Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 3:13 min • May 29th, 2025
Begin with a transgenic mouse secured in a stereotactic frame, with a cranial window implanted over its visual cortex.
The mouse expresses EGFP in the microglia and R-CaMP, a red fluorescent calcium indicator, in the neurons of the visual cortex.
Position the mouse under a two-photon microscope and adjust the objective lens to focus on the brain surface.
Move the mouse with the stereotactic frame from the objective lens and attach a shading device.
Fill the shading device with water and reposition the mouse under the microscope.
Cover the lens with black foil.
The shading device and foil block external light interference, ensuring accurate imaging.
Place an LCD monitor in front of the mouse’s eye to provide visual stimulation.
Set the imaging parameters and begin imaging.
Visual stimulation triggers neuronal excitation, leading to calcium influx and an increase in R-CaMP fluorescence.
Meanwhile, microglia retract their processes while interacting with activated neurons, as observed through live imaging.
To install the custom-made shading device, and an LCD monitor for visual stimulation, first, position the lens to focus on the brain surface. And then set this lens position as the original z position. Keep the x, y-coordinates constant and elevate the objective lens. Remove the mouse and stereotaxic instrument from the objective lens. Attach a shading device on the top of the head plate using silicone, ensuring that the space between the head plate and the shading device is well sealed.
Fill the shading device with distilled water. Then, fix the mouse with the stereotaxic frame under the objective lens. Carefully reset the focal plane at the brain surface, checking the depth of the objective lens. Cover the objective lens with black aluminum foil to avoid light contamination from the LCD monitor. Set a 10-inch LCD monitor at 12.5 centimeters in front of the eyes of the mouse to present visual stimuli.
Configure the fluorescence emission collection filters for EGFP and RCaMP, and the excitation wavelength to 1,000 nanometers. Acquire images with a spatial resolution of 0.25 microns per pixel. Find the imaging region where RCaMP-positive neurons and EGFP-positive microglia can be simultaneously imaged in Layer 2/3.
Acquire images at the frame rate of 30 Hertz. Simultaneously, with the image acquisition, present drifting grating visual stimuli to the mouse in 12 directions at 6 orientations from 0 to 150 degrees in 30-degree steps.
Overzicht
Deze studie demonstreert een methode voor het in beeld brengen van neuronale en microgliale activiteit in de visuele cortex van transgene muizen met behulp van tweefotonmicroscopie. De aanpak maakt het mogelijk om de calciumdynamiek in neuronen en het gedrag van microglia als reactie op visuele stimuli te observeren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Beeldvormingstechnieken
- Cellulaire biologie
Achtergrond
- Transgene muizen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, worden gebruikt voor live imaging.
- Microglia spelen een cruciale rol in de respons van de hersenen op neuronale activiteit.
- Calciumindicatoren zoals R-CaMP maken de visualisatie van neuronale excitatie mogelijk.
- Twee-fotonenmicroscopie biedt resolutie-rijke beeldvorming van hersenstructuren.
Doel van de studie
- Om de interacties tussen geactiveerde neuronen en microglia tijdens visuele stimulatie te onderzoeken.
- Om de veranderingen in calciumgehaltes in neuronen als reactie op visuele stimuli te beoordelen.
- Om een betrouwbare imaging-opstelling te ontwikkelen voor het observeren van hersenactiviteit in vivo.
Gebruikte methoden
- Transgeen muismodel met EGFP in microglia en R-CaMP in neuronen.
- Tweefotonmicroscopie voor het in beeld brengen van neuronale en microgliële activiteit.
- Aangepast afschermingsapparaat om externe lichtinterferentie te blokkeren.
- Visuele stimulatie met behulp van een LCD-monitor om verschuivende roosterprikkels te presenteren.
Belangrijkste resultaten
- Neuronale excitatie werd waargenomen als een toename in R-CaMP fluorescentie.
- Microglia trokken hun uitlopers terug als reactie op geactiveerde neuronen.
- Gelijktijdige beeldvorming van R-CaMP-positieve neuronen en EGFP-positieve microglia werd gerealiseerd.
- Visuele stimuli veroorzaakten een calciuminstroom in neuronen, wat hun responsiviteit aantoont.
Conclusies
- De ontwikkelde methode maakt real-time observatie van interacties tussen neuronen en microglia mogelijk.
