Name: Invriezen van embryos door Mouse Ethyleen Glycol-Based Vitrificatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Leer een eenvoudige ethyleenglycol-gebaseerde vitrificatiemethode voor het cryopreserveren van muizenembryo's met minimale toxiciteit. Dit protocol realiseert overlevingspercentages boven 90% na ontdooien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd uitgevoerd in samenwerking met het Nationaal Bioresource Project, het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie, Japan.

De algemene opzet van het experiment is te zien in Fig. 1. 1. Bereiding van het reagens <ol><li> Maak de basis medium (hier in gekend als PB1) in een 100 ml glazen fles volgens de volgende tabel hieronder: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> mM </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,4 </td><td> 136,98 </td><td> 800,0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,6 </td><td> 2,68 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136,1 </td><td> 1,47 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 0.12 H 2 O </td><td> 358,14 </td><td> 8,04 </td><td> 288,1 </td></tr><tr><td> MgCl 2, 6H 2 O </td><td> 203,3 </td><td> 0,49 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td glucose></td><td> 180,2 </td><td> 5,56 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> Na pyruvaat </td><td> 110 </td><td> 0,33 </td><td> 3.6 </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0.9 </td><td> 13,2 </td></tr><tr><td> Penicilline G </td><td></td><td></td><td> 6,0 (ongeveer) </td></tr></tbody></table></li><li> Maak de Ficoll-sucrose (FS) oplossing: <ol><li> Voeg de volgende chemicaliën tot 14 ml van de PB1 oplossing in een 50 ml buis. <table border="1"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> 3,424 g </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42,0 mg </td></tr></tbody></table></li><li> Mix Ficoll 70 en sucrose in PB1-oplossing en schud goed totdat volledig is opgelost. </li><li> Na controle volledig oplossen hierboven, tel BSA op het oppervlak van de oplossing en bewaar deze op4 oC tot de BSA volledig is opgelost (&gt; 4 uur of een nacht). </li></ol></li><li> Maak de equilibratie oplossing (EFS20) en de verglazing oplossing (EFS40) in een 50 ml buis: <ul><li> EFS20: 20% (v / v) ethyleenglycol, 24% (w / v) Ficoll, en 0,4 mol / L sucrose in PB1 met BSA </li><li> EFS40: 40% (v / v) ethyleenglycol, 18% (w / v) Ficoll, en 0,3 mol / L * sucrose in PB1 met BSA * Voor embryo's uit de BALB / c of ICR-stam, verhogen de concentratie van sucrose tot 0,9 mol / L sucrose, omdat ze zijn gevoeliger voor 6 cryodamage. </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 oplossing </td><td> EFS40 oplossing </td></tr><tr><td> Ethyleen glycol </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> FS-oplossing </td><td> 4 ml </td><td> 3 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Steriliseer de oplossing door filtratie met behulp van een 0,45 pm filter. Maak aliquots in 5 ml polystyreen buizen en bewaren bij 4 ° C. Ze kunnen worden gebruikt voor ongeveer 6 maanden. </li><li> Voorbereiding van de embryo ontdooien oplossing met 0,75 M sucrose (TS1) <ol><li> Los 7,7 g sucrose in PB1 (opgesteld in stap 1.1) en breng het totale volume tot 30 ml. Meng door zachtjes te schudden totdat sucrose volledig is opgelost. </li><li> Voeg 90 mg van BSA op het oppervlak van de oplossing en laat het staan ​​totdat volledig is opgelost. </li><li> Steriliseer de oplossing door filtratie. </li><li> Aliquot en bewaar bij 4 ° C. Ze kunnen gebruikt worden voor ongeveer 1 maand. </li></ol> Opmerking: TS1 kan ook worden bereid uit commercieel beschikbare M2. <ol start="6"><li> Los 7,7 g sucrose in M2 en brengen het totale volume tot 30 ml. </li><li> Meng door zachtjes te schudden totdat sucrose volledig is opgelost. </li><li> Steriliseer de oplossing door filtratie. </li><li> Aliquot en bewaar bij 4 oC. Ze kunnen gebruikt worden voor ongeveer 1 maand. </li></ol></li><li> TS2 (ontdooien oplossingmet 0,25 M sucrose): <ol><li> Verdun 10 ml TS1 met 20 ml volume van PB1 of M2, naargelang het geval. </li><li> Aliquot en bewaar bij 4 ° C. Ze kunnen gebruikt worden voor ongeveer 1 maand. </li></ol></li></ol> 2. Verglazing van 2-cel Mouse Embryo's <ol><li> Bereid 2-cell muis embryo's door natuurlijke dekking of conventionele in vitro fertilisatie technieken. </li><li> Aliquot 50 ul EFS40 in een cryotube. Hierna, voert u de rest van de verglazing procedure bij de kamertemperatuur. </li><li> Aliquot 50 ul van EFS20 op de bodem van een 35 mm of 60 mm plastic petrischaal. </li><li> Overdracht tot 30 embryo's te EFS20 met behulp van een glazen capillair met alleen het minimumbedrag van het kweekmedium. Start een timer voor 2 minuten. Let op: Plaats embryo's aan de onderkant van de druppel. Dit maakt een efficiënte uitdroging van embryo's. Controleer de morfologie van embryo's door een stereomicroscoop. Gedehydrateerde embryo's laten een gekrompen morfologie, zoals getoond in Fig. 2A.Als ze niet uitgedroogd genoeg zijn, wachten op meer 1 of 2 minuten. </li><li> Op ongeveer 1,5 min, pak de embryo's uit de EFS20 druppel met slechts het minimum