Confocal Microscopy Imaging of Intact Dendritic Arbors and Spine Morphology in a Cleared Mouse Brain
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 4:02 min • May 29th, 2025
Take a cleared mouse brain with cells expressing fluorescent proteins and lipids removed for transparency for deep-structure imaging with high resolution.
A hydrogel mesh preserves biomolecules and maintains neuronal networks.
Transfer the brain into an imaging chamber containing an agarose ring for support.
Secure the tissue with adhesive and fill the chamber with a refractive index matching solution to minimize light scattering and create a stable imaging environment.
Place the chamber on a confocal microscope stage and gently lower the objective into the solution to establish a continuous column of contact.
Use epifluorescence to locate regions of interest. Then, adjust the laser and imaging parameters to optimize image quality.
Capture a series of z-stacks to create a three-dimensional representation of the tissue.
Use appropriate software to analyze cellular morphology, including dendritic arbors, their spines, and the distribution and density of neurons.
To construct a large tissue imaging chamber for tissues with more than a 5 millimeter thickness, use a 10 centimeter glass dish with a high wall. Place a 50 milliliter conical tube in the center, making sure that the diameter of the tube is large enough to accept the barrel of the objective lens used. Make 3% agarose in water and pour it in the space between the glass dish and the conical tube.
Then allow it to cool for one hour. This will form a ring of solid agarose. Securely adhere the tissue to the bottom of the chamber using superglue, and fill the chamber with refractive index matching solution, which may start to polymerize unless preserved from air and stored at 4 degrees Celsius. Acquire the image using a confocal microscope.
Turn on all the relevant imaging equipment. Place the sample on the stage. Carefully approach the immersion media with the objective and form a continuous column of media. Using epifluorescence, find an appropriate imaging field. Start by setting the resolution and scan speed settings.
If imaging using a confocal microscope, fully close the pinhole to obtain the smallest optical section and thus the best Z resolution. Gradually increase the laser power or sensor gain until a suitable image is obtained with a high signal to noise ratio. If utilizing standard EGFP or tdTomato two color imaging, set the light collection settings.
Set the Z stack parameters based on the observed start and endpoints of the tissue. Set the step size based on the desired Z resolution. Smaller step sizes will yield a greater Z resolution, but may lead to sample bleaching.
When satisfied with the image acquisition settings, acquire the image. Ensure that the image has a high signal to noise ratio, and shows distinct boundaries of structures.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het afbeelden van geklaarde muizenhersenen met behulp van confocale microscopie. De techniek maakt hoogresolutie visualisatie van neuronale netwerken en cellulaire morfologie mogelijk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Beeldvormingstechnieken
- Cellulaire biologie
Achtergrond
- Klaringsmethoden verbeteren de beeldkwaliteit door lipiden te verwijderen.
- Fluorescente eiwitten helpen bij het visualiseren van specifieke cellulaire structuren.
- Hydrogelnetwerken behouden biomoleculen tijdens beeldvorming.
- Confocale microscopie levert gedetailleerde driedimensionale beelden.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het imagen van dik brain-weefsel.
- Om imaging-parameters te optimaliseren voor datavisualisatie van hoge kwaliteit.
- Om neuronale morfologie en netwerkstructuren te analyseren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een geklaarde muizenhersenen met fluorescerende eiwitten.
- Gebruik van een hydrogelnet om de integriteit van het weefsel te behouden.
- Beeldvorming met confocale microscopie en epifluorescentie.
- Analyse van de cellulaire morfologie met behulp van gespecialiseerde software.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle beeldvorming van neuronale netwerken in geklaarde hersenweefsels.
- Hogeresolutie z-stacks vastgelegd voor gedetailleerde analyse.
- Geoptimaliseerde beeldvormingsparameters resulteerden in hoge signaal-ruisverhoudingen.
- De effectiviteit van de agarose-ringopstelling voor dikke weefsels is aangetoond.
Conclusies
- De methode biedt een robuuste benadering voor het in beeld brengen van complexe hersenstructuren.
