Kwantificering en analyse van de vorming van HO-endonuclease chromosomale translocaties Gestimuleerd door Single-Strand Gloeien in Saccharomyces cerevisiae

Het algemene doel van deze procedure is om de genetische controle van translocatievorming door eenzijdige knielen in diploïde knopgistencellen te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst culturen te inoculeren met enkele kolonies van een specifiek genotype en ze een nacht te laten groeien. De tweede stap van de procedure is om gelijktijdige dubbelstrengsbreukvorming te induceren door ho-endonuclease op twee chromosomen door de toevoeging van galactose aan de culturen.

Vervolgens worden verdunningsreeksen van deze culturen op selectieve en niet-selectieve media geplaatst. De laatste stap is om de translocatiefrequentie te bepalen door kolonies op selectieve en niet-selectieve media te tellen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die genetische controle van translocatievorming door een enkel streeng tonen, een knielen door veranderingen in de frequentie van ho-gestimulante translocatievorming in stammen van verschillende genotypen.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de gevolgen van therapeutische stralingsblootstelling van kankerpatiënten omdat DNA-dubbelstrengsbreuken en translocatievorming de primaire gevolgen zijn van deze behandeling. Om de procedure voor het bepalen van ho-gestimulante translocatiefrequenties te beginnen, inoculeert u 10 tot 20 onafhankelijke één milliliter culturen van Y peak glycerol lactate medium met enkele kolonies van het gewenste genotype, en incubeert u de culturen een nacht bij 30 graden Celsius op een rotator. Wanneer de culturen de gewenste celdichtheid hebben bereikt, voegt u 20% galactose toe aan de culturen tot een eindconcentratie van 2%. De galactose zal de expressie van de ho-endonuclease induceren, die dubbelstrengsbreuken zal richten op het geschiedenis delta vijf prim allel op chromosoom drie en heeft drie delta drie prim allel op chromosoom 15. Incubeer gedurende vier uur bij 30 graden Celsius op een rotator.

De volgende stap is cruciaal voor het succes van de procedure. Zorgvuldige verdunning en platering van de culturen is van essentieel belang. Als u translocatiefrequenties krijgt die voldoende reproduceerbaar zijn om statistisch significante vergelijkingen tussen stammen van verschillende genotypen mogelijk te maken. Na vier uur, plateer geschikte verdunning van de culturen op medium zonder histidine en op YPD td ongeveer 100 tot 200 kolonies per plaat. Incubeer platen bij 30 graden Celsius gedurende twee tot drie dagen.

Wanneer kolonies ontstaan, kan de translocatiefrequentie worden bepaald. Plateringsefficiënties vóór en na inductie van ho-endonuclease-expressie zullen aangeven of de aanwezigheid of afwezigheid van een van beide translocatie-chromosomen de overlevingskans van DSB-vorming beïnvloedt. Dat fragmenteert één kopie van zowel chromosoom drie als chromosoom vijftien om de plateringsefficiëntie vóór inductie te bepalen.

Verwijder eerst een aliquot cellen uit elke nachtelijke cultuur en bepaal het aantal cellen door te tellen met een hemo cytometer. Gebruik vervolgens een geschikte verdunning om ongeveer 100 tot 200 cellen op YPD te plateren. Incubeer gedurende twee tot drie dagen bij 30 graden Celsius totdat kolonies ontstaan. Voeg 20% galactose toe aan de resterende culturen tot een eindconcentratie van 2% en incubeer gedurende vier uur bij 30 graden Celsius om de plateringsefficiëntie na inductie te bepalen.

Verwijder een aliquot cellen uit elke cultuur na vier uur inductie en bepaal het aantal cellen met een hemo cytometer. Tel ongeveer 100 tot 200 cellen op een geschikte verdunning op YPD en incubeer gedurende twee tot drie dagen bij 30 graden Celsius totdat kolonies ontstaan. Zodra kolonies op de platen ontstaan, kan de plateringsefficiëntie worden bepaald. Veronderstelde translocatiedragende klonen kunnen worden onderzocht door southern blot.

Deze procedure gebruikt genomisch DNA dat is bereid uit een enkele hiss plus recombinante kolonie van elke onafhankelijke proef. Bereid ongeveer vier microgram van elk DNA-monster met BAM H een restrictie-endonuclease, scheid BAM H een gedigesteerde fragmenten op een 0,7% aros she en draag vervolgens over naar een positief geladen nylonmembraan gehybridiseerd met een P 32-gelabelde sonde verkregen door willekeurige priming met een 1,8 KILOBASE BMH een BMH een genomische kloon bevattende het HIS drie gen. Visualiseer DNA-fragmenten door auto radiografie of fosfo-beeldvorming. Een andere manier om veronderstelde translocatiedragende klonen te onderzoeken is door chromosoomplotanalyse.

Chromosomen worden eerst bereid uit geselecteerde hiss plus recombinanten in aros-pluggen. Scheid chromosomen op een 1% aros-gel in een contour-geklemde homogene elektrische veld- of chef bij 14 graden Celsius. De volgende parameters worden gebruikt: eerste blok 14 graden Celsius, 72ste schakeltijd en 15 uur bij zes volt per centimeter, tweede blok 14 graden Celsius, 122ste schakeltijd en 11 uur bij zes volt per centimeter. Na voltooiing van de elektroforese, visualiseer chromosomen door de gel gedurende 30 minuten met AUM bromide te kleuren, gevolgd door bestraling met UV en vasthouden en gedistilleerd water. Breng chromosomen over naar een positief geladen membraan door capillaire actie.

Hybridiseer onder denaturerende omstandigheden met een P 32-gelabelde sonde verkregen door willekeurige priming met een 1,8 kilobase bam H een bam H een genomische kloon bevattende de hiss. Drie gen visualiseer chromosomen door auto radiografie of fosfo-beeldvorming. De frequentie van chromosomale translocaties kan worden berekend door het aantal histamine-fototrofe kolonies te delen door het totale aantal levensvatbare cellen bepaald door platering op YPD.

In dit voorbeeld is de berekende recombinatiefrequentie ongeveer 3%. De test voor ho-gestimulante translocatiefrequenties kan worden uitgevoerd met stammen van verschillende genotypen om verschillen in het vermogen om dubbelstrengsbreuken door een enkel streeng te repareren te vergelijken. Een knielen zoals getoond in deze representatieve grafiek. De verkregen translocatiefrequenties, zowel selectief als niet-selectief met de RAD 51 delta null homozygoot, waren statistisch verschillend van die verkregen met de overeenkomstige omstandigheden met de wild-type stam, zowel voor als na platering bij inductie.

Efficiënties worden bepaald door het totale aantal levensvatbare kolonievormingscellen te del