van de oplossing. Overbrengen naar EFS40 in de cryotube bereid in stap 2.1. Opmerking: Voor de beste resultaten, de timing van het oppakken van embryo's zodat alle embryo's kunnen worden omgezet in EFS40 rond de 2 minuten. </li><li> Wacht 1 minuut. </li><li> Direct zet de cryotube in vloeibare stikstof (LN 2). </li></ol> 3. Ontdooien Verglaasd 2-cell muizenembryo's <ol><li> Voor ontdooien, bereiden een gerecht met 10 ul druppels embryo cultuur medium voor teruggewonnen embryo's (zie stap 3.13). Bedek de schotel met olie en plaats het in een CO 2 incubator tot gebruik. Opmerking: Hoewel alle media voor routine embryo cultuur kan worden gebruikt in dit experiment, raden we aan media met hogere osmolariteit zoals M16 medium. </li><li> Warm TS1 tot 37 ° C. </li><li> Doe een gezichtsmasker en cryogloves. Open de LN 2 tAnk en ophalen een cryotube met embryo's. </li><li> Snel te openen de bovenkant van de buis en gooi LN 2. Wacht 30 seconden om te voorkomen dat TS1 tegen bevriezen de volgende stap. </li><li> Gebruik een 1000ul pipet tot 850 ul van TS1 (37 ° C) toe te voegen in de buis en de oplossing te mengen door voorzichtig pipettings (ongeveer tien keer in 25 seconden) tot de oplossing gelijkmatig opgelost. </li><li> Overdracht van het gehele volume van de buis om een plastic 60 mm petrischaal (of een horloge glas) (Fig. 3A). Let op: Embryo's moeten worden behandeld bij kamertemperatuur (22-25 ° C) tot ze worden geplaatst in een CO 2 incubator bij stap 3.14. </li><li> Start een timer voor 3 minuten. </li><li> Op ongeveer 2 min in TS1, schud de schotel tot de medium met embryo's is verdeeld over het oppervlak van de schotel (Fig. 3B). Opmerking: Dit zal helpen de embryo's naar beneden naar de bodem, omdat ze drijven aan de oppervlakte toen overgebracht naar TS1. </li><li> Zet drie 50 ul druppels TS2 op ee schaal (fig. 3C). </li><li> Na 3 minuten in TS1, controleer dan de morfologie van embryo's door een stereomicroscoop, ze moeten licht gekrompen. Zie de morfologie van embryo's in eerdere (Fig. 2B) en later (fig. 2C) in TS1. Opmerking: Als de embryo's zijn nog steeds gezwollen, bewaar ze in TS1 voor meer 1 tot 3 minuten. </li><li> Pak de embryo's en overbrengen naar de eerste druppel van de TS2 (fig. 3D). Start een timer voor 3 min </li><li> Na 3 minuten, transfer embryo's naar de tweede te laten vallen en dan naar de derde vervolgkeuzelijst (Fig. 3E). </li><li> Overdracht van de embryo's aan het kweekmedium bereid bij stap 3.1. De embryo's worden in de vorm getoond in Fig. 2D. </li><li> Plaats schotel in een CO 2 incubator. Ongeveer 10 min later, transfer embryo's naar de volgende druppel kweekmedium uit te spoelen sucrose die zijn overgedragen van TS2. </li><li> Ga verder cultuur in een CO2-incubator tot embryo transfer. Let op: Transfer Embryos van de eileiders van de ontvanger vrouwen op de dag van ontdooien. Lang cultuur in vitro kan verminderen de levensvatbaarheid van embryo's in sommige stammen van muizen. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: In vitro - en in vivo-ontwikkeling van embryo's na ontdooien wordt gepresenteerd in de tabellen 1 en 2. De voordelen van dit protocol zijn de hoge overlevingskansen van embryo's na ontdooien en zijn brede toepasbaarheid op verschillende stammen van muizen. <table border="1"><tbody><tr><td> Spanning </td><td> Totaal aantal buizen </td><td> Aantal verglaasde embryo's </td><td> Voor het terugwinnen (Aantal (%)) </td><td> Morfologisch normaal (Aantal (%)) </td><td> Ontwikkeling tot blastocysten (Aantal (%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / cA </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> Tabel 1. In vitro-ontwikkeling van verglaasd-ontdooide embryo's met elkaar gemeen muizenstammen <table border="1"><tbody><tr><td> Toestand van embryo's </td><td> Nee van de ontvanger vrouwen </td><td> Aantal embryo's </td><td> Implantatie sites (Aantal (%)) </td><td> Levende nakomelingen (Aantal (%)) </td></tr><tr><td> Fris </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> Verglaasd </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> Tabel 2. In vivo-ontwikkeling van verglaasd-ontdooide embryo's in C57BL/6J muizen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. De algemene regeling van het experiment met inbegrip van verevening, verglazing en ontdooien van embryo's. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. De morfologie van embryo's bij elke stap van het ontdooien. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Ontdooien van embryo's. Alle procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. (A), voeg 850 ul van TS1 (37 ° C) in een cryotube en overdracht van de gehele volume van de oplossing in de cryotube op een plastic schaaltje. Op dit moment kijken de embryo's gezwollen zoals getoond in Fig. 2B. (B), Verdeel de oplossing over het oppervlak van de schotel door zachtjes te schudden. (C), Place drie 50 pl druppels TS2 op de plastic schotel. (D), transfer de embryo's om de eerste daling van de TS2. Na 3 min, de embryo's kijk shurunken zoals getoond in Fig. 2C. (E), over te dragen seriëlely in de rest van TS2 daalt en vervolgens aan het kweekmedium.

