Isolatie & Karakterisering van Hoechst Lage CD45 Negatief Muis Lung Mesenchymale stamcellen
October 26th, 2011
In dit artikel tonen we de isolatie van murine inwoner long mesenchymale stamcellen (MSC long), hun expansie, karakterisering en analyse van immunomodulerende eigenschappen.
Deze video demonstreert een protocol voor de isolatie van host lage CD 45 negatieve long mesenchymatische stamcellen. Weefsel resonante mesenchymatische stamcellen of MSC's zijn belangrijke regulatoren van weefselreparatie of regeneratie, fibrose, ontsteking en angiogenese. Eerst worden de longen uit een geofferde muis gedissected.
Het longweefsel wordt verteerd om een enkele cel suspensie te verkrijgen. De cellen worden gekleurd met hoax die en CD 45 en gesorteerd door flow cytometry om host lage CD 45 negatieve long MSC's te verkrijgen. De long MSC's worden dan uitgebreid in cultuur en een kolonie vormende assay wordt uitgevoerd om de MSC differentiatiecapaciteiten te beoordelen.
Verdere studies kunnen dan worden uitgevoerd om de rol van MSC's tijdens weefsel homeostase en ziekte te onderzoeken. De methode die we hier laten zien, kan worden gebruikt om ofwel muis of menselijke long mesenchymatische stamcellen te isoleren en kan worden toegepast op deze studie van longziekten zoals pulmonaire fibrose, pulmonale hypertensie en COPD. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen vanwege de verscheidenheid aan beschikbare methoden voor weefselvoorbereiding, evenals flow cytometer setup geschikte controles en analyse.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat het moeilijk is om de juiste techniek voor het snijden en verteren van het longweefsel voor optimale levensvatbaarheid van cellen alleen met woorden te beschrijven. Ook de flow cytometry instrument setup en analyses worden het beste gecommuniceerd door demonstratie. Begin dit protocol door de longen te verwijderen die zullen worden gebruikt om mesenchymatische stamcellen te verkrijgen uit een geofferde volwassen muis.
Gebruik een klein paar scherpe schaar om de ribbenkast lateraal aan elke kant van de muis door te snijden. Open de borstholte en verwijder dan het diafragma. Plaats een 10 milliliter spuit met een 20 en een halve gauge naald in het rechter hartventrikel en druk voorzichtig op de zuiger om het met drie tot vijf milliliters PBS door te spoelen, waarbij het bloed uit de longen wordt gespoeld.
Vervolgens, met behulp van schaar, snij de luchtpijp en grote bronchus af en gooi ze weg. Vervolgens, met behulp van een pincet. Pak de kleine witte longkwabben en plaats ze in een petrischaal gevuld met Hank's gebufferd zoutoplossing of HBSS.
Verwijder vervolgens het hart en scheid de longkwabben. Herhaal dit proces voor alle muizen in de studie. Breng de longkwabben naar het deksel van de schotel.
Bevochtig het weefsel met net genoeg HBSS om ze te voorkomen dat ze uitdrogen. Gebruik vervolgens een wegwerp scalpel om de longkwabben te snijden om beenmerg te verkrijgen om de duurzame controle voor flow cytometry te gebruiken. Gebruik een paar scherpe schaar om bij de enkel en bovenkant van het dijbeen door te snijden.
Plaats het ledemaat in een nieuwe petrischaal. Snijd vervolgens het knie uit, waarbij een lineair stuk dijbeen en een tweede stuk met de scheenbeen en het kuitbeen overblijft. Trek met behulp van een pincet de spier eraf om het scheenbeen, kuitbeen en dijbeen te onthullen.
Neem nu een vijf milliliter spuit met een 26 en een halve gauge naald en steek de naald in de beenmergopening. Houd aan het ene uiteinde van het scheenbeen het bot vast met het andere uiteinde gericht in een 50 milliliter conische buis gevuld met 15 milliliters HBSS en druk de zuiger in om HBSS te spuiten en beenmerg in de buis te spoelen. Herhaal dit proces met een kuitbeen en dijbeen.
Kleur het beenmerg met host 3 3 3 4 2 die bij een uiteindelijke concentratie van vijf microgram per milliliter in aangevuld hoog glucose DMEM. Vervolgens zal een enkele cel suspensie van longweefsel worden gegenereerd uit het geïsoleerde weefsel. Plaats elke long in een buis met voorverwarmde 0,2% Worthington.
Typ twee collagenase Bereid in steriele HBSS, dompel vervolgens de buis in een 37 graden Celsius waterbad en incubeer gedurende 30 minuten. Gebruik na de incubatie de 10 milliliter pipette om het monster te tritraten totdat de digest gemakkelijk door de pipette stroomt. Ongeveer 10 herhalingen, incubeer gedurende nog eens 15 minuten, een 37 graden Celsius om de weefseldigestie te voltooien.
Zodra de digest voltooid is, verdun de cel suspensie met HBSS en gebruik een vijf milliliter pipette om opnieuw te tritten om eventuele resterende weefselfragmenten te verspreiden. Vervolgens, om onverteerde weefselfragmenten te verwijderen, giet de suspensie door een 70 micromolair cel zeef in een 50 milliliter conische buis. Voeg suspensie een beetje per keer toe om de steekproef door de cel zeef te laten stromen.
Als onverteerde weefselfragmenten de stroom van de cel suspensie volledig blokkeren. Giet door een nieuwe cel zeef in een nieuwe buis. Bezin de cel suspensie gedurende 10 minuten bij 450 RCF.
Na de spin giet het supernatant en schud de cel pellet voorzichtig op kamertemperatuur. Rode bloedcel lyse buffer, incubeer op kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens een gelijk volume HBSS toe om de lyse buffer te inactiveren.
