Name: Isolatie and Karakterisering van Hoechst Lage CD45 Negatief Muis Lung Mesenchymale stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 55 s
Description: Leer de isolatie en karakterisering van muis long mesenchymale stamcellen met flowcytometrie en kolonievormingsassays. Deze methode ondersteunt onderzoek naar weefselherstel en longziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door subsidies te SMM: AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01. Aanvullende ondersteuning werd verleend door: DW: NIH RO1DK075013, DDK en de Kleberg Stichting; de UCCC Flow Cytometry Core (NIH 5 P30 CA 46934-15), de UCCC Microarray kern (NCI P30 CA 46934-14).

1. Lung Isolatie <ol><li> Offer volwassen muizen (8-10 weken in leeftijd, 18 tot 20 g; C57Bl6J) muizen met een overdosis van isofluraan, gevolgd door verbloeding met steriele techniek. Profielen enigszins verschillen tussen stammen. </li><li> Chirurgisch te verwijderen het middenrif, open de borstholte door het snijden van de borstkas zijdelings aan beide zijden van de muis. Spoel het bloed uit de longen door perfuseren de rechter hartkamer zachtjes met 3-5mls van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Ontleden van de longkwabben het verwijderen van de luchtpijp en de grote bronchi en doe dit in een petrischaal gevuld met Hanks gebufferde zoutoplossing (HBSS). Na de verzameling van alle longkwabben tang wordt gebruikt om weefsel plaatsen op het deksel van de schotel. Weefsel wordt vervolgens gehakt in kleine stukjes met behulp van disposable scalpels met voldoende vloeistof om ze vochtig, maar niet zo veel dat ze zweven en bewegen. </li><li> Ontleden een achterbeen van een van de muizen en isoleren het beenmerg te gebruiken als een kleuring controle om de flo te stellenw cytometrie poorten. Stain het beenmerg (BM) zoals eerder beschreven 1. </li></ol> 2. De voorbereiding van een enkele celsuspensie van longweefsel <ol><li> Elke long wordt verteerd door middel van een geoptimaliseerde tissue gewicht tot volume-verhouding van 0,2 g: 5mls van voorverwarmde 0,2% Worthington type 2 collagenase (Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ; cat # LS004202) opgelost in een steriele HBSS. Het mengsel wordt ondergedompeld in een 37 ° C waterbad gedurende 30 minuten 2,3. </li><li> Goed Vermaal monster tot longweefsel verteren stroomt gemakkelijk door een 10 ml pipet (ongeveer 10 herhalingen). Incubeer nog eens 15 min bij 37 ° C in te vullen het weefsel verteert en zorgt voor een meer uniforme enkele celsuspensie. </li><li> Verdun de long celsuspensie met HBSS en vermaal met een 5 ml pipet om de resterende weefsel fragmenten uiteen te drijven. </li><li> Filter de suspensie op met een 70μM cel zeef om onverteerd weefsel fragmenten te verwijderen. Monster kan worden verdeeld in multiple conische buizen op dit punt te voorkomen overbelasting van een cel filter en vermindert de tijd. </li><li> Pellet de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 1500 rpm en decanteer het supernatant. </li><li> Resuspendeer celpellet zachtjes met kamertemperatuur RBC lysis buffer (eBiosciences, San Diego, CA; cat # 00-4333-57) en incubeer bij RT gedurende 5 minuten. Voeg een gelijk volume van HBSS naar de lysis buffer inactiveren en de celsuspensie met behulp van een 40μM cel zeef om vuil en cel aggregaten te verwijderen filter. </li><li> Pipetteer 10μl van elk monster te worden gemerkt en tellen celaantallen voor zowel de long-en BM monsters met behulp van een hemocytometer. Let op: neem het totale volume van de cellen. </li><li> Pellet de enkele celsuspensie van longcellen door centrifugeren bij 1500 rpm gedurende 10 minuten. </li><li> Resuspendeer zowel long-en BM cellen op 1x10 6 cellen / ml in voorverwarmde (37 ° C) DMEM + (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium, hoog glucose (Gibco, Carlsbad, CA; cat # 11965-092) met 2% foetaal bovine serum (FBS) en 10mm HEPES. </li><li> Bereid een 1mg/ml voorraad oplossing van Hoechst 33342 kleurstof (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, cat # B2261) in water en filter steriliseren 1,4. De Hoechst kleurstof kan worden opgeslagen als aliquots bij -80 ° C. </li><li> Voeg Hoescht 33342 kleurstof tot een uiteindelijke concentratie van 5μg/ml (een 200x verdunning van een 1mg/ml voorraad) om de enkele celsuspensie. </li><li> Meng de cellen door zachtjes inversie en incubeer bij 37 ° C waterbad gedurende precies 90 minuten. </li></ol> 3. Kleuring en Voorbereiding van de Lung celsuspensie voor flowcytometrie-analyse <ol><li> Na 90 minuten alles in het werk met Hoechst gekleurde long-cellen moeten worden uitgevoerd bij 4 ° C of op ijs te verven efflux te voorkomen. Pellet de cellen door centrifugeren bij 1500 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer de cellen in ijskoude vlekken buffer (PBS +2% FBS). </li><li> Resuspendeer cellen bij een concentratie van niet meer dan 1x10 7 cellen / tube met behulp van 300-600μl van PBS met 2%FBS en 10 mM HEPES. </li><li> Voeg adequaat giechelde CD45 antilichaam (meestal 1:200 verdunning van CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA; cat # 559864) om