Live-cell Phagocytosis Assay of Microglia-Like Cells Using Human Synaptosomes
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 3:28 min • April 28th, 2025
Take a multi-well plate containing microglia-like cells exhibiting phagocytic activity.
Incubate with a nuclear stain to label nuclei.
Add an actin polymerization inhibitor to the negative control well.
During incubation, the inhibitor binds to actin filaments, inhibiting actin polymerization and phagocytosis.
Maintain the plate at low temperatures and add pH-sensitive dye-labeled human synaptosomes--isolated fragments of neural synaptic terminals.
Centrifuge the plate at low temperatures to promote cell-synaptosome interactions but prevent premature uptake.
Transfer the plate to a live-cell imaging system.
In the test well, synaptosomes are phagocytosed and fuse with lysosomes forming phagolysosomes. The lysosomal acidic environment activates the dye, resulting in its fluorescence.
Over time, in the test well, more synaptosomes are engulfed causing a further increase in fluorescence.
However, in the negative control well, actin polymerization is inhibited, preventing synaptosome uptake. The resulting minimal fluorescence confirms the fluorescence dependence on actin-mediated phagocytosis.
On the day of the assay, remove 40 microliters of medium per well, and add 10 microliters of the nuclear staining solution. Incubate the plate for two hours. Thaw the labeled synaptosomes on ice and gently sonicate using a water sonicator for one minute. Again, immediately place the synaptosomes on ice. Dilute the labeled synaptosomes and IMG complete medium at 1 microliter of synaptosomes per 50 microliters of medium.
For negative control, prepare 60 micromolar cytochalasin D in IMG complete medium to inhibit actin polymerization, and thus phagocytosis. Then, add 10 microliters of this solution to each well for a final concentration of 10 micromolar and incubate for 30 minutes. Remove the plate from the incubator and incubate at 10 degrees Celsius for 10 minutes. Maintain the plate on ice and add 50 microliters of medium containing synaptosomes.
Centrifuge the plate at 270 times g for three minutes at 10 degrees Celsius and maintain the plate on ice until imaging acquisition. Insert the plate into a live cell imaging reader and select the wells to be analyzed. Then, select a 20x objective lens. Next, adjust the focus Light Emitting Diode or LED intensity integration time and gain of the bright field and blue channels. The synaptosomes fluorescence should be negligible at the initial time point.
Select the number of individual tiles to be acquired in a montage per well. Acquire 16 tiles at the center of the well, imaging approximately 5% of the total well area. Set the temperature to 37 degrees Celsius and the desired time interval for imaging.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de fagocytische activiteit van microglia-achtige cellen met behulp van een live-cell imaging-systeem. De effecten van actinpolymerisatie-inhibitie op de opname van synaptosomen worden geanalyseerd om de mechanismen van fagocytose te begrijpen.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Microglia zijn immuuncellen in de hersenen die een cruciale rol spelen bij het handhaven van de homeostase.
- Fagocytose is een kernfunctie van microglia, waardoor zij debris en synaptische componenten kunnen opruimen.
- Actinepolymerisatie is essentieel voor het fagocytische proces in veel celtypen.
- Het begrijpen van de mechanismen van fagocytose kan inzicht bieden in neuroinflammatoire aandoeningen.
Doel van de studie
- Om de rol van actinpolymerisatie bij de fagocytose van synaptosomen door microglia-achtige cellen te beoordelen.
- Om live-cell imaging te gebruiken voor het visualiseren van de dynamiek van de opname van synaptosomen.
- Om een controleconditie vast te stellen waarin actinpolymerisatie wordt geremd ten behoeve van vergelijking.
Gebruikte methoden
- Microglia-achtige cellen werden gekweekt in multi-well platen en behandeld met kernkleuringen.
- Aan de wells van de negatieve controle werd een actinpolymerisatie-remmer toegevoegd.
- Synaptosomen werden gelabeld met een pH-gevoelige kleurstof en geïncubeerd met de cellen.
- Er werd live-cell imaging uitgevoerd om fluorescentieveranderingen te monitoren die indicatief zijn voor fagocytose.
Belangrijkste resultaten
- In de testputjes wees een toename van de fluorescentie op succesvolle fagocytose van synaptosomen.
- De putjes van de negatieve controle vertoonden minimale fluorescentie als gevolg van geremde actinpolymerisatie.
- De fluorescentie-intensiteit correleerde met het aantal synaptosomen dat in de loop van de tijd werd opgenomen.
- De resultaten bevestigden de afhankelijkheid van fagocytose van de actin-dynamiek.
