u niet doorgaat naar de volgende stap op dezelfde dag, bewaar de monsters op min 80 graden Celsius.

Anders, voeg een milliliter koud serumvrij DMEM toe. Plaats de buis in een bead beater en druk op start om de longen gedurende 30 seconden te homogeniseren. Om oververhitting van het monster te voorkomen, wat de virus kan inactiveren.

Koel de buis gedurende ten minste één minuut op ijs na 30 seconden homogenisatie. Herhaal vervolgens dit proces. Centrifugeer vervolgens het gehomogeniseerde weefsel bij 16.000 RCF bij vier graden Celsius gedurende één minuut.

Na de centrifugatie zal het celdebris zich op de bodem van de buis bevinden en zullen de lipiden zich op het oppervlak bevinden. Neem onmiddellijk de snat zoals hier getoond om een plaque-assay uit te voeren met behulp van een NIH drie T drie of BHK 21 monolaag. Vervolgens wordt een plaque-assay uitgevoerd. Om het virale titer in het monster te bepalen, begint u de plaque-assay door een seriële verdunning van de virale supernatant te maken.

Voeg eerst 270 microliter medium toe aan een 96-wellplaat met behulp van een multikanaals pipet. Laat de eerste rij leeg. Voeg vervolgens 200 microliter supernatant toe aan de eerste rij van de 96-wellplaat en plateer elk monster in drievoud.

Breng vervolgens 30 microliter van het monster uit de eerste rij over naar de volgende rij en meng. Breng vervolgens 30 microliter van het mengsel over naar de volgende rij en meng. Herhaal deze stap meerdere keren om seriële verdunningen van tienvoudig te maken.

Voeg vervolgens het verdunde virale supernatant toe aan de celmonolaag. In een 24-wellplaat. Plaats de plaat in een incubator en schud de plaat elke 30 minuten gedurende een incubatie van twee uur. Na de incubatie, verwijder het supernatant van de plaat om celdebris te verwijderen.

Was vervolgens de cellen eenmaal met vers medium. Na de wassing, voeg medium met methylcellulose toe aan de cellen. Incubeer de cellen gedurende vier tot zes dagen.

Na vier tot zes dagen, gebruik een microscoop om het aantal plaques voor elk monster te lezen. Noteer het aantal plaques voor elke verdunning.

Bereken vervolgens het gemiddelde en de standaardafwijking. Wells met te veel of te weinig plaques kunnen niet worden gebruikt om het titer nauwkeurig te berekenen. Gebruik dus voor elk monster een verdunning waarbij er zeven tot 70 plaques zijn.

Dit monster, verdund 1000 keer, heeft gemiddeld 23 plaques per putje. Om het virale titer in de onverdunde oplossing te berekenen, vermenigvuldigt u de verdunningsfactor met het aantal plaques en het aantal microliters in een milliliter. Deel dat vervolgens door het volume van de verdunde supernatant dat per putje