de longen en BM samples Incubeer op ijs gedurende 10-15 minuten Inclusief een onbesmet controle tijdens de.. experimentele procedure is nuttig om de analyse poorten in te stellen. </li><li> Pellet-cellen bij 4 ° C gedurende 5 min bij 1500 rpm. Giet het supernatant en resuspendeer cellen in 500 pi van gekoelde vlekken buffer (PBS +2% FBS). Transfer naar prechilled snap cap polypropyleen buizen (Fisherbrand, Schaumburg, IL, cat # 14-956-1D). </li><li> Voeg propidiumjodide (PI, 200μg/ml voorraad in PBS) om de monsters voor een uiteindelijke concentratie van 2μg/ml om dode cellen te sluiten. PI moet worden gebruikt in combinatie met de Hoechst 33342 kleurstof op het juiste fluorescentie profiel op flowcytometrische analyse te bereiken. </li><li> Store buizen op ijs, beschermd tegen licht tot flowcytometrie-analyse. </li></ol> 4. Flowcytometrie-analyse te definiëren en te isolereneen Lung mesenchymale stamcellen (MSC long) Bevolking met behulp van Hoechst kleurstof Uitlooptijd om een ​​side population (SP) op te sporen <ol><li> Deze test heeft de volgende instrument eisen: </li><ul><li> 488 nm en UV (350-355 nm) lasers </li><li> 2 detectoren op de UV-laser pad met blauw (450/65) en rood (675/50) filters. </li><li> De UV-rode detector moet een hoge gevoeligheid voor het rode signaal. Dit kan een probleem met oudere cel sorteerders worden. </li><li> Koelmachine op het monster te handhaven op 5-10 ° C. </li></ul><li> Lijn lasers en opgezet voor celsortering volgende protocol van de fabrikant. </li><li> Verzamel de rode (x-as) en blauw (y-as) Hoechst signalen met behulp van een lineaire schaal. </li><li> Stel de fotomultiplicatorbuis spanningen aan de G0/G1 hoogtepunt plaats in de rechterbovenhoek van het midden op het perceel toe te staan ​​voor een adequate weergave van de trailing side population. Een deel van de S-fase en de gehele G2 van de celcyclus kan off-schaal in de rechterbovenhoek van het perceel. De blauwe siginterne is relatief helder, terwijl het rode signaal is afm. Typische MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) spanningen 425 voor de blauwe en 650 voor de rode. </li><li> Dode cellen worden gated met behulp van PI. De standaard PI pad (excitatie 488nm, 630nm emissie) kunnen worden gebruikt. Als alternatief is PI ook enthousiast over de UV-laser en de dode cellen bevolking ligt buiten de schaal aan de rechterkant van de side population (SP) plot. Dit vermindert de noodzaak om de PI-signaal van andere fluorochromen zoals FITC en PE te compenseren. De oorspronkelijke Goodell gevolgde methode voor laatstgenoemde procedures 5-7. </li><li> Onderhouden van een relatief lage drukverschil tijdens de analyse en sorteren strakke resolutie van de kant bevolking te waarborgen. </li><li> De SP ziet eruit als een zijarm los van de belangrijkste populatie van longcellen. Deze populatie is genoemd Hoechst laag. </li><li> De lage Hoechst / SP is geanalyseerd om de CD45 positieve en negatieve populaties met behulp van een histogram 2,3 (F apartigure 1). </li><li> Na de selectie en gating van de Hoechst lage CD45 neg long MSC de bevolking van de cellen kunnen worden verzameld door het sorteren als ofwel een gemengde bevolking in een buis of enkele cellen te klonen te isoleren in een 96-wells plaat 3. </li><li> Voor het sorteren van de plaat soort stroom afbuiging is ingesteld op 25% tot een meer verticale soort stroom dan meestal gebruikt voor het sorteren buis te creëren. </li><li> Doel van het soort stroom door het sturen van een test stroom puls op de bovenste links en dan de rechter ook van een 96-wells plaat. </li><li> Stel de sorter software plaat kaart om het gewenste aantal cellen storten elk putje. </li><li> Te isoleren enkele cel klonen een enkele long MSC wordt gesorteerd in de put van een 96-wells plaat in 150μl van cultuur media (α-MEM aangevuld met 20% FBS). Naar aanleiding van de soort een extra 100μl van medium wordt toegevoegd. </li></ol> 5. Isolatie, Cultuur en karakterisatie van long MSC en Clones <ol><li> Culture en uitbreiding van de gemengde long MSC populatie en single cell klonen na het sorteren is identiek met behulp van standaard kweekomstandigheden (37 ° C, 5% CO 2 en&gt; 95% luchtvochtigheid). Cellen mogen volgende isolatie houden gedurende 16 uur. Media is vervangen om de 48 uur (α-MEM aangevuld met 20% FBS). Wanneer de cellen beginnen te sneller prolifereren en te bereiken tussen de 75-80% confluentie ze zijn gepasseerd (figuur 2). </li><li> Cellen worden gespoeld met voorverwarmde HBSS en geïncubeerd met 0,5% trypsine / EDTA (Cellgro, Manassas, VA; cat # 25-053-Cl) bij 37 ° C voor minder dan 2 minuten. Cellen worden gecontroleerd met behulp van een omgekeerde mogelijkheden om het uiterlijk van een celsuspensie te bevestigen. </li><li> Lung MSC worden dan verdeeld in verhouding van 1:2 of 1:3, afhankelijk van de huidige wildgroei koers van de cultuur. </li><li> Het vermogen van de longen MSC om te differentiëren in de traditionele mesenchymale lineages van osteoblast, adipocyten en chondrocyten en hun cel-oppervlakte-expressie van de geaccepteerde mesenchymale markers is geëvalueerd voor elke cel