Live cell imaging van Bacillus subtilis En Streptococcus pneumoniae Met Automatisch Time-lapse Microscopie
28 juli 2011
Dit protocol biedt een stap-voor-stap procedure te controleren enkele cel gedrag van verschillende bacteriën in de tijd met behulp van geautomatiseerde fluorescentie time-lapse microscopie. Verder hebben we geven richtlijnen hoe de microscopie beelden te analyseren.
Het algemene doel van deze procedure is het in beeld brengen van levende cellen tijdens groei en deling met behulp van fluorescentiemicroscopie, zodat het effect van celgeschiedenis en afstamming op de cellulaire ontwikkeling van bacteriën kan worden bestudeerd. Dit wordt bereikt door de cellen eerst over te brengen van een vloeibaar medium met relatief hoge nutriëntenconcentraties naar een vloeibaar uithongeringsmedium. Vervolgens wordt een microscopisch objectglas gebruikt waarop de bacteriële cellen uitgroeien tot een microkolonie.
De monolaag wordt klaargemaakt. Vervolgens wordt een time-lapse fluorescentiemicroscopie-film opgenomen. Tot slot wordt de film verwerkt en worden de gegevens geanalyseerd.
Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de ontwikkeling van een enkele bacteriële cel laten zien via time-lapse fluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken, zoals flowcytometrie en standaardmicroscopie, is dat het mogelijk maakt om de proteïnedynamiek, het cellulaire gedrag en de ontwikkeling van individuele cellen in de tijd te monitoren; de procedure zal worden gedemonstreerd door een PhD-student uit mijn lab. Om B. subtilis voor te bereiden, inoculeert u cellen uit stocks van -80 °C in 10 milliliter time-lapse microscopie- of TLM-medium in steriele schudkolven, indien nodig aangevuld met antibiotica. Kweek de cellen gedurende de nacht bij 30 °C en 225 RPM in een steriele schudkolf. De volgende ochtend zaait u de cellen 1:10 in voorverwarmd, chemisch gedefinieerd medium of CDM zonder antibiotica. Kweek de B. subtilis cellen tot de mid-exponentiële fase, wat ongeveer vier uur duurt. Meet de absorbantie van de cultuur bij 600 nanometer en verdun de cellen tot een geschatte A600 van 0,035.
Gebruik CDM. Deze OD zorgt ervoor dat individuele cellen met een geschikte onderlinge afstand op het microscoopglas worden gespot voor time-lapse microscopie. Eén uur voordat de cellen de mid-exponentiële groeifase bereiken.
Bereid de microscoopdia voor door twee glazen objectglazen te reinigen met 70% ethanol en water. Verwijder een van de plastic kappen van een gene frame, waarbij u er zorgvuldig op let dat de plastic kap aan de andere zijde van het frame niet losraakt. Bevestig het gene frame in het midden van een van de glazen objectglazen door het eerst aan één zijde vast te plakken en vervolgens de rest met een vingernagel op zijn plaats te geleiden.
Gebruik een magnetron om 150 milligram high resolution low melting agarose op te lossen in 10 milliliter CDM; zorg ervoor dat de agarose volledig is opgelost om achtergrondfluorescentie te voorkomen. Pipetteer 500 microliter van de warme agarose CDM in het midden van het genframe, waarbij u er zeker van bent dat het gehele gebied, inclusief de randen, volledig is bedekt.
Werk snel om overmatige uitdroging van de agar te voorkomen. Plaats de tweede glazen plaat op het met Agar CDM gevulde genframe en probeer luchtbellen te vermijden. Plaats de sandwich in een horizontale positie bij vier graden Celsius gedurende 45 minuten om de agar voldoende te laten stollen.
Zodra de agar zorgvuldig is gestold, schuift u het bovenste glas eraf. Gebruik een scheermesje om agarstrips van ongeveer vijf millimeter breed uit te snijden waarop de bacteriën zullen groeien. Per objectglas kunnen maximaal drie strips worden gebruikt, gescheiden door ruimtes van ongeveer vier millimeter aan weerszijden.
Deze ruimtes zorgen voor lucht, wat essentieel is voor de groei van Blu. Verwijder voorzichtig de tweede en laatste plastic afdekking van het genframe om de plakzijde bloot te leggen. Breng enkelcellen in ongeveer 2,5 µL vloeistof aan op het vaste medium, beginnend aan de bovenkant van het agros-kussentje zonder dit aan te raken.
