Invriezen van embryo's door Mouse Ethyleen Glycol-Based Vitrificatie
18 november 2011
Een ethyleen-glycol-gebaseerde methode voor verglazing muis embryo's wordt beschreven. Is het voordelig om andere methoden in zijn eenvoud en lage embryonale toxiciteit, en kan dus worden breed toepasbaar voor vele stammen van muizen, met inbegrip van inteelt en gen-gemodificeerde muizen.
Het algemene doel van deze procedure is om muis-embryo's te cryopreserveren in vloeibare stikstof en ze te ontdooien voor het herstel van levende muizen. Dit wordt bereikt door eerst muis-embryo's in evenwichtsmedium te dompelen, ze over te brengen naar verglazingsmedium in een cryobuis en vervolgens ze in een vloeibare stikstoftank te plaatsen. Later kunnen embryo's worden ontdooid in een hoog osmotisch medium en in kweekmedium worden geïncubeerd totdat ze worden overgebracht naar ontvangende vrouwtjes.
Uiteindelijk laten de resultaten zien dat meer dan 90% van de embryo's overleven na verglazing en ontdooien, en geboortecijfers tussen de 30 tot 70% na embryotransfer. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het permeabele cryoprotectant glycol minder toxisch is voor embryo's dan conventioneel cryoprotectant. De procedure zal worden gedemonstreerd door een technicus uit mijn laboratorium voordat dit protocol begint.
Bereid twee cel-muis-embryo's in kweek verkregen door natuurlijke paring of conventionele IVF-technieken in een cryobuis voor eventuele opslag, voeg 50 microliter embryovriesoplossing EF S 40 toe. Bereid vervolgens een 35 millimeter of 60 millimeter plastic petrischaal voor met 50 microliter kamertemperatuur EFS 20.
Gebruik een glas capillair om maximaal 30 embryo's naar de schotel over te brengen. Zorg ervoor dat u het kweekmedium niet overbrengt. Om ook de uitdroging van de embryo's te verzekeren, plaats ze in de bodem van de druppel.
Na ongeveer 60 tot 90 seconden, gebruik een capillaire buis om gedehydrateerde embryo's op te zuigen. Met een gekrompen morfologie. Verplaats deze embryo's naar EFS-oplossing in de cryobuis, waarbij zo weinig mogelijk EFS 20 wordt overgebracht.
Zodra de embryo's zijn overgebracht, laat ze een minuut in de EFS 40 bezinken voordat u ze in vloeibare stikstof invriest. Plaats voor het ontdooien van de embryo's in een kweekschotel minstens twee druppels van 10 microliter embryokweekmedium met hoge osmolariteit, zoals M 16-medium. Bedek de druppels vervolgens volledig met siliconen of minerale olie en plaats de schotel in een kooldioxide-incubator tot gebruik.
Verwarm vervolgens de TS one-oplossing tot 37 graden Celsius terwijl u een mondmasker en cryohandschoenen draagt. Haal de embryo's uit de vloeibare stikstoftank. Open nu snel de cryobuis en gooi alle vloeibare stikstof in de tank of een ander geschikt container.
Wacht vervolgens 30 seconden. Voeg nu 850 microliter warme TS one-oplossing toe aan de cryobuis. Zuig de oplossing voorzichtig op en spuug hem ongeveer 10 keer uit, zodat deze gelijkmatig is opgelost.
Breng vervolgens het hele volume over naar een plastic 60 millimeter petrischaal. Of kijkglas wacht drie minuten tot de embryo's zijn geëgaliseerd naar kamertemperatuur waar ze voor de rest van de procedure moeten blijven. Gebruik geen opwarmingsapparaat.
Bekijk snel de embryo's in de schotel onder een stereomicroscoop om te zien hoe ze er aan het begin van deze incubatie uitzien. Na ongeveer twee minuten incubatie, zinken de embryo's door de schotel voorzichtig te schudden tot het medium zich over het oppervlak van de schotel verspreidt. In de laatste minuut van de incubatie, spuug drie afzonderlijke druppels van 50 microliter TS twee-oplossing uit in een schotel.
Wanneer de drie minuten voorbij zijn, gebruik een stereomicroscoop om te bevestigen dat de embryo's enigszins zijn gekrompen. Als de embryo's nog steeds gezwollen zijn, verleng de incubatie nog een tot drie minuten. Neem nu de embryo's met een glas capillair op en breng ze over naar de eerste druppel TS twee.
Wacht drie minuten en breng embryo's over naar de tweede druppel. Gevolgd door de derde druppel. Haal tenslotte de bereide embryo-mediumschotel op die in de incubator is opgeslagen en gebruik een glas capillair om de embryo's over te brengen naar de eerste druppel van het medium.
Als ze onder een stereoscoop worden onderzocht, zouden de embryo's langzaam hun normale morfologie moeten herstellen. Plaats de schotel nu terug in de incubator voor ongeveer 10 minuten. Vervolgens om de sucrose weg te spoelen die is overgedragen van TS twee.
Verplaats de embryo's naar de volgende druppel kweekmedium. Blijf de embryo's kweken in de CO2-incubator totdat ze worden overgebracht naar de uc van ontvangende vrouwtjes. Na het verglazen en herstel van tussen de 300 en 480 embryo's van drie verschillende muizenstammen, was de overlevingskans erg hoog.