voorbereiding. Cytogenetische banding analyse wordt ook uitgevoerd om de afwezigheid van de bruto-chromosomale afwijkingen 2,3,8-11 te bevestigen. </li></ol> 6. Opsomming van long MSC met behulp van een kolonievormende assay (CFU-F) <ol><li> Verdunnen cellen in Complete MesenCult medium (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) tot een uiteindelijke concentratie van 1x10 6 cellen / ml. </li><li> Seriële verdunningen uit te voeren tot de uiteindelijke concentraties te bereiken in een 100mm schaal van 6x10 4 cellen, 3x10 4 cellen, 1,5 x10 4 cellen en 0,75 x10 4 cellen in 10 ml van de media. Analyses worden uitgevoerd in twee-of drievoud voor elke cel de concentratie en kan worden geschaald voor kleinere oppervlakten. </li><li> Cultuur cellen gedurende 10 dagen onder standaard omstandigheden. Op dag 10 cellen worden gespoeld met PBS en gefixeerd met behulp van 100% methanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Detecteren de CFU-F kolonies door kleuring met 0,4% w / v Giemsa kleuroplossing(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) verdund 1:20 met gedemineraliseerd water. Laat monsters aan de lucht drogen en te kwantificeren van het aantal kolonies die meer dan 25 cellen per kolonie (figuur 3). </li></ol> 7. Analyse van de immuunmodulerende eigenschappen van de long MSC op T-cel proliferatie en apoptose <ol><li> 6.25x10 4 long MSC-cellen per well worden uitgeplaat in 96-well platen en toegestaan ​​om 's nachts 2 staan. </li><li> CD4 + cellen van de milt van T-cel receptor (TCR) transgene muizen, OT-II met T-cellen die de ovalbumine 323-339 peptide herkennen, worden gezuiverd door middel van putten CD8 +, CD19 +, MHC-II + en CD25 + cellen met een Miltenyi AutoMACS cell sorter (Miltenyi, Auburn, CA). Antigeen presenterende cellen (APC) worden geïsoleerd door positief te sorteren MHC-II + cellen 12. </li><li> APC worden gefixeerd in 4% paraformaldehyde, drie keer gewassen in PBS / 5% BSA/2mM EDTA, en geladen met 0.5μg/ml of 5μg / ml OVA323 peptide. </li><li> Gesimuleerd, de groei gearresteerd APC worden toegevoegd aan de longen MSC in 96-well platen. </li><li> Meer dan 95% zuiver CD4 + 1x10 5 cellen zijn voorzien van 5 urn carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE, Sigma, St. Louis MO) in PBS en geïncubeerd gedurende 5 minuten in het donker, gewassen met PBS-5% BSA, en vervolgens toegevoegd aan de APC en de longen MSC-cellen in DMEM 5% FBS media. Cellen worden vervolgens geïncubeerd gedurende 96 uur. </li><li> T-cellen worden dan gekleurd met anti anti-CD40 (Cy5), CD4 (APC-Cy7), CD8 (ViolBlue); vbeta 5 (PE) en geanalyseerd met behulp van een Miltenyi MacsQuant 7 kanaals flowcytometer (Miltenyi, Aurburn, CA) en de Flojo analyse software (Treestar, Ashland, OR). Proliferatie wordt gemeten als de daling van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de CFSE ten opzichte van de achtergrond, T-cellen gelabeld met CFSE en niet blootgesteld aan APC (figuur 4). T-cellen worden geteld op dit moment en de levensvatbaarheid beoordeeld met trypan blauw uitsluiting. </li></ol> 8. Representatieve resultaten: Figuur 1. Flowcytometrische analyse en definitie van Lung MSC. Enkele cel suspensies van longweefsel verteren zijn gekleurd met Hoechst 33342 en geanalyseerd door flowcytometrie om verschillen in A te detecteren. forward scatter (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) en B. Hoechst blauwe en rode fluorescentie. De aanwezigheid van een side population (SP) is zichtbaar in de poort. De Hoechst lage SP is vervolgens geanalyseerd om de C te scheiden. CD45 negatieve bevolking van long MSC. De CD45 positief naar negatief verhouding van long SP zijn typisch 70:30 / 60:40. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Isolatie en Cultuur van Lung MSC. Na de winning van de long door MSC celsortering, zijn de cellen uitgeplaat in 30mm gerechten met α-MEM supplemteerde met 20% FBS. A. Vers gesorteerde cellen lijken klein, rond en helder. B. Na ongeveer 2-3 weken kolonies met een mesenchymale fenotype duidelijk geworden en de proliferatie is meer voor de hand. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Telling van MSC door kolonievormende-Fibroblast Assay. Expanded longen MSC zijn vergulde per de beschreven protocol voor de CFU-F-test. A. Na 10 dagen en Giemsa vlek kolonies zijn duidelijk. B. Kolonies zijn groot en bestaan ​​uit een paar honderd cellen. C. De cellen vertonen een mesenchymale fenotype. A &amp; B, Schaal bar = 0,5 cm; C Schaal bar = 0,14 cm. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. CFSE basis van T-cel proliferatie Assay. Bij afwezigheid van longen MSC en de aanwezigheid van antigen presenterende cellen (APC) + / - ovalbumine (OVA), CD40-positieve effector T-cellen aan te tonen een afname van de intensiteit die CFSE proliferatie aangeeft (rode cirkel). CFSE fluorescentie-intensiteit van de T-cel membraan daalt stoichiometrisch met elke celdeling dwz. bij elke divisie. In aanwezigheid van long MSC, APC + / - OVA, CD40 positieve effector T-cellen aan te tonen geen significante verandering in CFSE intensiteit die een gebrek aan proliferatie geeft aan (rode cirkel).

