Scheiding van enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA van een milieu-Viral Gemeenschap met behulp van Hydroxyapatite Chromatografie
29 september 2011
Beschrijven we een efficiënte methode om enkelstrengs DNA, double-stranded DNA-en RNA-moleculen te scheiden van het milieu virale gemeenschappen. Nucleïnezuren worden gefractioneerd met behulp van hydroxyapatiet chromatografie met toenemende concentraties van fosfaat-bevattende buffers. Deze methode laat de isolatie van alle virale nucleïnezuur types van het milieu monsters.
Deze video demonstreert een procedure voor het scheiden van gemengde virale assemblages op basis van hun nucleïnezuursamenstelling. Dit maakt de studie van de taxonomische diversiteit en functioneel potentieel van complexe virale assemblages mogelijk. Hierbij wordt hydroxyapatiet, een kristallijne vorm van calciumfosfaat, gebruikt bij de scheiding van nucleïnezuren.
Eerst wordt een hydroxyapatietkolom gevuld en geëquilibreerd. Gezuiverde virale nucleïnezuren worden vervolgens op de kolom aangebracht, de ladinginteractie tussen de positief geladen calciumionen van het hydroxyapatiet en de negatief geladen fosfaatruggengraat van de nucleïnezuursubtypen bindt de nucleïnezuren aan de kolom Nick. Vervolgens worden enkelstrengs, D-N-A-R-N-A en dubbelstrengs DNA sequentieel afgesloten met verschillende concentraties fosfaatbuffer. De resulterende nucleïnezuren worden vervolgens ontzilt en geconcentreerd ter voorbereiding op visualisatie, kwantificering en identificatie door DNA-sequencing agros gelelektroforese bevestigt dat de nucleïnezuursoorten kunnen worden gescheiden met minder dan 9% overloop.
Deze methode maakt de evaluatie van de diversiteit en functionele capaciteit van virale gemeenschappen mogelijk. Hallo, mijn naam is Doug Fro, en ik ben onderzoeksassistent in het laboratorium van Dr. Shannon Williamson bij het j Craig Venture Institute. Vandaag laat ik je een procedure zien om enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA te scheiden uit een omgevingsvirologisch assemblage.
Deze methode heeft voordelen ten opzichte van bestaande methoden, zoals de behandeling met de kern, die zich richt op DNA of RNA. Hydroxyapatietchromatografie heeft de mogelijkheid om de hele virale gemeenschap vast te leggen. Deze methode stelt ons in staat om verschillende vragen te beantwoorden op het gebied van virale ecologie.
Wat is bijvoorbeeld het totale gencomplement of de diversiteit van de virale gemeenschap? We dachten eerst aan deze methode toen we de hele Rio Plankton-assemblages van de Chesapeake Bay wilden bestuderen zonder een subset van de genetische signatuur op te offeren. De oplossingen die nodig zijn voor dit experiment moeten van tevoren worden bereid volgens de instructies in het bijgevoegde schriftelijke protocol, en omvatten 0,12 molair fosfaatbuffer, 0,20 molair fosfaatbuffer, 0,40 molair fosfaatbuffer en een molaire fosfaat-oplossing.
Allemaal op pH 6,8 en gehydrateerd hydroxyapatiet op de dag van het experiment, geef alle fosfaatbuffers en gehydrateerd hydroxyapatiet in een waterbad van 60 graden Celsius. Begin deze procedure door de econo-kolom voor te bereiden die zal worden gebruikt voor de scheiding van virale nucleïnezuren. Bevestig een stopkraan aan het uiteinde van de econo-kolom en zorg ervoor dat deze gesloten is.
Gebruik een pipetter om gedeïoniseerd water toe te voegen aan de kolom, plaats vervolgens de dop op de bovenkant van de kolom en draai de kolom herhaaldelijk om te spoelen. Giet het water af en herhaal deze wassing meerdere keren. Verwijder vervolgens de stopkraan uit de econo-kolom en autoclaveer deze om deze te steriliseren.
De stopkraan wordt niet geautoclaveerd omdat deze zal smelten. Spoel de stopkraan met het geïoniseerde water, vervolgens weer met 70% ethanol en laat hem na het autoclaveren aan de lucht drogen. Plaats de stopkraan weer in en sluit deze.