Na het ontdooien, was het percentage embryo's dat een normale morfologie vertoonde tussen 93 en 99% en van die embryo's ontwikkelde minstens 84% zich tot blastocysten. Vergeet niet dat het werken met lekkende stikstof extreem gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen om direct contact te vermijden en minimale blootstelling op korte afstand aan lekken te minimaliseren. Stikstof moet altijd worden gebruikt bij het uitvoeren van deze procedure.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een op ethyleenglycol gebaseerde vitrificatiemethode voor de cryopreservatie van muisembryo's. Deze techniek is voordelig vanwege de eenvoud en de lage embryonale toxiciteit, waardoor deze geschikt is voor diverse muizenstammen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Reproductieve biologie
- Embryologie
Achtergrond
- Vitrificatie is een methode die wordt gebruikt om biologische monsters bij lage temperaturen te bewaren.
- Conventionele cryoprotectanten kunnen toxisch zijn voor embryo's.
- Ethyleenglycol is een minder toxisch alternatief voor het bewaren van embryo's.
- Deze methode kan worden toegepast op inteelt- en gen-gemodificeerde muizen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een eenvoudige en effectieve methode voor de cryopreservatie van muisembryo's.
- Het evalueren van de overlevings- en geboortecijfers van embryo's na vitrificatie en ontdooiing.
- Het leveren van een protocol dat op grote schaal in laboratoria kan worden toegepast.
Gebruikte methoden
- Embryo's worden ondergedompeld in equilibratie- en vitrificatiemedia.
- Embryo's worden bewaard in vloeibare stikstof voor cryopreservatie.
- Bij het ontdooien worden de embryo's overgebracht naar een medium met een hoge osmolaliteit.
- Embryo's worden gekweekt tot ze klaar zijn voor overdracht naar recipiënte vrouwtjes.
Belangrijkste resultaten
- Er werden overlevingspercentages van meer dan 90% waargenomen na het ontdooien.
- De geboortecijfers varieerden van 30% tot 70% na embryo-transfer.
- Embryo's vertoonden een normaal herstel van de morfologie na het ontdooien.
- Er werden hoge percentages van ontwikkeling tot blastocysten geregistreerd.
Conclusies
- De methode op basis van ethyleenglycol is effectief voor de cryopreservering van muizenembryo's.
- Deze techniek minimaliseert de embryonale toxiciteit in vergelijking met traditionele methoden.
- Het is een levensvatbare optie voor diverse muizenstammen in het onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Robuuste cryopreservatie van genetisch diverse muizembryo's vormt de basis voor de continuïteit van translationeel onderzoek en de flexibiliteit van biofarma-pipelines. Vitrificatie op basis van ethyleenglycol maakt een hoge overleving van embryo's en een brede toepasbaarheid voor verschillende stammen mogelijk, wat schaalbaar koloniebeheer en het behoud van genetische bronnen ondersteunt. Deze methode vermindert het biologische risico en de operationele barrières voor toegang tot preklinische modellen binnen discovery- en ontwikkelingsprogramma's.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt veilige archivering en snelle terugwinning van genetisch gemodificeerde muismodellen mogelijk voor hypothesegestuurde studies.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door consistente toegang tot gevalideerde in vivo systemen te waarborgen.
- Faciliteert portfolio-triage door een gereed voorraad aan diverse genetische achtergronden te behouden voor mechanistische risicoreductie.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde embryo's met een hoge levensvatbaarheid voor daaropvolgende fenotypische screening en assay-ontwikkeling.
- Waarborgt reproduceerbaarheid en schaalbaarheid bij het genereren van preklinische cohorten uit cryopreservatievoorraden.
- Vermindert variabiliteit in biologische inputs, wat bijdraagt aan betrouwbare workflows voor de evaluatie van verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Handhaaft ziekterelevante genetische modellen voor longitudinale en cross-studie vergelijkbaarheid.
- Maakt continuïteit mogelijk van vroege ontdekking tot preklinische validatie door het veiligstellen van kritieke stammen.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang door de beschikbaarheid van modellen voor bevestigende studies te garanderen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit vitrificatieprotocol integreert op het snijvlak van modelgeneratie, koloniebeheer en de start van preklinische studies, waardoor een naadloze overgang van genetische manipulatie naar in vivo validatie mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Bewaart gevalideerde genetische modellen voor iteratieve hypothesetoetsing en pathway-analyse.
- Screening: Levert embryo's van hoge kwaliteit voor reproduceerbare assay-ontwikkeling en screeningcampagnes.
- Analytics: Biedt kwantitatieve readouts voor overleving en ontwikkeling om de prestaties van cryopreservatie te benchmarken.
- Translationeel Onderzoek: Waarborgt modelcontinuïteit voor biomarker-afstemming en translationele studies.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbare, gestandaardiseerde cryopreservatiecapaciteit over R&D-programma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanische ambiguïteit door de getrouwheid van het model te behouden.
- Operationele waarde: Stroomlijnt het beheer van kolonies met schaalbare, reproduceerbare cryopreservatie en herstel.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door de beschikbaarheid van modellen te waarborgen.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de snelle voortgang van gevalideerde targets.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist technische expertise in de hantering van embryo's en cryopreservatieprotocollen.
- Toegang tot vloeibare stikstofopslag en infrastructuur voor gecontroleerd ontdooien is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor een consistente recovery en downstream gebruik.
- Aanpasbaar aan een breed scala aan muizenstammen, met protocoloptimalisatie indien nodig.
- Veiligheidsmaatregelen zijn essentieel bij het hanteren van cryogene materialen.