<ol><li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li>
<li>Jun, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pathology+of+Bleomycin+Induced+Fibrosis+is+Associated+with+Loss+of+Resident+Lung+Mesenchymal+Stem+Cells+Which+Regulate+Effector+T-Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS%22%5BJournal%5D)">The Pathology of Bleomycin Induced Fibrosis is Associated with Loss of Resident Lung Mesenchymal Stem Cells Which Regulate Effector T-Cell Proliferation.</a> STEM CELLS. , (2011).</li>
<li>Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+lung+side+population+cells+have+mesenchymal+stem+cell+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential.</a> Cytotherapy. 10, 140-151 (2008).</li>
<li>Majka, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+progenitor+populations+in+skeletal+muscle+are+bone+marrow+derived+and+exhibit+different+cell+fates+during+vascular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111, 71-79 (2003).</li>
<li>Goodell, M. A., McKinney-Freeman, S., Camargo, F. D. Methods in Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodell%2C+MA+%22Basic+Cell+Culture+Protocols%22">Basic Cell Culture Protocols</a>. Helgason, D. C., Miller, C. L. 290, Humana Press. 343-352 (2005).</li>
<li>Tadjali, M., Zhou, S., Rehg, J., Sorrentino, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+Isolation+of+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Expression+of+an%5BTitle%5D)+AND+%22Abcg2%2FGFP+Allele.+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Prospective Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells by Expression of an.</a> Abcg2/GFP Allele. Stem Cells. 24, 1556-1563 (2006).</li>
<li>Zhou, S., Schuetz, J. D., Bunting, K. D., Colapietro, A. -M., Sampath, J., Morris, J. J., Lagutina, I., Grosveld, G. C., Osawa, M., Nakauchi, H., Sorrentino, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+transporter+Bcrp1%2FABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7, 1028-1034 (2001).</li>
<li>Chateauvieux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profile+of+mouse+stromal+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Molecular profile of mouse stromal mesenchymal stem cells.</a> Physiological Genomics. 29, 128-138 (2007).</li>
<li>Gregory, C. A., Prockop, D. J., Spees, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-hematopoietic+bone+marrow+stem+cells%3A+Molecular+control+of+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Non-hematopoietic bone marrow stem cells: Molecular control of expansion and differentiation.</a> Experimental Cell Research. 306, 330-335 (2005).</li>
<li>Menicanin, D., Bartold, P., Zannettino, A., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Profiling+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Genomic Profiling of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5, 36-50 (2009).</li>
<li>Summer, R., Fitzsimmons, K., Dwyer, D., Murphy, J., Fine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+an+Adult+Mouse+Lung+Mesenchymal+Progenitor+Cell+Population%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of an Adult Mouse Lung Mesenchymal Progenitor Cell Population.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 37, 152-159 (2007).</li>
<li>Waid, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+T+cell+subset+described+as+CD4loCD40%2B+T+cells+%28TCD40%29+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">A unique T cell subset described as CD4loCD40+ T cells (TCD40) in human type 1 diabetes.</a> Clinical Immunology. 124, 138-148 (2007).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We hebben een methode aangepast in eerste instantie gebruikt om de BM hematopoietische cellen identificeren een specifieke populatie van ingezeten long MSC te isoleren. Als gevolg van de reproduceerbaarheid van isolement deze cellen werden vervolgens goed gekarakteriseerd als MSC. Hun oorsprong is gedefinieerd als inwoner van de volwassen muis long (in tegenstelling tot zijn afgeleid BM) en een fenotypische en moleculaire profiel gedocumenteerd 2. De mogelijkheid om herhaaldelijk te isoleren deze gekenmerkt populatie kan de verdere studie van de biologische belang en de rol van de long MSC tijdens weefsel homeostase en ziekte. De recente definitie van deze populatie in vivo zowel in muis en mens longweefsel faciliteert de ontwikkeling van een therapeutische strategie gericht op de redding van endogene cellen om long te repareren te vergemakkelijken tijdens de verwondingen en ziektes.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) </td><td> Sigma </td><td> P-5368 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks gebufferde zoutoplossing (HBSS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30588.01 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,2% Worthington type 2 collagenase </td><td> Worthington Biochemicals </td><td> LS004202 </td><td></td
></tr><tr><td> Rode bloedcel lysis buffer </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td></td
></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td
></tr><tr><td> Hoechst 33342 kleurstof </td><td> Sigma </td><td> B2261 </td><td></td
></tr><tr><td> CD45-APC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559864 </td><td></td
></tr><tr><td> Propidiumjodide </td><td> Sigma </td><td> 81845 </td><td></td
></tr><tr><td> a-MEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30265.01 </td><td>; </td
></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-069 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,5% trypsine / EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25-053-Cl </td><td></td
></tr><tr><td> Compleet MesenCult Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05511 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,4% w / v Giemsa kleuroplossing </td><td> Sigma </td><td> GS1L </td><td></td
></tr><tr><td> 4% paraformaldehyde </td><td> Electron Microscopy Services </td><td> 15710 </td><td> 16% paraformeldehyde is verdund tot 4% met PBS </td
></tr><tr><td> Carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) </td><td> Sigma </td><td> 21888 </td><td></td
></tr></tbody></table>

