Scheiding van enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA van een milieu-Viral Gemeenschap met behulp van Hydroxyapatite Chromatografie
29 september 2011
Beschrijven we een efficiënte methode om enkelstrengs DNA, double-stranded DNA-en RNA-moleculen te scheiden van het milieu virale gemeenschappen. Nucleïnezuren worden gefractioneerd met behulp van hydroxyapatiet chromatografie met toenemende concentraties van fosfaat-bevattende buffers. Deze methode laat de isolatie van alle virale nucleïnezuur types van het milieu monsters.
Deze video demonstreert een procedure voor het scheiden van gemengde virale assemblages op basis van hun nucleïnezuursamenstelling. Dit maakt de studie van de taxonomische diversiteit en functioneel potentieel van complexe virale assemblages mogelijk. Hierbij wordt hydroxyapatiet, een kristallijne vorm van calciumfosfaat, gebruikt bij de scheiding van nucleïnezuren.
Eerst wordt een hydroxyapatietkolom gevuld en geëquilibreerd. Gezuiverde virale nucleïnezuren worden vervolgens op de kolom aangebracht, de ladinginteractie tussen de positief geladen calciumionen van het hydroxyapatiet en de negatief geladen fosfaatruggengraat van de nucleïnezuursubtypen bindt de nucleïnezuren aan de kolom Nick. Vervolgens worden enkelstrengs, D-N-A-R-N-A en dubbelstrengs DNA sequentieel afgesloten met verschillende concentraties fosfaatbuffer. De resulterende nucleïnezuren worden vervolgens ontzilt en geconcentreerd ter voorbereiding op visualisatie, kwantificering en identificatie door DNA-sequencing agros gelelektroforese bevestigt dat de nucleïnezuursoorten kunnen worden gescheiden met minder dan 9% overloop.
Deze methode maakt de evaluatie van de diversiteit en functionele capaciteit van virale gemeenschappen mogelijk. Hallo, mijn naam is Doug Fro, en ik ben onderzoeksassistent in het laboratorium van Dr. Shannon Williamson bij het j Craig Venture Institute. Vandaag laat ik je een procedure zien om enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA te scheiden uit een omgevingsvirologisch assemblage.
Deze methode heeft voordelen ten opzichte van bestaande methoden, zoals de behandeling met de kern, die zich richt op DNA of RNA. Hydroxyapatietchromatografie heeft de mogelijkheid om de hele virale gemeenschap vast te leggen. Deze methode stelt ons in staat om verschillende vragen te beantwoorden op het gebied van virale ecologie.
Wat is bijvoorbeeld het totale gencomplement of de diversiteit van de virale gemeenschap? We dachten eerst aan deze methode toen we de hele Rio Plankton-assemblages van de Chesapeake Bay wilden bestuderen zonder een subset van de genetische signatuur op te offeren. De oplossingen die nodig zijn voor dit experiment moeten van tevoren worden bereid volgens de instructies in het bijgevoegde schriftelijke protocol, en omvatten 0,12 molair fosfaatbuffer, 0,20 molair fosfaatbuffer, 0,40 molair fosfaatbuffer en een molaire fosfaat-oplossing.
Allemaal op pH 6,8 en gehydrateerd hydroxyapatiet op de dag van het experiment, geef alle fosfaatbuffers en gehydrateerd hydroxyapatiet in een waterbad van 60 graden Celsius. Begin deze procedure door de econo-kolom voor te bereiden die zal worden gebruikt voor de scheiding van virale nucleïnezuren. Bevestig een stopkraan aan het uiteinde van de econo-kolom en zorg ervoor dat deze gesloten is.
Gebruik een pipetter om gedeïoniseerd water toe te voegen aan de kolom, plaats vervolgens de dop op de bovenkant van de kolom en draai de kolom herhaaldelijk om te spoelen. Giet het water af en herhaal deze wassing meerdere keren. Verwijder vervolgens de stopkraan uit de econo-kolom en autoclaveer deze om deze te steriliseren.
De stopkraan wordt niet geautoclaveerd omdat deze zal smelten. Spoel de stopkraan met het geïoniseerde water, vervolgens weer met 70% ethanol en laat hem na het autoclaveren aan de lucht drogen. Plaats de stopkraan weer in en sluit deze.
Werk vervolgens in een afzuiging en voeg een milliliter sigma-coat toe aan de kolom en bedek de glazen kolom door de kolom met een rolbeweging te draaien, zoals hier getoond. Coating met een sigma-coat minimaliseert het aanhechten van de nucleïnezuren aan het glazen oppervlak. Tijdens de scheiding zijn één zoutglasoppervlakken gecoat.
Open de stopkraan en decanteer in een conische buis. Verbind vervolgens de kolom met een circu-lerend waterbad met behulp van twee klemmen om de kolom aan een ringstatief te bevestigen. Bevestig siliconenslangen van het circu-lerende waterbad, zodat de waterstroom van het waterbad van onder naar boven gaat.
Stel de temperatuur in op 60 graden Celsius en start de circulatie. In de praktijk zouden de kolom en de slangen in een isolatiemiddel worden gewikkeld, zoals aluminiumfolie of schuimbuisisolatie. Om warmteverlies te minimaliseren, wordt deze stap hier niet getoond.
Om het proces beter te visualiseren, sluit de stopkraan. Gebruik een pipetter om 10 milliliter steriele RNA-vrije water toe te voegen. Open de stopkraan en laat het water weglopen.
Was vervolgens opnieuw volgens de tweede wassing. Spoel twee keer met 10 milliliter steriele RNA-vrije 0,12 molair fosfaatbuffer en decanteer tussen de wasbeurten. De kolom is nu klaar voor hydroxyapatietchromatografie.