Werk vervolgens in een afzuiging en voeg een milliliter sigma-coat toe aan de kolom en bedek de glazen kolom door de kolom met een rolbeweging te draaien, zoals hier getoond. Coating met een sigma-coat minimaliseert het aanhechten van de nucleïnezuren aan het glazen oppervlak. Tijdens de scheiding zijn één zoutglasoppervlakken gecoat.
Open de stopkraan en decanteer in een conische buis. Verbind vervolgens de kolom met een circu-lerend waterbad met behulp van twee klemmen om de kolom aan een ringstatief te bevestigen. Bevestig siliconenslangen van het circu-lerende waterbad, zodat de waterstroom van het waterbad van onder naar boven gaat.
Stel de temperatuur in op 60 graden Celsius en start de circulatie. In de praktijk zouden de kolom en de slangen in een isolatiemiddel worden gewikkeld, zoals aluminiumfolie of schuimbuisisolatie. Om warmteverlies te minimaliseren, wordt deze stap hier niet getoond.
Om het proces beter te visualiseren, sluit de stopkraan. Gebruik een pipetter om 10 milliliter steriele RNA-vrije water toe te voegen. Open de stopkraan en laat het water weglopen.
Was vervolgens opnieuw volgens de tweede wassing. Spoel twee keer met 10 milliliter steriele RNA-vrije 0,12 molair fosfaatbuffer en decanteer tussen de wasbeurten. De kolom is nu klaar voor hydroxyapatietchromatografie.
Zorg ervoor dat de stopkraan van de econo-kolom gesloten is. Voeg vervolgens langzaam twee milliliter voorbereide gesuspendeerde, gerehydrateerde hydroxyapatiet toe aan de bodem van de kolom met behulp van een steriele twee milliliter serologische pipette. Plaats de kolomdop weer op zijn plaats.
Laat de hydroxyapatiet onder invloed van de zwaartekracht gedurende 30 minuten bezinken. Deze methode vereist aandacht voor detail. De hydroxyapatietkolom verwerkt met een snelheid van 0,25 tot 0,5 mil per minuut.
Het is dus erg belangrijk om de kolom goed in de gaten te houden, zodat deze niet uitdroogt. Nadat 30 minuten zijn verstreken, opent u de stopkraan om de buffer in een afvalcontainer te laten lopen. Sluit de stopkraan en gooit de stroom erdoor weg.
Combineer nucleïnezuren met 0,12 molair fosfaatbuffer in een eindvolume van 500 microliter en incubeer het 60 graden Celsius gedurende 10 minuten. Dit zal de nucleïnezuren in temperatuur met de kolom gelijkmaken en zal de scheiding van de verschillende nucleïnezuursoorten verbeteren door eventuele secundaire structuren die aanwezig kunnen zijn te verwijderen. Gebruik een twee milliliter serologische pipette om de nucleïnezuuroplossing snel op de hydroxyapatiet aan te brengen en zorg ervoor dat de kolom niet wordt verstoord.
Zodra de volledige 500 microliter op de kolom stroomt, kan een
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het scheiden van enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA uit virale gemeenschappen in het milieu met behulp van hydroxyapatiet-chromatografie. De techniek maakt de isolatie van verschillende typen viraal nucleïnezuur mogelijk, wat verdere studie naar virale diversiteit en functionaliteit faciliteert.
Belangrijkste Onderdeelen van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Virologie
- Moleculaire biologie
- Milieuwetenschappen
Achtergrond
- Omgevingsvirale gemeenschappen zijn complex en divers.
- Inzicht in virale nucleïnezuren is essentieel voor het bestuderen van hun rollen in ecosystemen.
- Traditionele methoden scheiden verschillende typen nucleïnezuren mogelijk niet effectief.
- Hydroxyapatiet-chromatografie biedt een veelbelovende oplossing voor deze scheiding.
Doel van de studie
- Om een efficiënte methode te ontwikkelen voor het isoleren van virale nucleïnezuren.
- Om het begrip van de virale taxonomische diversiteit te vergroten.
- Om nucleïnezuren voor te bereiden voor verdere analyse, waaronder sequenering.
Gebruikte methoden
- Hydroxyapatiet-chromatografie werd gebruikt voor de scheiding van nucleïnezuren.
- Een kolom werd gepakt en geëquilibreerd met fosfaatbuffers.