Laat het medium met de pipetpunt gelijkmatig verspreiden door het preparaatglas voorzichtig te kantelen. Plaats een schoon microscoopdekglas op het genframe om het dekglas volledig te bevestigen. Druk met een vingernagel licht aan zodra de cellen zijn aangebracht.
Het is cruciaal om lang genoeg te wachten tot de vloeistof is opgedroogd, zodat er geen zwevende cellen en groei in meerdere lagen ontstaan. Als de cellen echter te lang drogen, zullen ze problemen hebben bij het uitgroeien tot een micro cholon-monolaag. De tijd die nodig is om de coupes te drogen, is daarom afhankelijk van het experiment en kan niet precies worden vastgesteld.
Bijgevolg is het uiteraard noodzakelijk om hier een gevoel voor te krijgen. Om autofocusproblemen tijdens de eerste uren van het time-lapse experiment te voorkomen, dient het objectglas gedurende één uur bij 30 °C te worden voorverwarmd ter voorbereiding op de time-lapse microscopie. Voorwarm de environmental chamber gedurende ten minste twee uur. Selecteer vóór de start van het experiment de juiste objectief, filters en dichroïsche spiegel op basis van uw experimentele opstelling.
Plaats bij langdurige experimenten een UV-filter tussen de lichtbron en het monster. Blok bovendien, indien mogelijk, een deel van het excitatielicht met neutrale dichtheidsfilters om de blootstelling te minimaliseren. Programmeer het experiment volgens de specifieke experimentele opstelling.
Het is raadzaam om voorafgaand aan het eigenlijke experiment de benodigde hoeveelheid licht voor specifieke constructen, evenals de autofocusinstellingen voor andere time-lapse microscopen of bacteriën, te bepalen. Kortere belichtingstijden en lagere niveaus van excitatielicht zullen bleking en fototoxiciteit minimaliseren. Gebruik scopisch licht voor de autofocusfunctie. Plaats ten slotte de voorbereide slide in de voorverwarmde environmental chamber van de microscoop en monitor de uitgroei van individuele cellen tot een monocuulaag van microkolonies bij 30 °C.
Een succesvol time-lapse fluorescentie-experiment resulteert in een monoclaag van microkolonies die volledig binnen het gezichtsveld is gelegen. Aan het einde van het experiment in deze video is het helderveld links te zien en de fluorescentie rechts.
Hier is een voorbeeld van een B Subtles microkolonie waarin sommige cellen bovenop elkaar zijn gegroeid, waardoor het moeilijk is om hun geschiedenis nauwkeurig te traceren en hun fluorescentieniveaus correct te meten. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u succesvol een microscopisch monster voor time-lapse microscopie voorbereidt en hoe u time-lapse fluorescentiemicroscopie uitvoert. Experimenteer met BACE-cellen.
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het monitoren van het gedrag van individuele bacteriële cellen over een bepaalde tijd met behulp van geautomatiseerde fluorescentie time-lapse microscopie. Het bevat gedetailleerde richtlijnen voor het voorbereiden van monsters en het analyseren van de resulterende beelden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Het begrijpen van het gedrag van bacteriële cellen is essentieel voor diverse biologische studies.
- Time-lapse microscopie maakt het mogelijk om de dynamiek van levende cellen te observeren.
- Deze methode biedt inzicht in de effecten van de celgeschiedenis op de ontwikkeling.
- Traditionele methoden leggen mogelijk de nuances van het gedrag van individuele cellen niet vast.
Doel van de studie
- Om levende bacteriële cellen tijdens groei en deling te visualiseren.
- Om de impact van voedingsomstandigheden op de cellulaire ontwikkeling te analyseren.
- Om het begrip van proteinedynamiek en cellulair gedrag te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Breng de cellen over naar uithongeringsmedium om de groei te initiëren.
- Bereid een microscoopglaasje voor voor bacteriële groei.
- Registreer time-lapse fluorescentiemicroscopie-films.
- Analyseer de geregistreerde gegevens om de celontwikkeling waar te nemen.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle imaging van individuele bacteriële cellen over een tijdsverloop.
- Observatie van de vorming en ontwikkeling van microkolonies.