isolatie &amp; karakterisering van hoechst lage cd45 negatief muis lung mesenchymale stamcellen

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue inwoner mesenchymale stamcellen (MSC) zijn belangrijke regulatoren van weefselherstel en regeneratie, fibrose, ontsteking, angiogenese en tumorvorming. Samen vormen deze studies suggereren dat inwoner long MSC een rol spelen tijdens het longweefsel homeostase, letsel en reparatie tijdens ziekten zoals longfibrose (PF) en arteriële hypertensie (PAH). Hier beschrijven we een technologie om een ​​populatie van ingezeten long MSC definiëren. De definitie van deze populatie in vivo longweefsel met behulp van een te definiëren set van markers vergemakkelijkt de herhaalde isolatie van een goed gekarakteriseerde stamcellen bevolking door middel van flowcytometrie en de studie van een bepaald celtype en functie.

In dit artikel tonen we de isolatie van murine inwoner long mesenchymale stamcellen (MSC long), hun expansie, karakterisering en analyse van immunomodulerende eigenschappen.

Isolatie &amp; Karakterisering van Hoechst Lage CD45 Negatief Muis Lung Mesenchymale stamcellen

In het weefsel aanwezige mesenchymale stamcellen (MSC) zijn belangrijke regulatoren van weefselherstel of -regeneratie, fibrose, inflammatie, angiogenese en tumoren ...

