Name: Het verhogen van cDNA Opbrengsten van Single-cell hoeveelheden mRNA in standaard laboratorium reverse transcriptaseremmers Reacties met behulp van Acoustic Microstreaming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: Leer een methode om cDNA-opbrengsten uit single-cell mRNA te verhogen met akoestische microstreaming in een micromixer. Deze techniek verbetert menging in standaard reverse transcriptase-reacties voor genexpressie-analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie werd gesteund door de National Health en Medical Research Council van Australië (projectsubsidie ​​niet. 6.288.480) en de Scobie en Clare MacKinnon Trust.

1. Micromixing een RT reactie <ol><li> Voordat u een RT-reactie met micromixing, evenwicht de micromixer op de gewenste temperatuur van de RT-reactie. <ol><li> Plaats de micromixer in een 37 ° C (of de temperatuur wordt aanbevolen door de leverancier RT) incubator gedurende tenminste 1 uur voor het begin van de RT-reactie. </li></ol></li><li> Stel de RT mix op basis van de reverse transcriptase leverancier (bijv. MMTV-RT van Promega, Omniscript van Qiagen) instructies, behalve gebruik maken van single-cell hoeveelheden van de input totaal RNA (bijv. 0.1-1pg/μl), in plaats van de ng-ng hoeveelheden aanbevolen door leveranciers. <ol><li> We maken gebruik van standaard steriele, nuclease-vrij 200μL dunwandige PCR-buizen. </li></ol></li><li> Positie RT buizen stevig in het micromixer zodra ze klaar zijn voor het mengen. De micromixer moet blijven in de 37 ° C incubator voor de duur van de RT-reactie. </li><li> Selecteer de juiste frequentie en amplitude van micromixing. In dit voorbeeld gebruiken we 150 Hz. </li><li> Schakel de micromixer op en laat het op voor de gehele duur van de RT-reactie (60 minuten). </li><li> Schakel de micromixer uit en neem de RT buizen eenmaal de RT-reactie is voltooid. </li><li> Plaats de RT buizen op ijs en ga verder zoals normaal met andere toepassingen, zoals kwantitatieve Polymerase Chain Reaction (qPCR of real-time PCR). </li></ol> 2. Representatieve resultaten: Het voordeel van micromixing in het kader van RT reacties is een toename van de cDNA opbrengst ten opzichte van wanneer andere het mengen van methoden (bijv. schudden, vortexen of tritureren) worden gebruikt. Dit kan worden gezien, bijvoorbeeld, bij de daaropvolgende analyse van het cDNA met behulp van kwantitatieve Polymerase Chain Reaction (qPCR of real-time PCR). Figuur 2A illustreert de effecten van micromixing voor de eerste 5 minuten (blauw, "micromixed5") of de volledige 60 minuten (rood, "micromixed60") vergeleken met fijnwrijving van de RT-reactie onmiddellijk voorafgaand aan de RT incubatie (zwart, "tritureren" ). In dit geval is het volume van het voorgaande RT-reactie was 25μL en bevatte 2.5pg totaal RNA. qPCR sporen met behulp van primers ontworpen om cDNA die Nurr-1 mRNA te detecteren zijn hierboven weergegeven, en de middelen ± SEM van het aantal cycli tot maximaal 50% fluorescentie te bereiken in drie herhalingen van hetzelfde experiment worden hieronder weergegeven. Het sterretje duidt op een statistisch significant verschil (one-way ANOVA met Tukey meerdere vergelijkingen). Merk op dat micromixing voor de eerste 5 minuten van de voorgaande RT-reactie een niet-significante verbetering ten opzichte van tritureren geproduceerd terwijl micromixing voor de gehele 60 minuten van de voorgaande RT-reactie een significante verbetering ten opzichte van fijnwrijving, waarvan de omvang komt overeen met ongeveer 15 qPCR cycli, gemiddeld. Het voordeel van micromixing kan ook worden gezien in smeltcurve analyse van de latere verkregen qPCR producten. In het experiment in figuur 2B, micromixing voor de gehele 60 minuten van de voorgaande RT reactie resulteerde in een consistente qPCR signaal in tweevoud monsters (figuur 2Ba, 2 rode sporen), terwijl micromixing voor de eerste 5 minuten of tritureren alleen geproduceerd inconsistent qPCR sporen (figuur 2Ba, 2 blauwe sporen en 2 zwarte sporen, respectievelijk). De grijze sporen zijn negatieve controles ("neg.") Waarin cDNA werd uit links van de qPCR reactie. Wanneer de qPCR producten van dit experiment werden gedenatureerd door speedramp hun temperatuur (dat wil zeggen smeltcurve analyse) was het duidelijk dat de geschikte PCR-producten (dat wil zeggen een amplicon die identiek was aan die verkregen wanneer veel hogere concentraties van mRNA werden reverse getranscribeerd en versterkt door qPCR, gegevens niet getoond) aanwezig waren alleen na RT reacties die waren micromixed gedurende 60 minuten (figuur 2BB, 2 rode sporen). Alle anderen (dat wil zeggen micromixed5, trituratie en negatieve controles) gegenereerd alternatief amplicon producten (bijv. primer dimeren). <img src="/files/ftp_upload/3144/3144fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Stroomdiagram van het protocol voor het toepassen van micromixing aan standaard laboratorium RT reacties. Meer gedetailleerde beschrijvingen van de natuurkundige principe gaat, de micromixer en hoe u een in-house micromixer bouwen zijn voorzien in de referenties 13,14 <img src="/files/ftp_upload/3144/3144fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Vertegenwoordiger qPCR gegevens illustreren de voordelen van micromixing toegepast op voorgaande RT reacties bestaande uit eencellige hoeveelheden mRNA in andere standaard laboratorium RT reacties. A Voorbeeld qPCR sporen detecteren van cDNA die mRNA dat codeert voor het Nurr-1 gen. De voorgaande RT reacties die 2.5pg totaal RNA in een volume van 25μL en werden uitgevoerd in een incubator bij 37 ° C gedurende 60 minuten. RT reacties waren gemengd door trituratie van de RT mix voorafgaand aan de incubatie (zwart sporen, "tritureren"), micromixed tijdens de eerste 5 minuten van de RT-reactie (blauwe sporen, "micromixed5") of micromixed voor de volledige 60 minuten van de RT-reactie (rood sporen, "micromixed60" ). Gemiddelden ± SEM van het aantal qPCR cycli nodig is om maximaal 50% fluorescentie te bereiken zijn hieronder weergegeven voor n = 3 herhalingen van dit experiment. Asterisk geeft een significant verschil (one-way ANOVA met Tukey meerdere vergelijkingen). B Een andere qPCR experiment te onderzoeken Nurr-1 cDNA product, dit keer na RT reacties met 25pg totaal RNA in een volume van 25μL. qPCR sporen (een) als smeltcurve analyse van de verkregen qPCR producten (b) worden weergegeven voor de verschillende mengomstandigheden. Negatieve controles waarin geen cDNA werd opgenomen in de vorige RT-reactie zijn ook opgenomen (grijs sporen, "neg."). RT reacties met veel hogere concentraties van mRNA werden ook uitgevoerd en geproduceerd smeltcurve pieken (gegevens niet getoond) identiek aan die in (b) voor de micromixed60 (rood sporen) monsters.

