Live cell imaging van Bacillus subtilis En Streptococcus pneumoniae Met Automatisch Time-lapse Microscopie
July 28th, 2011
Dit protocol biedt een stap-voor-stap procedure te controleren enkele cel gedrag van verschillende bacteriën in de tijd met behulp van geautomatiseerde fluorescentie time-lapse microscopie. Verder hebben we geven richtlijnen hoe de microscopie beelden te analyseren.
Het algemene doel van deze procedure is om levende cellen tijdens groei en deling te beeldvormen met behulp van fluorescentiemicroscopie, zodat het effect van celgeschiedenis en afstamming op de cellulaire ontwikkeling van bacteriën kan worden bestudeerd. Dit wordt bereikt door eerst de cellen over te brengen van vloeibaar medium met relatief hoge nutriëntconcentraties naar vloeibaar hongermedium. Vervolgens wordt een microscopische glasplaat voorbereid waarop de bacteriële cellen uitgroeien tot een microkolonie.
Een monolaag wordt voorbereid. Vervolgens wordt een time-lapse fluorescentiemicroscopiefilm opgenomen. Ten slotte wordt de film verwerkt en worden de gegevens geanalyseerd.
Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de ontwikkeling van een enkele bacteriële cel tonen door middel van time-lapse fluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande technieken zoals flowcytometrie en standaardmicroscopie, is dat het de monitoring van eiwitdynamiek, cellulair gedrag en ontwikkeling van enkele cellen in de tijd mogelijk maakt, waardoor wordt aangetoond dat de procedure in de vorm van een promovendus uit mijn lab wordt uitgevoerd. Om B tuus te bereiden, inoculeer cellen van min 80 graden Celsius, voorraad in 10 milliliter time-lapse microscopie of TLM-medium in steriele schudkolven, voeg indien nodig antibiotica toe, laat de cellen een nacht groeien bij 30 graden Celsius en 225 RPM in een steriele schudkolf. De volgende ochtend om de cellen één tot 10 in Prewarm te loodsen, chemisch gedefinieerd medium of CDM zonder antibiotica, laat de bijen subtielste cellen groeien tot midden exponentiële fase, wat ongeveer vier uur duurt. Meet de absorptie van de cultuur bij 600 nanometer en verdun de cellen tot een geschatte A 600 van 0,035.
Gebruik CDM. Deze OD zorgt ervoor dat enkele cellen met de juiste afstand tussen de cellen op de microscoopplaat voor time-lapse microscopie worden aangebracht. Een uur voordat de cellen midden exponentiële groei bereiken.
Bereid de microscoopplaat voor door twee glazen platen te reinigen met 70% ethanol en water. Verwijder een van de plastic afdekkingen van een geneframe, wees voorzichtig om geen demontage van de plastic afdekking aan de andere kant van het frame te veroorzaken. Bevestig het geneframe in het midden van een van de glazen platen door het eerst aan één kant te plakken en vervolgens de rest met een vingernagel te leiden.
Gebruik een magnetron om 150 milligram hoog resolutie laag smeltend aros op te lossen. In 10 milliliter CDM, zorg ervoor dat de aros volledig is opgelost om achtergrondfluorescentie te voorkomen. Pipetteer 500 microliter van de warme agro CDM in het midden van het geneframe, zorg ervoor dat het hele gebied inclusief de randen volledig bedekt is.
Werk snel om overmatig drogen van de aros te voorkomen. Plaats de tweede glazen plaat op het met Aros CDM gevulde geneframe en probeer luchtbellen te vermijden. Plaats de sandwich in een horizontale positie bij vier graden Celsius gedurende 45 minuten om de agros voldoende te laten stollen.
Zodra de aros is gestold, schuif voorzichtig de bovenste glasplaat eraf. Gebruik een scheermes om agrostroken van ongeveer vijf millimeter breed te snijden waarop de bacteriën zullen groeien. Er kunnen maximaal drie stroken per plaat worden gebruikt, gescheiden door ongeveer vier millimeter ruimtes aan weerszijden.
Deze ruimtes zorgen voor lucht die essentieel is voor Blu-groei. Verwijder voorzichtig de tweede en laatste plastic afdekking van het geneframe om de plakkerige kant bloot te leggen. Laad enkele cellen in ongeveer 2,5 microliter vloeistof op het vaste medium, beginnend aan de bovenkant van het agros-pad zonder het aan te raken.
Laat het medium met de pipettentip gelijkmatig verspreiden door de plaat op en neer te kantelen. Plaats een schone microscoopdeksel op het geneframe om het deksel volledig te bevestigen. Gebruik een vingernagel om druk uit te oefenen. Dus nadat de cellen zijn geladen.
Het is cruciaal om lang genoeg te wachten tot de vloeistof droog is, zodat je geen zwemmende cellen en groei in meerdere lagen krijgt. Als de cellen echter te lang zijn gedroogd, zullen ze problemen ondervinden bij het uitgroeien tot een micro cholon-monolaag. Dus de tijd die nodig is om uw plaatjes te drogen, hangt af van het experiment en kan niet worden gemeten.
En bijgevolg moet men er natuurlijk een gevoel voor krijgen. Om autofocusproblemen tijdens de eerste uren van het time-lapse-experiment te voorkomen, verwarm de plaat een uur voor in de 30 graden Celsius om voor te bereiden op time-lapse microscopie. Verwarm de omgevingskamer minimaal twee uur voor. Selecteer voor het begin van het experiment de juiste objectieffilters en dichroische spiegel volgens uw experimentele opstelling.