<ol><li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196%C2%B0+and+-269%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li>
<li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196%C2%B0C+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li>
<li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li>
<li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mamm.+Ova.+Res%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li>
<li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution%2C+without+appreciable+loss+of+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fert%22%5BJournal%5D)">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li>
<li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li>
<li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li>
<li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li>
<li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li>
<li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Sinds het eerste verslag van de muis embryo verglazing van Rall en Fahy in 1985 twee, hebben een aantal technische verbeteringen aangebracht in de overlevingskansen van de embryo&#39;s te verhogen na het ontdooien. Een van de meest succesvolle wijzigingen werd bereikt door het gebruik van ethyleen glycol als een cryoprotectant vanwege de lage toxiciteit en een hoge membraan-permeabiliteit. Dergelijke voordelen kunnen wij invriezen van embryo&#39;s verwerken bij kamertemperatuur 4; andere verglazing methoden vereisen embryo inleveren bij lagere temperaturen en zijn niet altijd van toepassing zijn op bepaalde stammen van muizen waaronder BALB / c 6. De eerste ethyleen glycol-based verglazing is ontwikkeld door Kasai et al.. in 1990 5,7. Omdat de oorspronkelijke methode werd geoptimaliseerd voor plastic rietjes als containers, hebben we enigszins aangepast protocol voor de cryotubes, die beter toegankelijk in laboratoria en beter bestand tegen fysieke schade. Daarom kan de verglazing hier beschreven methode wordt applicable te veel laboratoria met behulp van muizen als onderzoeksmodellen. Dezelfde methode kan ook gebruikt worden voor de muis embryo&#39;s in de morula en blastocyst fase 8 en rat embryo&#39;s 9. We hebben echter recent gevonden dat de kwaliteit van cryotubes kan de overleving van embryo&#39;s van invloed zijn na invriezen en ontdooien. Zo is het essentieel om de binnenkant van de cryotubes te onderzoeken voor zijn zachtheid voor vitrifying embryo&#39;s (bijvoorbeeld, zie bij Tabel van specifieke reagentia en apparatuur). Verglazing methoden hebben vele voordelen ten opzichte van conventionele langzaam invriezen methoden, maar ze hebben van nature een nadeel met betrekking tot het transport doel. Als verglaasde embryo&#39;s moet worden gehouden bij onder de -120 ° C om hun levensvatbaarheid te behouden, zijn droog verladers over het algemeen gebruikt voor hun veilig transport. Droge verladers zijn zwaar en omvangrijk, en hun round-trip is duur, vooral voor internationaal vervoer. We zijn nu ontwikkelt momenteel een nieuwe vitrificatie methodedie verglaasde embryo&#39;s kunnen worden opgeslagen bij droog-ijs temperatuur (ongeveer -80 ° C) gedurende ten minste zeven dagen 10. Deze methode moet de verglazing van de volgende generatie te worden.