<ol><li>Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Funct+Genomic+Proteomic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Brief Funct Genomic Proteomic.</a> 2 (1), 31-31 (2003).</li>
<li>Aumann, T. D., Gantois, I., Egan, K. Exp Neurol. 213 (2), 419-419 (2008).</li>
<li>Ottino, J. M., Wiggins, S. Philos Transact A Math Phys Eng Sci. 362 (1818), 923-923 (2004).</li>
<li>Losey, M. W., Jackman, R. J., Firebaugh, S. L. J Microelectromech. Syst. 11, 709-709 (2002).</li>
<li>Bontoux, N., Dauphinot, L., Vitalis, T. Lab Chip. 8 (3), 443-443 (2008).</li>
<li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (9), 3084-3084 (2006).</li>
<li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (3), 956-956 (2006).</li>
<li>Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (47), 17807-17807 (2006).</li>
<li>Jiao, Z. J., Huang, X. Y. Microfluidics Nanofluidics. 6, 847-847 (2009).</li>
<li>Ahmed, D., Xiaole, M., Juluri, B. K. Microfluidics Nanofluidics. 7, 727-727 (2009).</li>
<li>Paxton, W. F., O'Hara, M. J., Peper, S. M. Anal Chem. 80, 4070-4070 (2008).</li>
<li>Autom, L. ab 11, 399-399 (2006).</li>
<li>Petkovic-Duran, K., Manasseh, R., Zhu, Y. 47 (4), 827-827 (2009).</li>
<li>Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., White, K. 50 (2), 116-116 (2011).</li>
<li>Liu, R. H., Lenigk, R., Druyor-Sanchez, R. L. Anal Chem. 75 (8), 1911-1911 (1911).</li>
<li>Riley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ann+Rev+Fluid+Mech%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ann Rev Fluid Mech.</a> 33, 43-43 (2001).</li>
<li>Whitehill, J., Neild, A., Ng, T. W. Applied Physics Letters. 96 (5), 053501-053501 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De wijze van toepassing van micromixing van standaard laboratorium RT reacties hier beschreven kan natuurlijk, betrekken mRNA geoogst via een methode (bijvoorbeeld cellysis, laser capture microdissectie). Het kan ook omvatten alle merken of types van RT reagentia, bij elke temperatuur (binnen de tolerantie van de materialen van de micromixer), en een periode van tijd. Zo hebben we vast beter cDNA opbrengsten van RT reacties bestaande uit willekeurig hexameer of oligo-dT primers. Het kan ook worden toegepast op andere bi...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Totaal RNA werd geïsoleerd uit snap bevroren acuut bereid volwassen muis middenhersenen plakjes </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PicoPure RNA Isolation Kit </td><td> Arcturus, CA, USA </td><td> KIT0204 </td><td> De set is nu verkrijgbaar bij Applied Biosystems </td></tr><tr><td> DNA-vrij DNase behandeling en verwijdering reagentia </td><td> Ambion </td><td> AM1906M </td><td></td></tr><tr><td> Random hexameer primers </td><td> Promega </td><td> C1181 </td><td></td></tr><tr><td> AMV-RT </td><td> Promega </td><td> M5101 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP set </td><td> Promega </td><td> U1240 </td><td></td></tr><tr><td> RNasin Ribonucleaseremmer </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease-Free Water </td><td> Promega </td><td> P1193 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Groene PCR Master Mix </td><td> Applied Biosystem </td><td> 4309155 </td><td></td></tr><tr><td> HPRT vooruit (20mer): CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HPRT achteruit (20mer): TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nurr1 vooruit (23mer): CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nurr1 achteruit (23mer): GGT GAG GTC CAT AAA GCT CTT GA </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 Spectrophotometer. </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Corbett Rotor Gene RG-6000 </td><td> Corbett Life Science </td><td></td><td> Corbett Life Science werd overgenomen door QIAGEN in juli 2008 </td></tr></tbody></table>