Deze video demonstreert een protocol voor de isolatie van gastheer lage CD 45 negatieve longmesenchymale stamcellen. Weefselresonante mesenchymale stamcellen of MSC's zijn belangrijke regulatoren van weefselherstel of regeneratie, fibrose, ontsteking en angiogenese. Eerst worden de longen gedisseceerd uit een geofferde muis.Het longweefsel wordt gedigesteerd om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen. De cellen worden gekleurd met hoax-kleurstof en CD 45 en vervolgens gesorteerd via flowcytometrie om gastheer-lage CD 45-negatieve long-MSC's te verkrijgen. De long-MSC's worden vervolgens in cultuur uitgebreid en er wordt een colony-forming assay uitgevoerd om de differentiatiecapaciteiten van de MSC's te beoordelen.Vervolgstudies kunnen vervolgens worden uitgevoerd om de rol van MSC's tijdens weefselhomeostase en ziekte te onderzoeken. De methode die we hier tonen, kan worden gebruikt om zowel muis- als menselijke longmesenchymale stamcellen te isoleren en kan worden toegepast op de studie naar longziekten zoals longfibrose, pulmonale hypertensie en COPD. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ervaren vanwege de variëteit aan beschikbare methoden voor weefselvoorbereiding, evenals de instelling van de flowcytometer, de passende controles en de analyse.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het lastig is om de juiste techniek voor het fijnmalen en verteren van het longweefsel voor een optimale celviabiliteit uitsluitend met woorden te beschrijven. Daarnaast worden de configuratie van het flowcytometrie-instrument en de analyses het beste via een demonstratie overgebracht. Begin dit protocol door de longen te verwijderen van een geofferde volwassen muis, die gebruikt zullen worden om mesenchymale stamcellen te verkrijgen.Gebruik een klein schaartje met scherpe punten om de ribbenkast van de muis aan weerszijden lateraal door te knippen. Open de borstholte en verwijder vervolgens het diafragma. Steek een spuit van 10 milliliter met een naald van 20,5 gauge in de rechterhartventrikel en druk voorzichtig de zuiger in om deze te perfunderen met 3 tot 5 milliliter PBS, zodat het bloed uit de longen wordt gespoeld.Knip vervolgens met een schaar de trachea en de grote bronchus af en gooi deze weg. Pak daarna met een pincet de kleine witte longkwabben op en plaats deze in een Petrischaal gevuld met Hank's gebufferde zoutoplossing of HBSS.Verwijder vervolgens het hart en scheid de longkwabben. Herhaal dit proces voor alle muizen in de studie. Breng de longkwabben over naar het deksel van de schaal.Bevocht het weefsel met net genoeg HBSS om uitdroging te voorkomen. Hak vervolgens met een wegwerpscalpel de longkwabben fijn om beenmerg te verkrijgen voor gebruik als positieve controle voor flowcytometrie. Gebruik een scherp schaartje om door te knippen bij de enkel en de bovenkant van het dijbeen.Plaats het ledemaat in een nieuwe Petrischaal. Snijd vervolgens de knie af, zodat er een lineair stuk dijbeen (femur) overblijft en een tweede stuk met het scheenbeen (tibia) en kuitbeen (fibula). Verwijder met een pincet het spierweefsel om het scheenbeen, kuitbeen en dijbeen bloot te leggen.Neem nu een spuit van 5 mL met een naald van 26,5 gauge en steek de naald in de opening van het beenmerg. Houd het bot vast bij één uiteinde van de tibia, met het andere uiteinde gericht in een conische buis van 50 mL gevuld met 15 mL HBSS, en druk op de zuiger om HBSS te dispenseren en het beenmerg in de buis te spoelen. Herhaal dit proces met een fibula en femur.Kleur het beenmerg met host 3 3 3 4 2 kleurstof bij een eindconcentratie van 5 µg/mL in aangevuld high glucose DMEM. Vervolgens wordt een enkelcel-suspensie van longweefsel gegenereerd uit het geïsoleerde weefsel. Plaats elke long in een buis met voorverwarmde 0,2% Worthington.Bereid type twee collagenase voor in steriel HBSS, dompel de buis vervolgens onder in een waterbad van 37 °C en incubeer gedurende 30 minuten. Gebruik na de incubatie de 10 ml pipet om het monster te tritureren totdat het digestaat gemakkelijk door de pipet stroomt. Voer dit ongeveer 10 keer uit en incubeer vervolgens nog eens 15 minuten bij 37 °C om de weefseldigestie te voltooien.Zodra de digestie is voltooid, wordt de celsuspensie verdund met HBSS en wordt een pipet van vijf milliliter gebruikt om eventuele resterende weefselfragmenten opnieuw te dispergeren. Giet vervolgens de suspensie door een 70 micromolar cell strainer in een conische buis van 50 milliliter om onverteerde weefselfragmenten te verwijderen. Voeg de suspensie geleidelijk toe zodat het monster door de cell strainer kan vloeien.Indien onverteerde weefselfragmenten de stroom van de celsuspensie volledig blokkeren: giet de suspensie door een nieuwe celzeef in een nieuwe buis. Pelleteer de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 450 RCF.Decanteer na het centrifugeren het supernatant en resuspendeer het celpellet voorzichtig in lysisbuffer voor rode bloedcellen op kamertemperatuur; incubeer dit vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens een gelijk volume HBSS toe om de lysisbuffer te inactiveren.Giet de celsuspensie door een celzeef van 40 µm om debris en celaggregaten te verwijderen, en verzamel het filtraat in een nieuwe conische buis van 50 ml. Bepaal vervolgens met een hemocytometer het aantal cellen voor zowel de long- als de beenmergmonsters. Noteer de concentratie en het totale volume van de celsuspensie.Pelleteer vervolgens de suspensie van enkelvoudige longcellen door centrifugatie bij 450 RCF gedurende 10 minuten. Om de cellen in stand te houden, resuspendeert u zowel de long- als de beenmergcellen tegelijkertijd op 10⁶ cellen per milliliter in voorverwarmd, gesupplementeerd high-glucose DMEM.Om het DNA te kleuren, wordt HOAXED 3 3 3 4 2 kleurstof toegevoegd tot een eindconcentratie van 5 µg/L. Meng vervolgens de cellen door voorzichtig te keren en incubeer ze gedurende precies 90 minuten in een waterbad van 37 °C. Centrifugeer daarna 10 minuten bij 450 ×g en bewaar de monsters na de spin bij 4 °C.Ga verder met het kleuren van het long- en beenmergweefsel met anti CD 45 en propidiumjodide ter voorbereiding op analyse via flowcytometrie. Zodra de cellen zijn gekleurd, bewaart u de buisjes op ijs en beschermd tegen licht tot de flowcytometrie-analyse wordt uitgevoerd. Bereid de flowcytometrie voor door te controleren of de lasers van de instrumenten zijn uitgelijnd en of het apparaat is ingesteld voor cel-sortering.Het gebruikte instrument moet zijn uitgerust met blauwe 488 nanometer, rode 635 nanometer en UV 350 tot 355 nanometer lasers, met twee detectoren op het UV-laserpad met blauwe 45 over 65 en rode 6 75 over 50 filters. Daarnaast moet de UV-rode detector een hoge gevoeligheid hebben voor het rode signaal en moet het instrument zijn uitgerust met een koelunit om de monsters op 10 °C te houden. Stel in de software van het instrument histogramplots in om lineaire forward scatter