<table border="1"><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> Bovine serum albumine </td><td> Merck Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td> Ethyleen glycol </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 · 12H 2 </sub&gt; O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H2O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-4687 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumpyruvaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-8574 </td><td></td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16 medium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> M2 medium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> Cryotube </td><td> Sumitomo Bakeliet </td><td> MS-4501 </td><td> &quot;Cryogene Vial&quot; </td></tr></table>

invriezen van embryo&#39;s door mouse ethyleen glycol-based vitrificatie

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservatie van de muis embryo&#39;s is een technologische basis die biomedische wetenschappen ondersteunt, omdat veel stammen van muizen zijn geproduceerd door genetische modificaties en het nummer wordt consequent steeds van jaar tot jaar. De technische ontwikkeling ervan begon met langzame bevriezing methoden in de jaren 1970 een, gevolgd door verglazing methoden ontwikkeld in de late jaren 1980 2. Over het algemeen, de laatste techniek heeft als voordeel zijn snelheid, eenvoud en hoge overlevingskansen van teruggewonnen embryo&#39;s. Echter, bevatte de cryoprotectants zijn zeer giftig en kunnen vervolgens embryo-ontwikkeling beïnvloeden. Daarom is de techniek niet van toepassing op bepaalde stammen van muizen, zelfs wanneer de oplossingen afgekoeld tot 4 ° C om de toxische effect tijdens de embryonale behandeling te beperken. Op de RIKEN Bioresource Center, zijn meer dan 5000 muizenstammen met verschillende genetische achtergronden en fenotypes onderhouden 3, en daarom hebben we een geoptimaliseerd vitrificatie technique waarmee we kunnen cryopreserve embryo&#39;s uit vele verschillende stammen van muizen, met de voordelen van een hoge overleving van embryo&#39;s na vitrifying en ontdooien (of vloeibaar, meer precies) bij de omgevingstemperatuur 4. Hier presenteren we een verglazing methode voor het muis embryo&#39;s die met succes is toegepast in ons centrum. De cryopreservatie oplossing bevat ethyleenglycol in plaats van DMSO om de toxiciteit te minimaliseren om embryo&#39;s 5. Het bevat ook Ficoll en sucrose voor de preventie van devitrification en osmotische aanpassing, respectievelijk. Embryo&#39;s kunnen worden behandeld bij kamertemperatuur en overgebracht naar vloeibare stikstof binnen 5 minuten. Omdat de oorspronkelijke methode werd geoptimaliseerd voor plastic rietjes als containers, hebben we enigszins aangepast protocol voor de cryotubes, die beter toegankelijk in laboratoria en beter bestand tegen fysieke schade. We beschrijven ook de procedure van het ontdooien verglaasde embryo&#39;s tot in detail want het is een essentieel step voor een efficiënt herstel van levende muizen. Deze methoden zouden nuttig zijn om onderzoekers en technici die het behoud van muizenstammen voor later gebruik nodig hebt in een veilige en kosteneffectieve manier.