het verhogen van cdna opbrengsten van single-cell hoeveelheden mrna in standaard laboratorium reverse transcriptaseremmers reacties met behulp van acoustic microstreaming

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correleren genexpressie met cel gedrag is ideaal gedaan op de single-cell niveau. Dit is echter niet gemakkelijk te bereiken, omdat de kleine hoeveelheid labiele mRNA aanwezig is in een enkele cel (1-5% van de 1-50pg totaal RNA, of 0,01-2.5pg mRNA, per cel 1) meestal degradeert voordat het kan worden omgekeerd getranscribeerd in een stabiele cDNA kopie. Bijvoorbeeld met behulp van standaard laboratorium-reagentia en hardware, kan slechts een klein aantal genen kwalitatief worden beoordeeld per cel 2. Een manier om de efficiëntie van standaard laboratorium reverse transcriptase (RT) reacties (dwz standaardtenders reagentia in microliter volumes), bestaande uit eencellige hoeveelheden mRNA te verhogen zou zijn om sneller meng de reagentia, zodat het mRNA kan worden omgezet naar cDNA voordat het breekt. Dit is echter niet triviaal omdat op microliter vloeistof schalen stroming laminair, dat wil zeggen op dit moment beschikbare methoden het mengen (dat wil zeggen schudden, vortexen en tritureren) onvoldoende chaotische beweging om effectief te mengen reagentia te produceren. Om dit probleem oplossen, micro-schaal mengen technieken worden gebruikt 3,4. Een aantal van microfluïdische-based mixing technologieën zijn ontwikkeld die met succes te verhogen RT-reactie opbrengst 5-8. Echter, microfluidics technologieën vereisen gespecialiseerde hardware die is relatief duur en nog niet algemeen beschikbaar. Een goedkoper, handiger oplossing is wenselijk. Het belangrijkste doel van deze studie is om aan te tonen hoe de toepassing van een roman &quot;micromixing&quot;-techniek met standaard laboratorium RT reacties bestaande uit eencellige hoeveelheden mRNA aanzienlijk hun cDNA opbrengst toeneemt. We vinden cDNA opbrengst te verhogen met ongeveer 10-100-voudig, die het mogelijk maakt: (1) een groter aantal genen te analyseren per cel, (2) meer kwantitatieve analyse van genexpressie, en (3) een betere detectie van lage-overvloed genen in enkele cellen. De micromixing is gebaseerd op akoestische microstreaming 9-12, een fenomeen waarbij geluidsgolven verspreiden rond een klein obstakel maakt een gemiddelde stroming in de buurt van de hindernis. Hebben wij een akoestisch microstreaming-apparaat (&quot;micromixer&quot;) met een belangrijke vereenvoudiging, akoestische microstreaming kan worden bereikt op audio-frequenties door te zorgen voor het systeem heeft een vloeistof-lucht-interface met een kleine kromtestraal 13. De meniscus van een microliter volume van de oplossing in een buis biedt een voldoende kleine kromtestraal. Het gebruik van audio-frequenties betekent dat de hardware kan goedkoop en veelzijdig 13, en nucleïnezuren en andere biochemische reagentia worden niet beschadigd als ze kunnen worden met standaard laboratorium sonicators.

