Embedding Drosophila Brain in a Matrix for Time-Lapse Imaging of the Circadian Clock Neurons
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 3:08 min • May 29th, 2025
Begin with a Petri dish lid containing the Drosophila larval brain, pre-exposed to a light/dark cycle. The slice contains fluorescent protein-expressing clock neurons.
Add a nutrient-rich medium with antibiotics to support neuronal survival and a warm fibrinogen solution.
Gently mix the solution to distribute fibrinogen evenly.
Place a small amount of this mixture onto the coverslip of a glass-bottom dish.
Add thrombin to react with fibrinogen to induce the formation of a three-dimensional fibrin matrix.
Transfer the brain onto this matrix, positioning it anterior-side down to align clock neurons for imaging.
Fold the matrix over the brain to anchor it and prevent movement.
Add nutrient-rich medium to inactivate thrombin activity.
Seal the dish with a gas-permeable membrane to maintain hydration and neuronal viability.
Perform time-lapse fluorescence imaging at specific intervals.
The fluorescence changes in clock neurons reveal their rhythmic activation and inhibition, synchronized with the light/dark cycle, reflecting circadian rhythms, the daily activity cycle.
After transferring the brain into working solution, dispense the brain and medium onto the lid of a sterile petri dish. Then add another 3.5 microliters of SAM with antibiotics, and add 3.5 microliters of warm SAM with fibrinogen.
It is important to maintain the SAM medium with fibrinogen at 37 degrees throughout this procedure.
Next, mix the solution around the brain by gently pipetting with the same pipette tip and aspirate 2 microliters of the solution to deposit on a coverslip for a glass bottomed dish. Then, add 0.8 microliters of thrombin to the droplet and mix very quickly to initialize the polymerization, which will appear white. Then, use forceps to gently pick the brain and set it onto the polymerizing fibrin matrix.
Adding the thrombin after the brain was transferred to the droplet. It's not recommended as it complicates a lot the procedure.
Orient the brain as needed and very gently push the brain as close to the coverslip as possible. Then pick a layer of polymerized fibrin and fold it on top of the brain, using small and gentle movements that do not detach the matrix. Continue to fold layers of polymerized fibrin over the brain from different parts of the clot to stabilize the brain. Then deposit 20 microliters of SAM with antibiotics over the embedded brain to halt the thrombin activity. Then lay a piece of PTFE membrane over the medium and stick the edges of the membrane to the greased parts of the dish.
Overzicht
Deze studie beschrijft een methode voor het in beeld brengen van klokneuronen in het brein van Drosophila-larven met behulp van een driedimensionale fibrine-matrix. De techniek maakt het mogelijk om ritmische neuronale activiteit als reactie op licht-/donkercycli waar te nemen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Drosophila melanogaster is een modelorganisme voor het bestuderen van circadiane ritmes.
- Clock-neuronen spelen een cruciale rol bij de regulering van dagelijkse activiteitscycli.
- Fluorescerende eiwitten maken visualisatie van neuronale activiteit mogelijk.
- Fibrinematrices bieden een ondersteunende omgeving voor neuronale overleving.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het inkapselen en afbeelden van neuronen in de hersenen van Drosophila.
- Het observeren van de ritmische activatie van klokneuronen.
- Het onderzoeken van de synchronisatie van neuronale activiteit met licht-/donkercycli.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een fibrine-matrix met behulp van trombine en fibrinogeen.
- Inbedding van het brein van Drosophila-larven in de fibrine-matrix.
- Time-lapse fluorescentie-beeldvorming om neuronale activiteit te monitoren.
- Gebruik van een gasdoorlatend membraan om de hydratatie te behouden.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle inbedding van klokneuronen in een fibrinematrix.
- Observatie van ritmische fluorescentieveranderingen als reactie op licht-/donkercycli.
- Aantoonbare levensvatbaarheid van neuronen tijdens beeldvorming.
- Inzichten in de circadiane ritmes van klokneuronen van Drosophila.