Een ethyleen-glycol-gebaseerde methode voor verglazing muis embryo&#39;s wordt beschreven. Is het voordelig om andere methoden in zijn eenvoud en lage embryonale toxiciteit, en kan dus worden breed toepasbaar voor vele stammen van muizen, met inbegrip van inteelt en gen-gemodificeerde muizen.

Invriezen van embryo&#39;s door Mouse Ethyleen Glycol-Based Vitrificatie

Cryopreservatie van muizenembryo's is een technologische basis die de biomedische wetenschappen ondersteunt, aangezien veel muizenstammen zijn voortgebracht via genetische...

Het algemene doel van deze procedure is om muizenembryo's te cryopreserveren in vloeibare stikstof en ze vervolgens te ontdooien voor de winning van levende muizen. Dit wordt bereikt door de muizenembryo's eerst onder te dompelen in een equilibratie-medium, ze over te brengen naar vitrificatiemedium in een cryobuis en ze daarna in een tank met vloeibare stikstof te plaatsen. Later kunnen de embryo's worden ontdooid in een medium met een hoge osmolariteit en worden geïncubeerd in kweekmedium totdat ze worden overgebracht naar ontvangende vrouwtjes.Uiteindelijk tonen de resultaten een overleving van meer dan 90% van de embryo's na het ontdooien van de vitrificatie, en geboortecijfers tussen 30 en 70% na embryo-transfer. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het permeabele cryoprotectum glycol minder toxisch is voor embryo's dan conventionele cryoprotectanten. Voorafgaand aan de start van dit protocol zal een technicus uit mijn laboratorium de procedure demonstreren.Bereid twee-celstage muizenembryo's in cultuur, verkregen via natuurlijke paring of conventionele IVF-technieken, voor in een cryobuis voor uiteindelijke opslag door 50 µL embryo-vriesoplossing EF S 40 toe te voegen. Bereid vervolgens een plastic Petrischaal van 35 millimeter of 60 millimeter voor met 50 µL EFS 20 op kamertemperatuur.Gebruik een glazen capillair om maximaal 30 embryo's naar de schaal over te brengen. Let erop dat er geen kweekmedium wordt overgebracht. Om uitdroging van de embryo's te voorkomen, plaatst u deze op de bodem van de druppel.Zuig na ongeveer 60 tot 90 seconden de gedehydrateerde embryo's op met een capillairbuisje. Deze vertonen een gekrompen morfologie. Verplaats deze embryo's naar de EFS-oplossing in de cryobuis, waarbij zo min mogelijk EFS 20 wordt overgebracht.Zodra de embryo's zijn overgebracht, laat u ze één minuut rusten in de EFS 40 voordat u ze invriest in vloeibare stikstof. Plaats vóór het ontdooien van de embryo's minstens twee druppels van 10 µL embryo-kweekmedium met een hoge osmolariteit, zoals M 16-medium, in een kweekschaal. Dek de druppels vervolgens volledig af met siliconenolie of minerale olie en plaats de schaal in een koolstofdioxide-incubator tot aan het gebruik.Warm vervolgens de TS one-oplossing op tot 37 °C terwijl u een mondmasker en cryohandschoenen draagt. Haal de embryo's uit de vloeibare stikstoftank. Open nu snel de cryobuis en giet eventuele vloeibare stikstof terug in de tank of in een geschikte opvangbak.Wacht vervolgens 30 seconden. Voeg nu 850 µL warme TS one-oplossing toe aan de cryobuis. Zuig de oplossing voorzichtig ongeveer 10 keer op en spuit deze weer uit, zodat deze gelijkmatig is opgelost.Breng vervolgens het volledige volume over naar een plastic Petrischaal van 60 millimeter of naar een horlogeglas. Wacht drie minuten zodat de embryo's kunnen acclimatiseren aan de kamertemperatuur, waarbij ze voor de rest van de procedure moeten blijven. Gebruik geen verwarmingsapparaat.Onderzoek de embryo's in de schaal snel onder een stereomicroscoop om hun aspect aan het begin van deze incubatie vast te stellen. Na ongeveer twee minuten incubatie worden de embryo's doen zinken door de schaal voorzichtig te schudden totdat het medium over het oppervlak van de schaal is verspreid. In de laatste minuut van de incubatie worden drie afzonderlijke druppels van 50 µL TS twee-oplossing in een schaal geplaatst.Wanneer de drie minuten voorbij zijn, gebruik dan een stereomicroscoop om te bevestigen dat de embryo's licht zijn gekrompen. Als de embryo's nog steeds gezwollen zijn, zet de incubatie dan voort voor nog één tot drie minuten. Pak de embryo's nu op met een glazen capillair en breng ze over naar de eerste druppel TS twee.Wacht drie minuten en breng de embryo's over naar de tweede druppel. Doe daarna hetzelfde voor de derde druppel. Haal ten slotte de voorbereide schaal met embryo-medium uit de incubator en gebruik een glazen capillair om de embryo's over te brengen naar de eerste druppel van het medium.Indien onder een stereoscoop wordt onderzocht, zouden de embryo's langzaam hun normale morfologie moeten herstellen. Plaats de schaal nu gedurende ongeveer 10 minuten terug in de incubator. Was daarna de sucrose uit die is meegenomen uit TS twee.Verplaats de embryo's naar de volgende druppel kweekmedium. Zet de embryo's verder in de CO2-incubator totdat ze worden overgebracht naar de uc van recipiënte vrouwtjes. Na vitrificatie en het herstellen van tussen de 300 en 480 embryo's van drie verschillende muizenstammen was de overleving zeer hoog.Na het ontdooien lag het percentage embryo's met een normale morfologie tussen 93 en 99%, en van deze embryo's ontwikkelde ten minste 84% zich tot blastocysten. Houd er rekening mee dat werken met vloeibare stikstof uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om direct contact te vermijden en kortstondige blootstelling aan vloeibare stikstof te minimaliseren. Deze procedure dient altijd met de nodige voorzichtigheid te worden uitgevoerd.