Beschrijven we een nieuwe methode voor het verhogen van cDNA opbrengst van eencellige hoeveelheden mRNA in andere standaard laboratorium reverse transcriptie reacties. De nieuwigheid schuilt in het gebruik van een micromixer, die het fenomeen van akoestische microstreaming gebruikt om vloeistoffen mix op microliter schaal effectiever dan schudden, vortexen of fijnwrijving.

Het verhogen van cDNA Opbrengsten van Single-cell hoeveelheden mRNA in standaard laboratorium reverse transcriptaseremmers Reacties met behulp van Acoustic Microstreaming

Het correleren van genexpressie met celgedrag gebeurt idealiter op single-cellniveau. Dit is echter niet eenvoudig te realiseren omdat de geringe hoeveelheid aan ...

Deze procedure verhoogt de opbrengsten van CD NA vanuit hoeveelheden mRNA van een enkele cel. Begin met het equilibreren van de micro-mixer in een incubator die is ingesteld op de gewenste temperatuur voor de reverse transcriptie-reactie. Stel vervolgens standaard laboratorium RT-reacties op, bestaande uit RNA-hoeveelheden van een enkele cel in microliter-volumes.Plaats de reactiebuis stevig in de mengopeningen, selecteer de juiste mengparameters en schakel de microm mixer in. Uiteindelijk kan deze procedure worden gebruikt om verhoogde cDNA-opbrengsten te verkrijgen via kwantitatieve PCR als voorbereiding op de RT-reactie. Laat de microm mixer minimaal één uur equilibreren in een incubator van 37 °C.In standaard steriele, nucleasevrije PCR-buisjes met dunne wanden van 200 µL. Stel de reverse transcriptase-reacties op volgens de instructies van de leverancier, maar gebruik hoeveelheden input totaal RNA die overeenkomen met die van een enkele cel. Selecteer nu de juiste frequentie en amplitude voor het micromengen.Plaats de buis vervolgens stevig in de micromixer. Zet daarna de micromixer aan. Laat de reactie 60 minuten doorgaan; schakel na voltooiing de micromixer uit en breng de r

increasing-cdna-yields-from-single-cell-quantities-mrna-standard

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We beschrijven een proces met behulp van laser-capture microdissectie te isoleren en RNA uittreksel uit een homogene celpopulatie, piramidale neuronen, in laag III van de superieure temporale gyrus in postmortale de menselijke hersenen. We vervolgens lineair versterken (T7-based) mRNA, en hybridiseren het monster op de Affymetrix menselijke X3P microarray.

Het verkrijgen van hoge kwaliteit-RNA van Single celpopulaties in Human postmortaal hersenweefsel

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde multiplex reverse transcriptase kwantitatieve PCR (qRT-PCR)-protocol in combinatie met een microfluïdisch platform als een kost en tijd efficiënte high-throughput screening tool voor microRNA (miRNA) expressie niveaus, in het bijzonder bij het werken met beperkte hoeveelheden van het monster.