- Deze benadering kan het begrip van cellulaire dynamiek in de hersenen verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen deze methode gebruiken om diverse aspecten van de neurobiologie te verkennen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode maakt real-time observatie van microgliële-neuronale interacties in wakker animals mogelijk, waardoor een fysiologisch relevant systeem ontstaat voor het bestuderen van neuro-immuunmechanismen. Het ondersteunt targetvalidatie in modellen van neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten door dynamische cellulaire responsen op stimuli vast te leggen. De aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen bij preklinische screening door neuronale activatie te koppelen aan het gedrag van microglia in intacte circuits.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen over de microgliële modulatie van neuronale activiteit in ziekte-relevante circuits.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie mogelijk van targets die betrokken zijn bij neuro-immuunsignalering via live-imaging van cellulaire dynamiek.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door target-engagement en downstream cellulaire responsen in real-time te visualiseren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op het screenen van verbindingen die de dynamiek van microgliaprocessen of de neuronale calciumflux moduleren.
- Operationele waarde: Standaardiseert beeldparameters en stimulatieprotocollen voor reproduceerbare, kwantitatieve resultaten over verschillende experimentsessies.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt hergebruik van het platform voor longitudinale studies naar drugseffecten op neuro-immuuninteracties in wakker preparations.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij ziekterelevante systemen door neuro-immuuninteracties in intacte corticale lagen tijdens sensorische verwerking te modelleren.
- Operationele waarde: Maakt continuïteit mogelijk van target-identificatie tot preklinische validatie door dynamische biomarkers van cellulaire interactie vast te leggen.
- Risicobeperking: Ondersteunt beslissingen over verdere ontwikkeling door off-target effecten op de microgliamorfologie of neuronale exciteerbaarheid te onthullen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van hypothesen over targets tot lead-optimalisatie, in het bijzonder voor neuro-immuunmodulerende verbindingen waarbij mechanistische helderheid cruciaal is.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en padverduidelijking door neuronale activatie in real-time te correleren met de retractie van microgliaprocessen.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk door gestandaardiseerde visuele stimulatie en dual-channel fluorescentiedetectie voor een consistente evaluatie van verbindingen.
- Analytiek: Biedt kwantitatieve metingen van calciumtransiënten en microgliamobiliteit, wat een objectieve vergelijking van behandelingseffecten mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit door dynamische biomarkers vast te leggen die neuro-immuuntoestanden weerspiegelen die relevant zijn voor ziekteprogressie.
- Hergebruik binnen de organisatie: Fungeert als een herbruikbaar imagingplatform voor meerdere projecten die neuro-immuunmechanismen in vivo onderzoeken.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door ambiguïteit in mechanistische verbanden tussen microglia en neuronen te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde protocollen voor beschaduwing, stimulatie en beeldvorming.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege functionele readouts te verschaffen over de modulatie van neuro-immuuntargets.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van effecten op de dynamiek van cellulaire interacties.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de omgang met transgene dieren, craniale window-chirurgie en het bedienen van twee-fotonmicroscopie.
- Afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder een twee-foton laserscanningmicroscoop, fluorescentiefiltersets en een LCD-visuele stimulator.
- Noodzaakt tot cross-team standaardisatie van de dierpreparatie, de toediening van stimuli en de pipelines voor beeldanalyse.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het toepassen van de methode op verschillende hersengebieden, ziektemodellen of stimuleringsparadigma's.
- Beperkt door de technische complexiteit van het in stand houden van de preparatie van wakker dier en het minimaliseren van bewegingsartefacten tijdens beeldvorming.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Imaging neurale activiteit in de primaire somatosensorische Cortex met behulp van Thy1-GCaMP6s transgene muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
In Vivo Twee-foton beeldvorming van corticale neuronen in neonatale muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Implantatie van een schedelvenster voor herhaalde in vivo beeldvorming bij wakkere muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
In Vivo Two-Photon Imaging of Microglial Dynamics in the Mouse Hippocampus
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Flat-gevloerd Air-opgeheven Platform: Een nieuwe methode voor het combineren Gedrag met Microscopie of Electrofysiologie op Awake vrij bewegende Knaagdieren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Simultane twee-foton
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Nauwkeurige brain mapping om repetitieve in vivo beeldvorming van neuro-immuundynamica in muizen uit te voeren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Craniotomie procedure voor het visualiseren van neuronale activiteiten in Hippocampus van zich gedragende muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
In Vivo Chronische twee-foton beeldvorming van microglia in de hippocampus van de muis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026