Invriezen van embryo's door Mouse Ethyleen Glycol-Based Vitrificatie

Het algemene doel van deze procedure is om muizembryo's te cryopreserveren in vloeibare stikstof en deze vervolgens te ontdooien voor het verkrijgen van levende muizen. Dit wordt bereikt door muizembryo's eerst onder te dompelen in een equilibratiemedium, ze over te brengen naar een vitrificatiemedium in een cryobuis en ze daarna in een tank met vloeibare stikstof te plaatsen. Later kunnen de embryo's worden ontdooid in een medium met een hoge osmolariteit en worden geïncubeerd in een kweekmedium tot ze in recipientvrouwtjes worden overgebracht.

Uiteindelijk laten de resultaten een overleving van meer dan 90% van de embryo's zien na het ontdooien van de vitrificatie, en geboortecijfers tussen 30 en 70% na embryo-transfer. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het permeabele cryoprotectum glycol minder toxisch is voor embryo's dan conventionele cryoprotectanten. De procedure zal vóór aanvang van dit protocol worden gedemonstreerd door een laborant uit mijn laboratorium.

Bereid twee-cellige muizenembryoen in cultuur, verkregen via natuurlijke paring of conventionele IVF-technieken, voor in een cryobuisje voor uiteindelijke opslag door 50 microliters embryo-vriesoplossing EF S 40 toe te voegen. Bereid vervolgens een plastic Petrischaal van 35 millimeter of 60 millimeter voor met 50 microliters EFS 20 op kamertemperatuur.

Gebruik een glazen capillair om maximaal 30 embryo's naar de schaal over te brengen. Zorg ervoor dat er geen kweekmedium wordt overgedragen. Om uitdroging van de embryo's te voorkomen, moeten ze op de bodem van de druppel worden geplaatst.

Zuig na ongeveer 60 tot 90 seconden de gedehydrateerde embryo's, die een gekrompen morfologie vertonen, op met een capillaire buis. Verplaats deze embryo's naar de EFS-oplossing in de cryobuis, waarbij zo min mogelijk EFS 20 wordt overgebracht.

Nadat de embryo's zijn overgebracht, laat u ze één minuut rusten in de EFS 40 voordat u ze invriest in vloeibare stikstof. Plaats vóór het ontdooien van de embryo's ten minste twee druppels van 10 µL embryo-kweekmedium met hoge osmolariteit, zoals M 16-medium, in een kweekschaal. Bedek de druppels vervolgens volledig met siliconen- of minerale olie en plaats de schaal in een kooldioxide-incubator tot gebruik.

Warm vervolgens de TS one-oplossing op tot 37 graden Celsius terwijl u een mondmasker en cryohandschoenen draagt. Haal de embryo's uit de tank met vloeibare stikstof. Open nu snel de cryobuis en gooi eventuele vloeibare stikstof terug in de tank of in een geschikte container.

Wacht vervolgens 30 seconden. Voeg nu 850 µL warme TS one-oplossing toe aan de cryobuis. Pipetteer de oplossing voorzichtig ongeveer 10 keer op en neer zodat deze gelijkmatig is opgelost.

Breng vervolgens het volledige volume over naar een plastic Petrischaal van 60 millimeter of een horlogeglas. Wacht drie minuten tot de embryo's zijn geëquilibreerd naar kamertemperatuur, waar ze gedurende de rest van de procedure moeten blijven. Gebruik geen verwarmingsapparaat.

Inspecteer de embryo's in de schaal snel onder een stereomicroscoop om vast te stellen hoe ze er aan het begin van deze incubatie uitzien. Laat de embryo's na ongeveer twee minuten incubatie zinken door zachtjes aan de schaal te schudden totdat het medium over het oppervlak van de schaal is verspreid. Voeg in de laatste minuut van de incubatie drie afzonderlijke druppels van 50 µL TS twee-oplossing toe aan een schaal.

Wanneer de drie minuten voorbij zijn, gebruik dan een stereomicroscoop om te bevestigen dat de embryo's licht zijn gekrompen. Als de embryo's nog steeds opgezwollen zijn, zet de incubatie dan nog één tot drie minuten voort. Pak de embryo's nu op met een glazen capillair en breng ze over naar de eerste druppel TS twee.

Wacht drie minuten en breng de embryo's over naar de tweede druppel. Doe vervolgens hetzelfde voor de derde druppel. Haal ten slotte de voorbereide schaal met embryo-medium uit de incubator en gebruik een glazen capillair om de embryo's over te brengen naar de eerste druppel van het medium.

Wanneer ze onder een stereoscoop worden bestudeerd, zouden de embryo's langzaam hun normale morfologie moeten herstellen. Plaats de schaal nu gedurende ongeveer 10 minuten terug in de incubator. Was vervolgens de sucrose uit die is meegevoerd vanuit TS twee.

Verplaats de embryo's naar de volgende druppel kweekmedium. Ga door met het kweken van de embryo's in de CO2-incubator tot ze worden overgebracht naar de uc van recipientvrouwtjes. Na vitrificatie en het herwinnen van tussen de 300 en 480 embryo's van drie verschillende muizenstammen was de overleving zeer hoog.

Na het ontdooien lag het percentage embryo's met een normale morfologie tussen 93 en 99%, en van deze embryo's ontwikkelde ten minste 84% zich tot blastocysten. Houd er rekening mee dat werken met lekkende stikstof uiterst gevaarlijk kan zijn; neem voorzorgsmaatregelen om direct contact te vermijden en kortstondige blootstelling aan lekkende stikstof te minimaliseren. Stikstof moet altijd worden gehanteerd door deze procedure uit te voeren.