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

In dit artikel beschrijven we een eenvoudige methode voor het verzamelen van enkele cellen van rat primaire neuronale culturen en de daaropvolgende transcriptoom analyse met behulp van ARNA versterking. Deze aanpak is generaliseerbaar naar een willekeurige cel type.

Transcriptoom Analyse van de individuele cellen

Kwantificeren niveaus van HIV-1 RNA in het plasma en de volgorde single HIV-1 genoom van individuen met een viral load onder de detectielimiet (50-75 kopieën / ml) is moeilijk. Hier beschrijven we hoe te winnen en te kwantificeren plasma virale RNA met behulp van een real-time PCR-test die een betrouwbare maatregelen HIV-1 RNA beneden tot 0,3 kopieën / ml en hoe virale genomen versterken door enkele genoom, van monsters met een zeer lage viral load.

Versterken en kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de Opsporing van Standard Clinical Assays

We beschrijven een protocol van real time PCR om microRNA profileren in de cerebrospinale vloeistof (CSF). Met uitzondering van RNA-extractie protocollen kan de procedure worden uitgebreid tot RNA geëxtraheerd uit andere lichaamsvloeistoffen, gekweekte cellen of weefselmonsters.

Cerebrospinale vloeistof MicroRNA Profiling Met behulp van kwantitatieve real time PCR

We beschrijven een methode om enkele zoogdiercellen te sorteren en om de expressie van maximaal 96 doelgenen van belang in elke cel te kwantificeren. Deze methode omvat het gebruik van interne qPCR-standaarden om de schatting van absolute transcripttellingen mogelijk te maken.

Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden

Dit protocol beschrijft de kritische stappen en voorzorgsmaatregelen moeten uitvoeren van eencellige multiplex omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie na patch-clamp. Deze techniek is een eenvoudige en effectieve methode voor het analyseren van het profiel van de expressie van een vooraf vastgesteld samenstel van genen van een enkele cel gekenmerkt door patch-clamp recordings.

Eencellige Multiplex omgekeerde transcriptie Polymerase-kettingreactie na Patch-clamp

Wij presenteren experimentele benaderingen voor studeren RNA-interactors van double-stranded RNA bindend proteïne kinase RNA-geactiveerd (PKR) tijdens de zoogdieren celcyclus met behulp van HeLa cellen. Deze methode maakt gebruik van formaldehyde dwarslijn RNA-PKR complexen en immunoprecipitation te verrijken van PKR-gebonden RNAs. Deze RNAs kunnen verder worden geanalyseerd door middel van high-throughput sequencing of qRT-PCR.

Bestuderen van RNA Interactors van proteïne Kinase RNA-geactiveerd tijdens de zoogdieren celcyclus

Kinetische cross-linking en analyse van cDNA is een methode die onderzoek mogelijk maakt naar de dynamiek van eiwit-RNA interacties in levende cellen met een hoge temporele resolutie. Hier wordt het protocol in detail beschreven, inclusief de groei van gistcellen, UV-crosslinking, oogsten, eiwitzuivering en voorbereidingsstappen voor de volgende generatie sequencingbibliotheek.

Monitoring van eiwit-RNA interactiedynamica in vivo bij hoge temporele resolutie met behulp van χCRAC

In dit artikel wordt een protocol met hoge doorvoer beschreven voor een snelle en betrouwbare bepaling van de genexpressieniveaus in enkele of bulk C. elegansmonsters. Dit protocol vereist geen RNA-isolatie en produceert cDNA rechtstreeks uit monsters. Het kan worden gebruikt samen met high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforms.

Kwantitatieve RT-PCR met hoge doorvoer in enkele en bulk C. elegans-monsters met behulp van nanofluïdische technologie

Leer een methode om cDNA-opbrengsten uit single-cell mRNA te verhogen met akoestische microstreaming in een micromixer. Deze techniek verbetert menging in standaard reverse transcriptase-reacties voor genexpressie-analyse.

Het verhogen van cDNA Opbrengsten van Single-cell hoeveelheden mRNA in standaard laboratorium reverse transcriptaseremmers Reacties met behulp van Acoustic Microstreaming (Video) | JoVE Journal

Het verhogen van cDNA Opbrengsten van Single-cell hoeveelheden mRNA in standaard laboratorium reverse transcriptaseremmers Reacties met behulp van Acoustic Microstreaming

Meer video's verkennen