cryopreservation-mouse-embryos-ethylene-glycol-based

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video-artikel stellen we een stap-voor-stap demonstratie over hoe het verzamelen en hamster eicellen cryopreserve met een hoge post-dooi overleving. Dezelfde procedure kan ook worden toegepast om met succes vorst en dooi muis embryo's in verschillende stadia van pre-implantatie ontwikkeling.

Verzamelen en Cryopreservatie van Hamster Eicellen en muis embryo&#39;s

Pre-implantatie embryo's kunnen worden ingevroren na plaatsing in een hypertone cryoprotectief oplossing voor cellulaire uitdroging veroorzaken. Bij evenwicht, is het ijs kristalvorming geïnduceerd in de oplossing rond de embryo. Verdere uitdroging optreedt als het embryo langzaam afgekoeld tot temperaturen onder nul alvorens zich in vloeibare stikstof voor opslag.

Cryopreservatie van embryo&#39;s Preimplantatie van runderen, schapen, en geiten

Hier laten we zien de nieuw ontwikkelde I • Cryo-kit voor de muis sperma cryopreservatie. Twee-cellig stadium embryo ontwikkeling met ingevroren-ontdooid sperma werd steeds verbeterd in 5 muizenstammen met het gebruik van deze kit. Over een periode van 1,5 jaar werden 49 genetisch gemodificeerde muis lijnen gearchiveerd door sperma cryopreservatie met de I • Cryo-kit en later met succes teruggevorderd door IVF.