Zorg ervoor dat de stopkraan van de econo-kolom gesloten is. Voeg vervolgens langzaam twee milliliter voorbereide gesuspendeerde, gerehydrateerde hydroxyapatiet toe aan de bodem van de kolom met behulp van een steriele twee milliliter serologische pipette. Plaats de kolomdop weer op zijn plaats.
Laat de hydroxyapatiet onder invloed van de zwaartekracht gedurende 30 minuten bezinken. Deze methode vereist aandacht voor detail. De hydroxyapatietkolom verwerkt met een snelheid van 0,25 tot 0,5 mil per minuut.
Het is dus erg belangrijk om de kolom goed in de gaten te houden, zodat deze niet uitdroogt. Nadat 30 minuten zijn verstreken, opent u de stopkraan om de buffer in een afvalcontainer te laten lopen. Sluit de stopkraan en gooit de stroom erdoor weg.
Combineer nucleïnezuren met 0,12 molair fosfaatbuffer in een eindvolume van 500 microliter en incubeer het 60 graden Celsius gedurende 10 minuten. Dit zal de nucleïnezuren in temperatuur met de kolom gelijkmaken en zal de scheiding van de verschillende nucleïnezuursoorten verbeteren door eventuele secundaire structuren die aanwezig kunnen zijn te verwijderen. Gebruik een twee milliliter serologische pipette om de nucleïnezuuroplossing snel op de hydroxyapatiet aan te brengen en zorg ervoor dat de kolom niet wordt verstoord.
Zodra de volledige 500 microliter op de kolom stroomt, kan een
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het scheiden van enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA uit omgevingsvirale gemeenschappen met behulp van hydroxyapatietchromatografie. De techniek maakt de isolatie van verschillende typen virale nucleïnezuren mogelijk, wat verder onderzoek naar virale diversiteit en functionaliteit vergemakkelijkt.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Virologie
- Moleculair biologie
- Milieuwetenschap
Achtergrond
- Omgevingsvirale gemeenschappen zijn complex en divers.
- Het begrijpen van virale nucleïnezuren is cruciaal voor het bestuderen van hun rol in ecosystemen.
- Traditionele methoden kunnen verschillende typen nucleïnezuren mogelijk niet effectief scheiden.
- Hydroxyapatietchromatografie biedt een veelbelovende oplossing voor deze scheiding.
Doel van het onderzoek
- Om een efficiënte methode te ontwikkelen voor het isoleren van virale nucleïnezuren.
- Om het begrip van virale taxonomische diversiteit te verbeteren.
- Om nucleïnezuren voor te bereiden op verdere analyse, inclusief sequencing.
Gebruikte methoden
- Hydroxyapatietchromatografie werd gebruikt voor nucleïnezuurscheiding.
- Een kolom werd gevuld en geëquilibreerd met fosfaatbuffers.
- Nucleïnezuren werden op de kolom aangebracht en sequentieel geëlueerd.
- Elektroforese werd gebruikt om de scheidingsefficiëntie te bevestigen.
Belangrijkste resultaten
- Enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA werden met succes gescheiden.
- Minder dan 9% overloop van nucleïnezuren werd waargenomen.
- De methode maakt effectieve visualisatie en kwantificering van nucleïnezuren mogelijk.
- Resultaten ondersteunen het onderzoek naar virale assemblages in omgevingsmonsters.
Conclusies
- De hydroxyapatietchromatografiemethode is efficiënt voor nucleïnezuurscheiding.
- Deze techniek kan het onderzoek naar virale diversiteit en functionaliteit vergemakkelijken.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methode voor bredere toepassingen in de virologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Separating nucleic acid subtypes from mixed viral assemblages enables comprehensive characterization of viral diversity without losing genetic signatures, supporting target validation in antiviral discovery. Hydroxyapatite chromatography provides a scalable, reproducible method to isolate ssDNA, dsDNA, and RNA viruses for downstream sequencing and functional assays. This approach reduces mechanistic ambiguity in early discovery by enabling parallel evaluation of all viral genome types in environmental samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses across all viral genome types in complex assemblages.
- Operational Value: Supports biological de-risking by preserving ssDNA, dsDNA, and RNA viral signatures for parallel target screening.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative nucleic acid yields for each subtype prior to lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, fractionated viral nucleic acid pools for assay development against diverse viral targets.
- Operational Value: Ensures assay readiness through reproducible separation with <9% carryover, enabling reliable compound screening.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple viral community samples with consistent elution profiles using defined phosphate buffer gradients.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains continuity from environmental viral sampling to preclinical validation by preserving genotype-specific nucleic acids.
- Mechanistic De-risking: Enables assessment of functional potential across ssDNA, dsDNA, and RNA viruses to inform preclinical model selection.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing subtype-specific quantification for biomarker alignment in translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling fractionation of viral nucleic acids prior to sequencing, assay development, and functional screening, supporting lead identification campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating ssDNA, dsDNA, and RNA viruses for independent functional analysis.
- Screening: Delivers assay-ready nucleic acid fractions with high purity and low carryover, enabling reliable high-throughput screening.
- Analytics: Provides quantitative nucleic acid yields and electrophoretic profiles that allow comparison across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects environmental sampling to preclinical continuity through preserved nucleic acid integrity for downstream validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable fractionation platform applicable to diverse viral assemblages across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through comprehensive viral genome representation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of nucleic acid separation across labs.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antiviral programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on complete viral diversity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and chromatography techniques.
- Dependence on HPLC-compatible systems and fraction collection infrastructure.
- Need for standardized phosphate buffer preparation and temperature control at 60°C.
- Adaptation considerations for varying viral load and sample complexity from environmental sources.
- Practical limitation: Column equilibration and binding steps require precise timing to prevent nucleic acid degradation or loss.