- Nucleïnezuren werden op de kolom aangebracht en sequentieel geëlueerd.
- Elektroforese werd gebruikt om de scheidingsefficiëntie te bevestigen.
Belangrijkste resultaten
- Enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA zijn succesvol gescheiden.
- Er werd minder dan 9% overdracht van nucleïnezuren waargenomen.
- De methode maakt effectieve visualisatie en kwantificering van nucleïnezuren mogelijk.
- De resultaten ondersteunen de bestudering van virale assemblages in milieu-monsters.
Conclusies
- De hydroxyapatiet-chromatografiemethode is efficiënt voor de scheiding van nucleïnezuren.
- Deze techniek kan het onderzoek naar virale diversiteit en functionaliteit vergemakkelijken.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methode voor bredere toepassingen in de virologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het scheiden van nucleïnezuursubtypes uit gemengde virale assemblages maakt een uitgebreide karakterisering van de virale diversiteit mogelijk zonder genetische handtekeningen te verliezen, wat de validatie van targets bij de ontdekking van antivirale middelen ondersteunt. Hydroxyapatietchromatografie biedt een schaalbare, reproduceerbare methode om ssDNA-, dsDNA- en RNA-virussen te isoleren voor downstream sequencing en functionele assays. Deze aanpak vermindert mechanistische ambiguïteit in vroege ontdekkingsfasen door een parallelle evaluatie van alle virale genoomtypen in milieu monsters mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken voor alle virale genoomtypen in complexe assemblages.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door ssDNA-, dsDNA- en RNA-virale signaturen te behouden voor parallelle target-screening.
- Predictieve waarde: Faciliteert portfoliotriage door kwantitatieve opbrengsten van nucleïnezuren te verschaffen voor elk subtype voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gestandaardiseerde, gefractioneerde pools van viraal nucleïnezuur voor voor de ontwikkeling van assays tegen diverse virale doelwitten.
- Operationele waarde: Garandeert de gereedheid van de assay door reproduceerbare scheiding met <9% carry-over, wat betrouwbare screening van verbindingen mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt hergebruik van het platform voor meerdere virale community-monsters met consistente elutieprofielen door gebruik van gedefinieerde fosfaatbuffergradiënten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Handhaaft de continuïteit van virale monstername in het milieu tot aan preklinische validatie door genotype-specifieke nucleïnezuren te behouden.
- Mechanische risicoreductie: Maakt beoordeling van het functionele potentieel van ssDNA-, dsDNA- en RNA-virussen mogelijk om de selectie van preklinische modellen te onderbouwen.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door subtype-specifieke kwantificering te bieden voor de afstemming van biomarkers in translationele studies.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door fractionering van virale nucleïnezuren mogelijk te maken voorafgaand aan sequencing, assay-ontwikkeling en functionele screening, ter ondersteuning van campagnes voor de identificatie van lead-verbindingen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door het isoleren van ssDNA-, dsDNA- en RNA-virussen voor onafhankelijke functionele analyse.
- Screening: Levert assay-klare nucleïnezuurfracties met een hoge zuiverheid en minimale carry-over, wat betrouwbare high-throughput screening mogelijk maakt.
- Analytica: Biedt kwantitatieve nucleïnezuuropbrengsten en elektroforetische profielen die vergelijking tussen verschillende condities en tijdstippen mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt milieubemonstering met preklinische continuïteit door behoud van de integriteit van nucleïnezuren voor downstream validatie.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een herbruikbaar fractioneringsplatform dat toepasbaar is op diverse virale assemblages in meerdere projecten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij targetvalidatie door een volledige representatie van het virale genoom.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van nucleïnezuurscheiding tussen laboratoria.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium binnen antivirale programma's.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van volledige profielen van virale diversiteit.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de omgang met nucleïnezuren en chromatografische technieken.
- Afhankelijkheid van HPLC-compatibele systemen en infrastructuur voor fractieverzameling.
- Noodzaak voor gestandaardiseerde bereiding van fosfaatbuffer en temperatuurbeheersing op 60°C.
- Overwegingen voor aanpassing aan variërende virale lading en monstercomplexiteit uit milieubronnen.
- Praktische beperking: De stappen voor kolomequilibratie en binding vereisen een nauwkeurige timing om degradatie of verlies van nucleïnezuren te voorkomen.