Conclusies
- Actinepolymerisatie is essentieel voor de fagocytische activiteit van microglia-achtige cellen.
- Live-cell imaging is een effectieve methode voor het bestuderen van cellulaire interacties en dynamiek.
- Deze studie vergroot het begrip van de microgliafunctie bij synaptisch onderhoud en neuroinflammatie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Kwantitatieve live-cell fagocytose-assays met gebruik van humane synaptosomen en microglia-achtige cellen bieden een robuust platform voor het onderzoeken van neuro-immuunmechanismen die relevant zijn voor pijplijnen voor neurodegeneratieve ziekten. Deze benadering maakt mechanistische risicoreductie en targetvalidatie mogelijk door actin-afhankelijke fagocytische functies te isoleren in een menselijk relevant systeem. De assay ondersteunt voorspellende betrouwbaarheid voor beslissingen in een vroeg stadium van de portfolio binnen onderzoek naar neuro-inflammatie en synaptisch onderhoud.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt functionele validatie van microgliale fagocytosepaden mogelijk met behulp van substraten van menselijke oorsprong.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door actinpolymerisatie te isoleren als een kritieke variabele bij synaptische klaring.
- Faciliteert hypothese-gestuurde analyse van neuro-immuuntargets die betrokken zijn bij ziekteprogressie.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een reproduceerbare, kwantitatieve uitlezing van fagocytische activiteit via pH-gevoelige fluorescentie.
- Standaardiseert negatieve controles met behulp van actinepolymeriseringsremmers voor assayspecificiteit.
- Bereidt gevalideerde microglia-achtige cellsystemen voor voor downstream compound-screening of genetische perturbatiestudies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt in vitro fagocytose-metrieken uit met ziekterelevante mechanismen van synaptische klaring.
- Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking naar preklinische validatie in modellen van neuroinflammatie en neurodegeneratie.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van neuro-immune targets op basis van functioneel bewijs.
Pipeline- & Workflowintegratie
Deze live-cell assay bevindt zich in het continuüm van vroege ontdekking tot lead-identificatie en levert bruikbare gegevens voor target-validatie en mechanistische studies in de neurobiologie.
- Discovery Biology: Kwantificeert actine-afhankelijke fagocytose, wat inzicht geeft in de betrokkenheid van signaalroutes bij synaptische klaring.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare fluorescentie-gebaseerde resultaten voor comparatieve analyse.
- Analytics: Maakt tijdopgeloste meting van synaptosoomopname en statistische vergelijking tussen condities mogelijk.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische modellen van neuroinflammatie wanneer deze in overeenstemming zijn met ziektemechanismen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar assay-platform voor diverse neuro-immuun target-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij de validatie van neuro-immuuntargets en het mechanistisch verminderen van risico's.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van assays binnen discoveryteams.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door het verstrekken van kwantitatieve, mens-relevante functionele gegevens.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van programma's voor neuro-inflammatie en synaptisch onderhoud.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in live-cell imaging en kwantitatieve fluorescentieanalyse.
- Toegang tot menselijke synaptosoompreparaten en gevalideerde microglia-achtige celculturen is noodzakelijk.
- Gestandaardiseerde negatieve controles zijn vereist voor de specificiteit en reproduceerbaarheid van de assay.
- Aanpassing voor verschillende celbronnen of synaptische substraten kan noodzakelijk zijn.
- Afhankelijk van de imaging-infrastructuur en robuuste data-analysepipelines.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Een nieuwe Live-imaging van In Vitro Assay voor Astrocyt-gemedieerde fagocytose met behulp van pH-Indicator-geconjugeerde Synaptosomes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
In vitro kwantitatieve beeldvormingstest voor fagocytose van dode neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Mesenchymale stamcelregulatie van macrofaagfagocytose; Kwantificering en beeldvorming
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Primaire Microglia Isolatie van Mixed gliale celculturen van neonatale rat hersenweefsel
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Microglial Phagocytosis Assay: An In Vitro Assay to Establish Microglial Phagocytosis Model for Neuroblastoma Cells Using iPSC Macrophages
Gerelateerde video's
0 Bekeken
In Vitro Phagocytosis Assay: A Live Imaging Based Method to Study Real-time Astrocyte Mediated Synaptosome Phagocytosis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells into Microglia-Like Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een Engulfment Assay: Een protocol bij interacties tussen CNS Fagocyten en Neuronen Assess
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Humane microglia-achtige cellen: differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen en in vitro live-cel fagocytosetest met behulp van humane synaptosomen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026