Conclusies
- De fibrinematrixmethode is effectief voor het in beeld brengen van neuronale activiteit.
- Deze benadering kan het begrip van circadiane ritmes bij Drosophila verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen de implicaties van deze bevindingen in bredere contexten onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Deze methode maakt directe visualisatie van circadiane-gereguleerde neuronale activiteit mogelijk in een genetisch hanteerbaar model, wat doelwitvalidatie in de neurofarmacologie ondersteunt. Door hersenweefsel te stabiliseren in een permissieve 3D-matrix, maakt het longitudinale beeldvorming van de dynamiek van klokneuronen onder gecontroleerde omgevingsprikkels mogelijk. De aanpak biedt een reproduceerbaar platform voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op circadiane paden in een vroeg stadium van het ontdekkingsproces.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen met betrekking tot de modulatie van circadiane paden in intacte neurale circuits te onderzoeken.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele target-validatie door genetische of farmacologische perturbaties te koppelen aan neuronale ritmiciteit in realtime.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door de levensvatbaarheid van neuronen en de functie van fluorescente reporters te behouden.
- Operationele waarde: Standaardiseert de monstervoorbereiding om de reproduceerbaarheid van fluorescentiegebaseerde metingen over verschillende experimenten te verbeteren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij ziekterelevante systemen door circadiane dysfunctie te modelleren, een mechanistische factor bij slaap- en metabole stoornissen.
- Operationele waarde: Faciliteert continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door consistente, voor beeldvorming geschikte weefselpreparatie.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen vroege discovery-workflows waarbij de mechanistische risicoreductie van circadiane targets prioriteit heeft boven de identificatie van lead-verbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door directe observatie mogelijk te maken van de respons van klokneuronen op licht/donker-signalen.
- Screening: Verbetert de assay-gereedheid door gestandaardiseerde inbedding die weefselverschuiving minimaliseert en de signaalintegriteit behoudt tijdens time-lapse imaging.
- Analytics: Genereert kwantitatieve fluorescentiemetingen over tijd, waardoor statistische vergelijking van neuronale activatie-toestanden tussen verschillende condities mogelijk wordt.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door het modelleren van een geconserveerd biologisch proces dat relevant is voor menselijke circadiane stoornissen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor circadiane neurobiologie dat gedeeld kan worden tussen discovery- en preklinische teams.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelwitmodulatie door ambiguïteit in de dynamiek van de neuronale respons te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid van neuronale imagingprotocollen tussen laboratoria.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door vroegtijdig functionele gegevens te leveren over de betrokkenheid van circadiane routes.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van hun effecten op ritmen van kernklokneuronen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de neuroanatomie van Drosophila en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van toegang tot temperatuurgecontroleerde apparatuur voor fibrinepolymerisatie bij 37°C.
- Vereist standaardisatie van de ratio's thrombine/fibrinogeen om consistente matrixeigenschappen te garanderen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van de methode op andere modelsystemen of neuronale subtypen.
- Omvat praktische beperkingen, zoals de opaciteit van de matrix die mogelijk de resolutie van deep-tissue imaging beïnvloedt.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Live-Imaging van
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Circadiane Entrainment van Drosophila Melanogaster
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Toepassingen van immobilisatie van Drosophila-weefsels met fibrinestolsels voor live beeldvorming
Gerelateerde video's
0 Bekeken
In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Eencellige resolutie fluorescentie leven beeldvorming van Drosophila circadiane klokken in larvale hersenen cultuur
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Ex Vivo Calcium Imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in Drosophila
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Time-lapse Live beeldvorming en kwantificering van snelle dendritische tak dynamiek bij de ontwikkeling van Drosophila neuronen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
In vivo optische calcium beeldvorming van leren-geïnduceerde synaptische plasticiteit in Drosophila melanogaster
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Volwassen Drosophila melanogaster voorbereiden op whole brain imaging tijdens gedrags- en stimulireacties
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Live-Cell Imaging van Drosophila melanogaster Derde Instar Larvale Hersenen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026