Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 4:06 min • April 28th, 2025
Take a chemically-fixed mouse brain section.
Add a hybridization mixture containing a permeabilization agent and RNA probes labeled with FITC or DIG.
Incubate to allow cell permeabilization and probe entry.
The probes bind to complementary sequences on MBP mRNA, a reference marker ubiquitously expressed in oligodendrocytes, or ASPA mRNA, the target.
Wash to remove unbound probes.
Add a blocking buffer to prevent non-specific antibody binding.
Introduce HRP-conjugated anti-FITC antibodies targeting the FITC-labeled probe.
Wash, then add FITC-tyramide.
HRP oxidizes FITC-tyramide into a highly reactive form that binds to nearby proteins, amplifying the fluorescence signal.
Wash and reintroduce the blocking buffer.
Add alkaline phosphatase-conjugated anti-DIG antibodies targeting the DIG-labeled probe.
Wash and apply the Fast Red solution.
Alkaline phosphatase dephosphorylates Fast Red, producing a fluorescent precipitate.
Visualize under a fluorescence microscope.
Co-localization of Mbp and ASPA signals indicates ASPA expression in oligodendrocytes.
Dilute the two probes in hybridization buffer, pre-warmed to 65 degrees Celsius, and mix well. Apply 300 microliters of hybridization mixture onto each slide, and cover with an oven baked coverslip. Subsequently, incubate the slides overnight at 65 degrees Celsius in a humidified chamber.
The next day, transfer the slides into a Coplin jar containing pre-warmed wash buffer, and wash the slides for 30 minutes, twice at 65 degrees Celsius. After that, wash the slides for 10 minutes three times with MABT wash solution at room temperature.
In this step, use a hydrophobic pen to draw circles around the tissue sections. Then, incubate the slides for one hour at room temperature with ISH blocking buffer in a humidified chamber. Next, incubate the slides overnight at 4 degrees Celsius with a horseradish peroxidase-conjugated anti-FITC antibody.
Then, place the slides into a Coplin jar containing PBST. Wash them in PBST three times for 10 minutes each time, and replace with fresh PBST each time. Afterward, add fluorescent tyramide to the slides, and leave them for 10 minutes at room temperature. Place the slides into a Coplin jar, and wash in PBST for 10 minutes three times.
Subsequently, incubate the slides with ISH blocking buffer for one hour at room temperature. Then, incubate the slides overnight at 4 degrees Celsius with an alkaline phosphatase conjugated anti-DIG antibody. After that, wash them with MABT three times for 10 minutes each time. Next, wash the slides twice with 0.1 molar Tris-HCL at pH 8.2 for five minutes at room temperature.
Filter the fast red solution, and incubate the slides at 37 degrees Celsius with fast red solution in a humidified chamber. As the time for optimal development varies, check the slides regularly with a fluorescent microscope to monitor the formation of precipitate. Then, wash them three times with PBST for 10 minutes each time.
Overzicht
Dit artikel beschrijft in detail een methode voor het detecteren van mRNA-expressie in oligodendrocyten met behulp van fluorescentiemicroscopie. De techniek omvat de hybridisatie van RNA-probes aan specifieke mRNA-targets, gevolgd door signaalversterking en visualisatie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- Oligodendrocyten spelen een cruciale rol in het centrale zenuwstelsel.
- Het begrijpen van de mRNA-expressie in deze cellen kan inzicht verschaffen in neurologische aandoeningen.
- Fluorescentiemicroscopie maakt de visualisatie van specifieke mRNA-doelen mogelijk.
- Hybridisatietechnieken zijn essentieel voor het bestuderen van genexpressie.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het detecteren van ASPA mRNA in oligodendrocyten.
- Het verbeteren van de visualisatie van mRNA door middel van signaalversterking.
- Het aantonen van de co-lokalisatie van MBP- en ASPA-signalen.
Gebruikte methoden
- Preparatie van chemisch gefixeerde hersensecties van muizen.
- Toepassing van een hybridisatiemengsel met RNA-probes.
- Gebruik van blokkeringsbuffers om aspecifieke binding te voorkomen.
- Fluorescentiemicroscopie voor visualisatie van mRNA-expressie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle binding van probes aan doel-mRNA-sequenties.
- Amplificatie van fluorescentiesignalen via enzymatische reacties.
- Colocalisatie van MBP- en ASPA-signalen bevestigde de expressie van ASPA.
- De methode bleek betrouwbaar voor het bestuderen van mRNA in oligodendrocyten.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is effectief voor het detecteren van specifiek mRNA in hersenweefsels.