- Beeldvorming van hoge kwaliteit kan zorgen voor een beter begrip van neuronale netwerken.
- Toekomstige toepassingen kunnen het bestuderen van diverse neurologische aandoeningen omvatten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Hoge-resolutie confocale beeldvorming van intacte dendritische bomen en spine-morfologie in geklaarde muizenhersenen maakt kwantitatieve analyse mogelijk van de neuronale architectuur, wat cruciaal is voor vroege drug discovery in het centrale zenuwstelsel. Deze workflow ondersteunt mechanische risicoreductie en voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door gedetailleerde, driedimensionale cellulaire context te bieden. De aanpak verbetert de translationele continuïteit door moleculaire bevindingen te koppelen aan complexe fenotypen op weefselniveau.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Kwantitatieve beeldvorming van dendritische morfologie en spine-morfologie ondersteunt functionele target-validatie in de neurobiologie.
- Driedimensionale reconstructie verduidelijkt de architectuur van neurale netwerken voor mechanistische risicoreductie.
- Gedetailleerde cellulaire mapping onderbouwt het voorspellend vertrouwen bij de selectie van CNS-targets.
Screening & assayontwikkeling
- De bereiding van geklaard, structureel behouden weefsel maakt reproduceerbare imaging-assays mogelijk.
- Gestandaardiseerde imaging-parameters en z-stack acquisitie ondersteunen de schaalbaarheid van de assay en het hergebruik van het platform.
- Kwantitatieve morfologische resultaten faciliteren een betrouwbare evaluatie van verbindingen in fenotypische screens.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Afstemming van de cellulaire morfologie op ziekte-relevante modellen bevordert de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Continuïteit van moleculaire ontdekking naar validatie op weefselniveau ondersteunt beslissingen over risico-gecorrigeerde voortgang.
- Driedimensionale datasets maken vergelijking tussen modellen mogelijk voor preklinische validatie.
Integratie van pipeline en workflow
Deze workflow voor confocale beeldvorming is geïntegreerd van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek en ondersteunt hypothesetoetsing, targetvalidatie en de afstemming van translationele biomarkers in CNS-portfolio's.
- Discovery Biology: Maakt hypothese-gestuurde analyse van neuronale structuur en connectiviteit mogelijk.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve beelduitkomsten voor de ontwikkeling van assays.
- Analytics: Biedt morfologische metingen met een hoge resolutie voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de afstemming van cellulaire fenotypes met ziektemodellen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd beedplatform dat aanpasbaar is voor diverse onderzoeksprogramma's naar het centrale zenuwstelsel.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van CNS-targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert imaging-workflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door robuuste morfologische analyse mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van CNS-ontdekkingsprogramma's.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in confocale microscopie en technieken voor weefselklaring.
- Vereist toegang tot imaging-systemen met een hoge resolutie en analytische software.
- Maakt standaardisatie van imaging-parameters en analyseprotocollen tussen teams noodzakelijk.
- Aanpassingen kunnen nodig zijn voor verschillende weefseltypen of modelsystemen.
- Bleken van monsters en beperkingen in de imaging-diepte moeten tijdens de acquisitie worden beheerd.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Beeldvorming Serotonerge vezels in de muis Spinal Cord Met behulp van de DUIDELIJKHEID / CUBIC Techniek
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Optische Clearing van de Muis centrale zenuwstelsel met passieve DUIDELIJKHEID
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Twee-foton Calcium Imaging in neuronale Dendrites in hersenen plakjes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Chronische Imaging van de muis visuele cortex met behulp van een verdunde-schedel Voorbereiding
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Analyse van de dendritische Spine Morfologie in gekweekte CNS Neuronen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Quantification of Dendritic Spines Using Confocal Microscopy Imaging
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Beeldvorming Dendritische stekels van Rat Primaire hippocampus neuronen met behulp van Structured Illumination Microscopie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Imaging Ontruimde Intact Biological Systems op cellulair niveau door 3DISCO
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Twee-Photon
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Beoordeling van Dendritische arborization in de gyrus dentatus van de hippocampus regio in Muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026