Giet de cel suspensie in een 40 micromolair cel zeef om puin en cel aggregaten te verwijderen, verzamel de flow-through in een nieuwe 50 milliliter conische buis. Bepaal vervolgens met behulp van een hemo cytometer de cel aantallen voor zowel de long als beenmerg monsters. Noteer de concentratie en het totale volume van de cel suspensie.
Bezin vervolgens de enkele longcel suspensie door centrifugatie bij 450 RCF gedurende 10 minuten. Om de cellen te onderhouden, schud zowel de long als beenmerg cellen tegelijkertijd op. 10 tot zes cellen per milliliter in voorverwarmd aangevuld hoog glucose DMEM.
Om het DNA te kleuren, voeg HOAXED 3 3 3 4 2 kleurstof toe tot een uiteindelijke concentratie van vijf microgram per liter. Meng vervolgens de cellen door voorzichtig omkeren en incubeer in een 37 graden Celsius waterbad gedurende exact 90 minuten. Centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 450 G's bij vier graden Celsius na de spin.
Ga verder met het kleuren van het long- en beenmergweefsel met anti CD 45 en propidiumjo
Overzicht
Dit artikel demonstreert de isolatie en karakterisering van muizen residente long mesenchymatische stamcellen (long MSC's). De studie benadrukt hun immunomodulerende eigenschappen en potentiële toepassingen in longziekteonderzoek.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Stamcellenbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Long MSC's spelen een cruciale rol in weefselherstel en regeneratie.
- Ze zijn betrokken bij processen zoals fibrose, ontsteking en angiogenesis.
- Inzicht in hun eigenschappen kan helpen bij het ontwikkelen van therapieën voor longziekten.
- Isolatietechnieken zijn essentieel voor het effectief bestuderen van deze cellen.
Doel van het onderzoek
- Om muizen long MSC's te isoleren uit longweefsel.
- Om deze cellen te karakteriseren en hun immunomodulerende functies te beoordelen.
- Om een protocol te bieden dat kan worden aangepast voor menselijke long MSC's.
Gebruikte methoden
- Dissectie van longen van geofferde muizen.
- Digestie van longweefsel om een enkele cel suspensie te creëren.
- Flow cytometry voor het sorteren van CD 45 negatieve long MSC's.
- Kolonievormende assays om differentiatiecapaciteiten te evalueren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van lage CD 45 negatieve long MSC's.
- Karakterisering van de cellen toonde hun potentieel voor weefselherstel aan.
- Protocol kan worden toegepast op zowel muis- als menselijke long MSC's.
- Visuele demonstratie van de methode verbetert het begrip van weefselvoorbereiding.
Conclusies
- De studie biedt een betrouwbare methode voor het isoleren van long MSC's.
- Inzichten in de immunomodulerende eigenschappen van long MSC's werden verkregen.
- Dit onderzoek kan bijdragen aan het begrip van longziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolation of resident lung mesenchymal stem cells (MSCs) enables mechanistic de-risking in pulmonary fibrosis and pulmonary arterial hypertension target validation. This method supports phenotypic screening and assay development by providing a disease-relevant system for evaluating stromal contributions to lung pathology. Reproducible isolation of Hoechstlow CD45negative MSCs enhances predictive confidence in preclinical models of tissue repair and fibrosis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of MSC immunomodulatory functions in lung homeostasis and injury models.
- Operational Value: Provides a defined stromal population for target engagement studies in fibrotic pathways.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by isolating a well-characterized resident MSC subset for functional validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified lung MSCs for standardized co-culture assays with immune or epithelial cells.
- Operational Value: Enables quantitative readouts such as colony-forming unit (CFU) assays to assess stromal potency.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through flow cytometry gating strategies for Hoechstlow CD45negative populations.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease relevance modeling in pulmonary fibrosis, hypertension, and COPD through stromal functional assessment.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of MSC differentiation capacity across preclinical timepoints.
- Scientific Value: Provides a translational biomarker-aligned system for evaluating stromal modulation of fibrosis and angiogenesis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by supplying validated stromal cells for target validation and mechanistic screening prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on MSC roles in fibrosis, inflammation, and angiogenesis pathways.
- Screening: Delivers assay-ready MSCs with defined surface markers for reproducible stromal-immune co-culture screening.
- Analytics: Enables quantitative differentiation and proliferation readouts via CFU and CFSE-based assays.
- Translational Research: Connects isolation to preclinical continuity by characterizing MSC multipotency in osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform for cross-project stromal biology studies in lung disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in stromal target validation through defined MSC isolation and functional characterization.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via flow cytometry isolation of Hoechstlow CD45negative MSCs.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by de-risking stromal mechanisms in lung repair and fibrosis.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on MSC-mediated pathway modulation in preclinical models.
Implementation Considerations
- Expertise in flow cytometry setup, including UV laser compensation and doublet discrimination.
- Instrumentation requiring 488 nm, 635 nm, and UV 350–355 nm lasers with appropriate filters and chiller unit.
- Cross-team standardization of Hoechst and CD45 staining protocols for consistent MSC gating.
- Adaptation considerations for human lung MSCs using equivalent surface marker panels.
- Practical limitations include tissue digestion optimization and viability preservation during enzymatic dissociation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:49
Lung Isolation
4:05
Preparation of a Single Cell Suspension from Lung Tissue
7:15
Flow Cytometry Analysis to Define and Isolate a Lung MSC Population using Hoechst dye Efflux to Detect a Side Population
13:16
Enumeration of Lung MSC using a Colony Forming Assay (CFU-F)
14:49
Representative Analysis of Isolated MSCs
16:08
Conclusion