Voor lange experimenten, zorg ervoor dat een UV-filter tussen de lichtbron en het monster wordt geplaatst. Blokkeer bovendien, indien mogelijk, een deel van het excitatielicht met behulp van neutrale dichtheidsfilters om de blootstelling te minimaliseren. Programmeer het experiment volgens de specifieke experimentele opstelling.
Het is verstandig om de hoeveelheid licht die voor specifieke constructies nodig is, evenals de autofocus-instellingen voor andere time-lapse microscopen of bacteriën te bepalen voorafgaand aan het daadwerkelijke experiment. Kortere belichtingstijden en lagere niveaus van excitatielicht minimaliseren bleken en fototoxiciteit. Gebruik scopisch licht voor de autofocusfunctie. Plaats ten slotte de voorbereide plaat in de voorverwarmde omgevingskamer van de microscoop en bewaak de uitgroei van enkele cellen tot een micro kolonie-monolaag bij 30 graden Celsius.
Een succesvol time-lapse fluorescentie-experiment zal een micro kolonie-monolaag produceren die volledig binnen het gezichtsveld ligt. Aan het einde van het experiment in deze film staat bright field links en fluoresceren is rechts te zien.
Hier is een voorbeeld van een B Subtles microkolonie waarin sommige cellen op elkaar groeiden, waardoor het moeilijk werd om hun geschiedenis nauwkeurig te traceren en hun fluorescentieniveaus correct te meten. Na het bekijken van deze video
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het monitoren van het gedrag van enkele bacteriecellen in de loop van de tijd met behulp van geautomatiseerde fluorescentie time-lapse microscopie. Het bevat gedetailleerde richtlijnen voor het voorbereiden van monsters en het analyseren van de resulterende beelden.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Het begrijpen van het gedrag van bacteriecellen is cruciaal voor verschillende biologische studies.
- Time-lapse microscopie maakt de observatie van dynamische levende cellen mogelijk.
- Deze methode biedt inzichten in de effecten van celgeschiedenis op ontwikkeling.
- Traditionele methoden kunnen de nuances van het gedrag van enkele cellen mogelijk niet vastleggen.
Doel van het onderzoek
- Om levende bacteriecellen tijdens groei en deling te visualiseren.
- Om de impact van voedingsomstandigheden op cellulaire ontwikkeling te analyseren.
- Om de begrip van eiwitdynamiek en cellulair gedrag te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Transfer cellen naar hongermedium om groei te initiëren.
- Bereid een microscoopglaasje voor voor bacteriegroei.
- Neem time-lapse fluorescentie microscopie films op.
- Analyseer de opgenomen gegevens om celontwikkeling te observeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van enkele bacteriecellen in de loop van de tijd.
- Observatie van micro kolonievorming en ontwikkeling.
- Inzichten in de dynamiek van eiwitexpressie in enkele cellen.
- Demonstratie van de voordelen van time-lapse microscopie boven traditionele methoden.
Conclusies
- Het protocol maakt effectief de studie van het gedrag van enkele cellen in bacteriën mogelijk.
- Time-lapse microscopie is een krachtig hulpmiddel voor cellulaire analyse.
- Toekomstige studies kunnen op deze methode voortbouwen om andere bacteriële dynamieken te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Monitoring single-cell behavior in bacteria enables mechanistic de-risking of antimicrobial target validation by revealing heterogeneity in growth, division, and protein expression. This approach supports predictive confidence in early discovery by linking cellular history to phenotypic outcomes, informing portfolio triage for antibiotic development. Time-lapse microscopy provides translational continuity from mechanistic screening to preclinical model evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by tracking individual cell responses to nutrient shifts and genetic perturbations over time.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of protein dynamics and cellular behavior in single cells.
- Predictive Value: Supports lead identification by correlating cellular ancestry with phenotypic stability across generations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing reproducible microcolony formation on agarose pads.
- Quantitative Outputs: Generates time-resolved fluorescence and brightfield data enabling measurement of growth rates, division timing, and protein localization.
- Scalability: Supports platform reuse across bacterial species (B. subtilis, S. pneumoniae) for standardized antimicrobial target assessment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models pathogen behavior in clinically relevant species like S. pneumoniae to inform antimicrobial mechanism of action studies.
- Translational Biomarker Alignment: Links single-cell protein dynamics to population-level phenotypes, supporting biomarker-driven go/no-go decisions.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by validating target effects at single-cell resolution.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions single-cell time-lapse imaging between target validation and lead optimization, enabling hypothesis testing and mechanistic de-risking before compound screening.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing how gene expression dynamics influence cellular behavior during growth and division.
- Screening: Delivers assay-ready microcolonies with standardized spacing and monolayer formation for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variables including fluorescence intensity, division timing, and lineage tracking for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects single-cell observations to preclinical continuity through ancestry-dependent behavior modeling in pathogen systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microscopy capability for cross-project antimicrobial target assessment across Gram-positive models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of single-cell protein dynamics and behavioral heterogeneity.
- Operational Value: Standardized slide preparation and environmental controls ensure reproducibility across laboratories and experimental runs.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by de-risking targets based on single-cell response consistency rather than population averages.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of antimicrobial candidates using lineage-resolved phenotypic data to avoid false positives from population masking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial culture techniques, fluorescence microscopy, and image analysis software like ImageJ.
- Dependent on temperature-controlled environmental chambers, neutral density filters, and UV protection for long-term imaging.
- Necessitates cross-team standardization of slide preparation, agarose concentration, and cell loading protocols for inter-laboratory consistency.
- Adaptation considerations include optimizing agarose thickness and nutrient composition for different bacterial species and growth rates.
- Practical limitations include phototoxicity risks during extended imaging and challenges in tracking cells that grow in multilayer formations.