Muis Sperma Cryopreservatie en herstel met behulp van de I · Cryo Kit

In this video, we describe the procedure for vitrification of harvested rabbit embryos at desired development stage using ethylene glycol and dimethyl sulfoxide as cryoprotectants and cryogenic straw as the carrier system. The vitrified embryos have high survival rate and can be stored for an extended period until use.

Rabbit Embryo Vitrification Using Cryogenic Straw:  An Ultra-Rapid Cooling Technique to Preserve Rabbit Embryos for Long-term Storage

This video demonstrates the procedure for thawing vitrified rabbit embryos and the precautionary measurement steps for optimal embryo recovery.

Rabbit Embryo Thawing: A Warming Procedure to Recover Cryopreserved Rabbit Embryos for Embryo Transfer

Utero-eileiders embryo transfer maakt gebruik van de utero-eileiders splitsing als een belemmering voor het embryo uitstroom die zich kunnen voordoen bij het uitvoeren van de baarmoeder overdracht te voorkomen. Vasectomized mannetjes zijn verplicht om pseudozwanger ontvangers krijgen voor embryotransplantatie. Beide technieken worden besproken.

Utero-eileiders Embryo Transfer en vasectomie in het muismodel

MicroSecure Vitrification werd ontwikkeld als een niet-commercieel, aseptisch gesloten vitrificatieapparaatsysteem dat voldoet aan de FDA-normen voor goede fabricage- en weefselverwerkingspraktijken. Vanwege de terugtrekking van hydrofobe embryo-strohalmen met pluggen uit de industrie, werd de vitrificatieprocedure aangepast om een binnenste afdichting op te nemen vóór de standaard interne katoenen plug.

Gewijzigd MicroSecure Vitrificatie: Een veilige, eenvoudige en zeer effectieve cryopreservatie Procedure for Human Blastocysten

Assisted reproductieve technieken (ARTs) worden voortdurend geëvalueerd om de resultaten te verbeteren en de daaraan verbonden Risico's te verminderen. Dit manuscript beschrijft een minimaal invasieve embryotransfer procedure met een efficiënt cryopreservatie protocol dat het gebruik van konijnen als een ideaal dierlijk model van menselijke voortplanting toelaat.

Minimaal invasieve embryo transfer en embryo verglazing bij de optimale embryo fase in konijnen model

Hier presenteren we een time-lapse Morfometrische protocol te volgen van de intensiteit van de blastocyst krimp en re-expansie tijdens previtrification interventies en na opwarming van de aarde herstel. De toepassing van het protocol is mogelijk in in vitro bevruchting laboratoria die toegerust zijn met time-lapse microscopen en wordt aanbevolen bij de ontwikkeling van een optimale blastocyst verglazing methode.

Morfometrische Protocol voor de objectieve beoordeling van de Blastocyst gedrag tijdens verglazing en opwarming van de aarde stappen

Hier presenteren we een aangepaste methode voor cryopreservatie van eencellige embryo's, evenals een protocol dat het gebruik van gevriesontdooide embryo's en elektroporatie koppelt voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen.

Gebruik van gevriesde embryo's voor hoogrendementproductie van genetisch gemodificeerde muizen

Hier presenteren we het Spatel Montevideo-protocol voor het vitrificeren van pre-implantatie-embryo's bij muizen en schapen, bestaande uit een zelfgemaakte spatel en met behulp van zelfgemaakte oplossingen. Embryo's worden snel in evenwicht gebracht in twee cryoprotectieve oplossingen van toenemende concentratie, op de spatel geladen, ondergedompeld in vloeibare stikstof en ten slotte verzegeld met een rietje van 0,5 ml.

Spatel Montevideo Apparaat voor de verglazing van embryo's van zoogdieren

Leer een eenvoudige ethyleenglycol-gebaseerde vitrificatiemethode voor het cryopreserveren van muizenembryo's met minimale toxiciteit. Dit protocol realiseert overlevingspercentages boven 90% na ontdooien.

Invriezen van embryo's door Mouse Ethyleen Glycol-Based Vitrificatie

Meer video's verkennen