versus side scatter weer te geven, en een plot voor dubletdiscriminatie die geschikt is voor het instrument.Een histogramplot van PI met een log-signaal, een rood-versus-blauw-plot met lineaire signalen en een histogramplot van CD 45 A PC met een log-signaal. Zodra het instrument gereed is, plaatst u het gekleurde beenmergmonster in de laadpoort van het instrument. Dit monster wordt gebruikt als controle voor de kleuring en de instelling van het instrument.Begin met het verzamelen van events en pas de lineaire signalen voor forward scatter en side scatter aan. Om de celpopulatie duidelijk te visualiseren, moeten de cellen zich ongeveer in het onderste centrum van de plot bevinden, met forward scatter op de x-as. Aangezien de nucleaire kleuring PI membraanimpermeabel is, zal deze worden uitgesloten van levende cellen.Teken een gate-regio rond de PI-positieve dode cellen in het PI-histogram. Instrueer de software van het instrument om de dode cellen in deze gate rood te kleuren.Het is nuttig om de gekleurde, geventileerde dode cellen als navigatiepunt te gebruiken om de G0/G1-populatie van de gastheer te identificeren. De PI-kleuring wordt eveneens geëxciteerd door de UV-laser en de meeste dode cellen zouden buiten de schaal moeten vallen. Aan de rechterkant van de plot met rode versus blauwe fluorescentie van de gastheer moet de G0/G1-populatie van het beenmerg zichtbaar zijn als een dicht cluster van events.Stel de detectorspanningen zo in dat de G nul G één cluster rechtsboven het midden van het diagram wordt geplaatst. Een deel van de S-fase en de volledige G twee van de celcyclus kunnen buiten de schaal vallen. Rechtsboven in het rode versus blauwe hoaxed-diagram zal de side population met een lage fluorescentie zichtbaar zijn als een staart die vanaf de linkerkant van de G nul G één cluster naar de linkerbenedenhoek van het diagram loopt.Teken nu een gate rond de celcluster in de FSC versus SSC. Plot de singlets-populatie die is geïdentificeerd in de doublet-plot en de levende cellen in het PI-histogram. Wijs vervolgens de hoax-plot toe om alleen deze gegate populaties weer te geven.Teken na het gatten van de host-plot een regio rond de side population. Wijs deze regio toe als een gate voor het CD 45 A PC-histogram, samen met de gates voor light scatter singlets en levende cellen. Nu het systeem is ingesteld, verwijdert u het monster uit de laadpoort en plaatst u het longmonster in de laadpoort.De instrumentinstellingen hoeven voor dit monster niet opnieuw te worden aangepast. Begin met het verzamelen van events op de rood versus blauw hoax-plot. De G zero G one-cluster voor het longmonster is meestal meer verlengd in de richting van de x-as en vertoont een gelijkenis met het tilde-symbool op een toetsenbord.De gate voor de side population laag moet in een soortgelijke positie staan als die voor het beenmergmonster. Kleine aanpassingen naar boven of beneden kunnen nodig zijn om een scherpe resolutie van de side population te waarborgen. Handhaaf een laag drukverschil tijdens het sorteren door ervoor te zorgen dat de monsterstroomklep niet te ver wordt geopend.Om MSC's te isoleren, plaatst u een verzamelplaat met 96 wells in de sorteerkamer en stelt u de sort gates in op het CD 45 A PC-histogram om de positieve en negatieve populaties te scheiden. Verzamel tot slot de cellen, óf als een gemengde populatie in een buis, óf als enkele cellen in een 96-well plaat om klonen te isoleren. Na het verzamelen van de long-MSC's via cell sorting worden de cellen geplaatst in schalen van 30 millimeter met A MEM aangevuld met 20% FBS. In eerste instantie verschijnen de gesorteerde cellen na ongeveer twee tot drie weken als kleine, ronde en heldere cellen.Kolonies met het mesenchymale fenotype worden zichtbaar en de proliferatie is duidelijker voor elke celpreparatie. Evalueer het vermogen van long-MSC om te differentiëren naar traditionele mesenchymale lijnen van osteoblasten, adipocyten en chondrocyten, evenals hun celoppervlakexpressie van geaccepteerde mesenchymale markers. Voer een cytogenetische banderingsanalyse uit om de afwezigheid van grove chromosomale abnormaliteiten te bevestigen.Na isolatie door middel van flowcytometrie en het genereren van enkelcelklonen wordt een colony-forming assay uitgevoerd om de MSC-cellen en hun differentiatievermogen te karakteriseren. Begin met cellen verdund tot 3 × 10⁴ cellen per milliliter. In onvolledig cultuurmedium in 100 millimeter schaaltjes wordt een seriële verdunning uitgevoerd van 2,6 × 10⁴, 3 × 10⁴, 1,5 × 10⁴ en 0,75 × 10⁴ cellen per schaaltje in 10 milliliter medium, uitgevoerd in triplikaat.Plaats de platen na 10 dagen cultuur in de incubator, giet het medium af en spoel de cellen met PBS. Fixeer ze vervolgens door 100% methanol toe te voegen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Giet na vijf minuten de methanol af.Voeg vervolgens 0,4% gewicht/volume gza, één op 20 verdund met geïoniseerd water, toe om kolonievorming te detecteren en incubeer dit gedurende 10 tot 15 minuten. Giet daarna de kleurstof af en spoel met geïoniseerd water. Laat de monsters aan de lucht drogen en kwantificeer het aantal kolonies met meer dan 25 cellen per kolonie met behulp van een omgekeerde microscoop of visualisatie.Kolonies zijn groot en bestaan uit enkele honderden cellen, zoals hier getoond, en vertonen een mesenchymaal fenotype. MSC's werden geïsoleerd zoals getoond in deze video en uitgeplaat in 96-wellplaten voor gesimuleerde groei. Gecumuleerde, met CFSE gelabelde antigeen-presenterende cellen werden vervolgens toegevoegd aan de long-MSC's.De proliferatie van geïsoleerde MSC's werd vervolgens gemeten als de afname in de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van CFSE ten opzichte van de achtergrond, bestaande uit enkel CFSE-gelabelde T-cellen zoals in deze figuur wordt getoond, in afwezigheid van long-SC en aanwezigheid van antigeenpresenterende cellen; APC plus minus OVA CD 40-positieve geactiveerde T-cellen vertonen een afname in CFSE-intensiteit, wat duidt op proliferatie (rood omcirkeld). De CFSE-fluorescentie-intensiteit van het T-celmembraan neemt exponentieel af bij elke celdeling, oftewel met de helft per deling; in aanwezigheid van long-MSC-APC plus minus OVA CD 40-positieve geactiveerde T-cellen is er geen significante verandering in CFSE-intensiteit waarneembaar, wat duidt op een gebrek aan proliferatie. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de longstamcelbiologie om de rol van mesenchymale stamcellen bij longziekten, zoals pulmonale arteriële hypertensie en longfibrose, te onderzoeken.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer vijf uur worden uitgevoerd volgens deze procedure. Andere methoden, zoals differentiatie-assays, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, waaronder of de vermeende longmesenchymale stamcellen een geschikte multiliniage-differentiatie vertonen, met potentieel voor bot, vet en kraakbeen.