- Amplificatie van het fluorescentiesignaal verbetert de visualisatiemogelijkheden.
- Deze techniek kan worden toegepast in verdere studies naar de functie van oligodendrocyten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dubbele fluorescentie-in-situ hybridisatie (FISH) maakt nauwkeurige ruimtelijke mapping van genexpressie in hersensecties van muizen mogelijk, wat vroege ontdekking en targetvalidatie in neurobiologie-gerichte R&D ondersteunt. Het vermogen van de methode om twee RNA-targets met hoge sensitiviteit gelijktijdig te detecteren, biedt mechanistische helderheid en voorspellend vertrouwen voor de analyse van signaalpaden en celtype-specifieke expressie. Deze mogelijkheid is cruciaal voor het verminderen van risico's bij targets en het informeren van portfoliobeslissingen bij de ontwikkeling van geneesmiddelen voor het CZS.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe visualisatie van gen-coexpressie in gedefinieerde neurale celpopulaties mogelijk.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door de aanwezigheid van target-RNA in ziekterelevante celtypen te bevestigen.
- Faciliteert functionele target-validatie via ruimtelijk opgeloste expressieanalyse.
- Biedt voorspellend vertrouwen voor het doorvoeren van targets naar screening-pipelines.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt gevalideerde weefselgebaseerde assays vast voor downstream evaluatie van verbindingen.
- Levert kwantitatieve en reproduceerbare fluorescentie-uitlezingen voor assay-standaardisatie.
- Maakt robuuste co-lokalisatieanalyse mogelijk ter ondersteuning van gemultiplexte screeningsstrategieën.
- Bereidt biologische systemen voor op schaalbare high-content imaging-workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt genexpressiegegevens uit met ziekterelevante neurale circuits en celtypen.
- Ondersteunt de identificatie van translationele biomarkers via ruimtelijke transcriptomica.
- Zorgt voor continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door moleculaire bevindingen te koppelen aan de weefselcontext.
- Vermindert het translationele risico door target-engagement te bevestigen in relevante hersengebieden.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit dubbele FISH-protocol integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door hypothese-gestuurde validatie van genexpressie in situ mogelijk te maken, wat zowel de selectie van targets als biomarkerstrategieën ondersteunt.
- Discovery Biology: Bevestigt ruimtelijke en celtype-specifieke expressie van kandidaat-targets in hersenweefsel.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare fluorescentiedata voor de ontwikkeling en optimalisatie van assays.
- Analytics: Biedt colocalisatie- en intensiteitsmetingen om genexpressie tussen verschillende condities te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen moleculaire ontdekking en validatie op weefselniveau voor de afstemming van biomarkers.
- Bedrijfsbrede Hergebruik: Biedt een gestandaardiseerd, aanpasbaar platform voor gemultiplexte genexpressieanalyse binnen CNS-programma's.
Operationele en ondernemingsbrede impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en schaalbare assays op basis van weefsel.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalallocatie door de targetbiologie in een vroeg stadium te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering en voortgang van CNS-targets en biomarkers mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in weefselverwerking, probe-ontwerp en fluorescentiemicroscopie.
- Vereist toegang tot hoogwaardige infrastructuur voor beeldvorming en kwantitatieve analyse.
- Maakt standaardisatie van probe-labeling en detectieprotocollen tussen verschillende teams noodzakelijk.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende weefseltypen of RNA-targets.
- Stappen voor signaalversterking moeten worden geoptimaliseerd om een balans te vinden tussen sensitiviteit en specificiteit.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Lokalisatie van Receptorgenen van Reukstof in Locustantenne door RNA
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Visualisatie van SARS-CoV-2 met behulp van Immuno RNA-Fluorescentie In Situ Hybridisatie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Dubbele Fluorescentie In situ Hybridisatie in Fresh Brain secties
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Multiphoton Microscopie van Gewist Mouse Brain uiten YFP
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Immunostaining of Neurons in Mouse Brain Slices Following Fluorescence In Situ Hybridization
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Detectie van Axonally Gelokaliseerde mRNA in Brain secties met behulp van High-Resolution
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Laterale Septal Nucleus- en Striatum-specifieke
Gerelateerde video's
0 Bekeken
De combinatie van Double Fluorescentie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het gebruiken van dichtbijgelegen-infrarode fluorescentie en hoge resolutie het scannen om eiwituitdrukking in de knaagdieren hersenen te meten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026