- Inzichten in de dynamiek van proteïne-expressie in individuele cellen.
- Demonstratie van de voordelen van time-lapse microscopie ten opzichte van traditionele methoden.
Conclusies
- Het protocol maakt het effectief mogelijk om het gedrag van individuele cellen in bacteriën te bestuderen.
- Time-lapse microscopie is een krachtig instrument voor cellulaire analyse.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode om andere bacteriële dynamieken te onderzoeken.
Veelgestelde Vragen
Relevantie voor de industrie
Het monitoren van het gedrag van individuele cellen in bacteriën maakt een mechanische risicoanalyse van de validatie van antimicrobiële targets mogelijk door heterogeniteit in groei, deling en eiwitexpressie te onthullen. Deze aanpak ondersteunt het voorspellende vertrouwen in vroege ontdekking door cellulaire geschiedenis te koppelen aan fenotypische resultaten, wat bijdraagt aan de triage van portfolio's voor antibioticaontwikkeling. Time-lapse microscopie biedt translationele continuïteit van mechanische screening naar preklinische modelevaluatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door individuele celrespons op nutriëntverschuivingen en genetische perturbaties in de tijd te volgen.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door directe observatie van proteïnedynamiek en cellulair gedrag in individuele cellen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de identificatie van lead-moleculen door cellulaire afstamming te correleren met fenotypische stabiliteit over generaties heen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound-screening door reproduceerbare microkolonievorming op agarosepads te bewerkstelligen.
- Kwantitatieve output: Genereert tijdgebaseerde fluorescentie- en brightfield-data, waardoor meting van groeisnelheden, delingstijdstippen en eiwitlokalisatie mogelijk wordt.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt hergebruik van het platform voor verschillende bacteriële soorten (B. subtilis, S. pneumoniae) voor gestandaardiseerde beoordeling van antimicrobiële targets.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Modelleert het gedrag van pathogenen in klinisch relevante soorten zoals S. pneumoniae om studies naar het werkingsmechanisme van antimicrobiële middelen te informeren.
- Afstemming van translationele biomarkers: Koppelt eiwitdynamiek op single-cell niveau aan fenotypes op populatieniveau, ter ondersteuning van biomarker-gestuurde go/no-go beslissingen.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Vermindert mechanische ambiguïteit in preklinische modellen door target-effecten te valideren met single-cell resolutie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode plaatst single-cell time-lapse imaging tussen target-validatie en lead-optimalisatie, waardoor hypothesetesten en mechanistische risicoreductie mogelijk zijn voorafgaand aan de compound-screening.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door te visualiseren hoe genexpressiedynamiek het cellulaire gedrag tijdens groei en deling beïnvloedt.
- Screening: Levert assay-klare microkolonies met gestandaardiseerde tussenruimtes en monolaagvorming voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Biedt kwantitatieve afhankelijke variabelen, waaronder fluorescentie-intensiteit, delingstijdstip en lineage tracking voor de analyse van vergelijkende condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt single-cell observaties met preklinische continuïteit via modellering van afstammingsafhankelijk gedrag in pathogeensystemen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbare microscopiecapaciteit voor de beoordeling van antimicrobiële targets over verschillende Gram-positieve modellen heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door directe observatie van proteinedynamiek op single-cell niveau en gedragsmatige heterogeniteit.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde slide-preparatie en omgevingscontroles waarborgen de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en experimentele runs.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het verminderen van risico's bij targets op basis van de consistentie van de single-cell respons in plaats van populatiegemiddelden.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van antimicrobiële kandidaten met behulp van lineage-resolved fenotypische gegevens om fout-positieven door population masking te voorkomen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in microbiële kweektechnieken, fluorescentiemicroscopie en beeldanalyse-software zoals ImageJ.
- Afhankelijk van temperatuurgecontroleerde klimaatkamers, neutraaldichtheidsfilters en UV-bescherming voor langetermijn-imaging.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams van de preparatie van slides, agaroseconcentratie en cel-loadprotocollen voor consistentie tussen laboratoria.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten het optimaliseren van de agarosedikte en de nutriëntensamenstelling voor verschillende bacteriële soorten en groeisnelheden.
- Praktische beperkingen omvatten risico's op fototoxiciteit tijdens langdurige imaging en uitdagingen bij het volgen van cellen die in meerlaagse formaties groeien.