isolation-characterization-hoechstlow-cd45negative-mouse-lung

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Rat MSC's werden geïsoleerd uit dijbeen en dij-en vervolgens verrijkt door magnetische celsortering. Gesorteerde cellen werden bevestigd voor de expressie van de oppervlakte markers door flowcytometrie. Deze cellen werden ook gekweekt in klonale dichtheid aan enkele kolonies vormen en vervolgens deze kolonies werden van elkaar gescheiden door het klonen van cilinders.

Isolatie en Verrijking van Rat mesenchymale stamcellen (MSC&#39;s) en de scheiding van Single-kolonie Derived MSC&#39;s

Hier beschrijven we de isolatie van CD133 tot expressie lever stamcellen en kanker stamcellen van muizen gehele lever, een proces dat weefsel spijsvertering, cel verrijkingscocktail en flowcytometrie isolatie vereist. Wij omvatten methoden voor geavanceerde single cell isolatie en klonale expansie.

Isolatie van CD133 + lever stamcellen voor klonale expansie

Een sterk gezuiverde bereiding van de muis long dendritische cellen wordt beschreven. Specifieke aandacht wordt gegeven aan de isolatie van de conventionele dendritische cel subset.

Isolatie van Mouse Lung dendritische cellen

Dit protocol beschrijft een isolatietechniek voor het verkrijgen van primaire long resident mesenchymale stromale cellen van ratten, door middel van enzymatische digestie, dichtheidsgradiënt scheiding plastic hechting en CD146 + magnetische bead selectie.

Isolatie van CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung mesenchymale stromale cellen van Rat Longen

Hierin beschrijven we werkwijzen voor de ontleding van foetale en maternale weefsels van menselijke term placenta, gevolgd door isolatie en expansie van mesenchymale stamcellen / stromale cellen (MSC) van deze weefsels.

Isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen / stromale cellen afkomstig van menselijke placenta Tissue

In dit artikel werden primaire longendotheelcellen geïsoleerd en gekweekt uit neonatale muizen.

Isolatie van primaire longendotheelcellen van muizen

We presenteren een stapsgewijs protocol voor de isolatie van lange termijn hematopoëtische stamcellen (LT-HSCs) en korte termijn HSC's (ST-HSCs) met behulp van het Hoxb5 reporter systeem.

Isolatiemethode voor hematopoëtische stamcellen op lange en korte termijn

De isolatie van BAMBIhogeMFGE8hoge MSC's, een van de drie belangrijkste subgroepen die heterogene menselijke UC-MSC's vormen, is nuttig voor een volledig begrip van de kenmerken en functies van dit subtype voor de toekomstige toepassing ervan om de klinische werkzaamheid bij specifieke ziekten te verbeteren. Hier presenteren we een methode voor het sorteren van BAMBIhogeMFGE8hoge UC-MSC's.

Isolatie van menselijke BAMBIhogeMFGE8hoge navelstreng-afgeleide mesenchymale stromale cellen

Dit protocol beschrijft de isolatie van levende immuun- en niet-immuunpopulaties uit de muizenlong in een stabiele toestand en na griepinfectie. Het biedt ook poortstrategieën voor het identificeren van subsets van epitheelcellen en myeloïde cellen.

Isolatie van levende myeloïde en epitheelcelpopulaties uit de muizenlong

Dit protocol beschrijft de isolatie en de daaropvolgende expansie van mesenchymale stromale cellen en endotheelcellen kolonievormende cellen zonder het gebruik van dierlijke serum op autologe paren te genereren voor experimentele transplantatie doeleinden.

Isolatie en dierlijk serum vrije expansie van de mens navelstreng Afgeleid Mesenchymale stromale cellen (MSC&#39;s) en Endotheliale Colony Forming progenitor cellen (ECFCs)

Leer de isolatie en karakterisering van muis long mesenchymale stamcellen met flowcytometrie en kolonievormingsassays. Deze methode ondersteunt onderzoek naar weefselherstel en longziekten.

Isolatie & Karakterisering van Hoechst^Lage CD45^Negatief Muis Lung Mesenchymale stamcellen

Meer video's verkennen