Concentratie van de metabolieten van Low-density Planktonische Gemeenschappen voor het milieu Metabolomics met behulp van nucleaire magnetische resonantie spectroscopie
7 april 2012
Een methode voor het metaboliet extractie van microbiële gemeenschappen plankton wordt gepresenteerd. Hele gemeenschap bemonstering wordt bereikt door middel van filtratie op speciaal geprepareerde filters. Na lyofilisatie worden waterige oplosbare metabolieten geëxtraheerd. Deze aanpak maakt het voor de toepassing van milieu-metabolomics tot de trans-omics onderzoek van de natuurlijke of experimentele microbiële gemeenschappen.
Nucleaire magnetische resonantiespectroscopie biedt verschillende duidelijke voordelen voor onderzoek naar omgevingsmetabolomics, maar is relatief ongevoelig in deze procedure. Er wordt een filtratiemethode beschreven voor de concentratie en extractie van metabolieten van de gehele gemeenschap uit platonische systemen die geschikt zijn voor NMR. Dit wordt bereikt door eerst filters voor monstername speciaal voor te bereiden door extracteerbare stoffen te verwijderen.
De tweede stap van de procedure is het filteren van het monster, of dit nu natuurlijk of experimenteel is, op de filters. De derde stap van de procedure is het lyophiliseren van het monstermateriaal en het extraheren van metabolieten. De laatste stap van de procedure is het analyseren van de monsters met behulp van nucleaire magnetische resonantie spectroscopie en het op passende wijze integreren van de gegevens.
Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die metabole veranderingen in natuurlijke monsters over milieugradiënten of als reactie op experimentele manipulaties aantonen via metabolomics- en transams-benaderingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals centrifugatie, is dat de gehele gemeenschap bemonsterd kan worden en dat grotere monstervolumes mogelijk zijn voor monsters met een lage dichtheid. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van milieu-metaalmengsels, zoals de vraag hoe microbiele groei reageert op veranderingen in het milieu. De procedure zal worden gedemonstreerd in mijn laboratorium.
Begin dit protocol door met een pincet filters in een schone Pyrex-beker van 500 milliliter te plaatsen. Bedek het filter met gedestilleerd water om voor te spoelen en draai goed om te voorkomen dat de filters aan elkaar kleven. Giet het water af en herhaal het spoelen tweemaal.
Voeg na de laatste spoeling 300 milliliters Milli Q water toe aan het bekerglas en autoclaveer de filters. Zodra de filters zijn geautoclaveerd, giet het Milli Q water af en spoel de filters drie keer zoals voorheen, maar gebruik nu Milli Q water.
Plaats de individuele filters met een pincet op een schoon, droog oppervlak, zoals aluminiumfolie, en droog ze bij een geschikte temperatuur. Bijvoorbeeld bij 37 °C of door aan de lucht te laten drogen; de filters zijn nu klaar voor gebruik om dit protocol te demonstreren. Er wordt gebruikgemaakt van een Millipore roestvrijstalen filtermanifold voor drie plaatsen, uitgerust met 25 mm microanalyse-filterkolommen met glazen steunen en een mechanische pomp, waarbij aseptische technieken worden toegepast.
Plaats een enkel filter van 25 millimeter op de voet van de filterkolom. Plaats de kolom en klem het apparaat samen. Breng 15 milliliter monster, verkregen uit een nutriëntenrijke microkosmos, aan op de kolom.
Open de stopkraan van het filtermanifold en zet de filterpomp aan onder milde druk om celbreuk te minimaliseren. Voor monsters met een lagere dichtheid kunnen opeenvolgende toevoegingen van water noodzakelijk zijn. Let er hierbij op dat het filter tussen de toevoegingen van water niet gedurende een langere periode droog komt te staan.
Ten tweede kunnen residuele paramagnetische zouten uit mariene monsters worden gereduceerd en kan er optioneel een spoeling met zoet water worden uitgevoerd. Zodra het filteren is voltooid, schakelt u de pomp uit en laat u het ventiel openstaan zodat er nog steeds onderdruk onder het filter is. Verwijder de klem en de filterkolom met één hand.
Gebruik schone pincetten om het filter vast te pakken. Vouw het filter over zichzelf heen, maar zorg met de andere hand dat er geen vouw ontstaat. Gebruik de rand van een steriele microcentrifugebuis van twee milliliter om het filter op zijn plaats te houden.
Plaats het filter in de buis van twee milliliter en laat het los zodat het openklapt met de monsterzijde naar binnen gericht. Bevries het onmiddellijk in vloeibare stikstof om de wateroplosbare metabolieten te extraheren. Lyofiliseer de monsters eerst overnight of gedurende ten minste 10 uur; voeg na de lyofilisatie een roestvrijstalen crusher toe aan elke buis.
Voeg 750 µL gestandaardiseerde kaliumfosfaatbuffer en deuteriumoxide met DSS-standaard toe. Behandel de monsters vijf minuten lang bij 4 °C in een waterbad met een ultrasoonapparaat om het celmateriaal van het filter te verwijderen. Verwijder de filters met schone pincetten.
Breek de cellen open met een kogelmolen bij 1600 RPM gedurende vijf minuten. Incubeer ze vervolgens bij 65 °C. Schud het mengsel 15 minuten op een lab-schudapparaat.
Verwijder na incubatie de metalen crusher met een schone pincet. Centrifugeer het monster bij 13 000 G gedurende vijf minuten. Trek na centrifugatie de supernatant af en breng deze direct over in een NMR-buis voor NMR-spectroscopie.
Laad het monster hier in de NMR-spectrometer. Monsters worden geanalyseerd op een Bruker DRX 500 spectrometer, uitgerust met een TXI-probe met triple axis gradiënt, werkend bij 298 Kelvin. Voer de lock-, tune- en shim-procedures voor de magneet uit.
Verkrijg 1D protonen-NMR-spectra met de TopSpin-interface en eerder beschreven methoden, of gebruik indien nodig andere software voor de spectrometerinterface. In dit geval werden de spectra verkregen met onderdrukking van residuele watersignalen middels de Watergate-pulssequentie met een repetitietijd van 1,2 seconden. In het huidige voorbeeld werden voor elk monster 128 transiënten verzameld.
Kopieer de NMR-datamappen naar een persoonlijke computer waarop NMR pipe-software is geïnstalleerd. Verwerk de ruwe data, stel het DSS-signaal in als nul PPM-referentie en voer vervolgens handmatig de fasering van de spectra uit. Digitaliseer de spectrale gegevens via binning met behulp van het publiekelijk beschikbare FT two B-pakket van de eCommerce-website.
Andere softwarehulpmiddelen zoals RNMR of Atomics kunnen ook worden gebruikt voor binning. Gegevens kunnen worden genormaliseerd naar het totale signaal of het DSS-signaal om proportionele signaalveranderingen tussen monsters weer te geven. De outputgegevens kunnen nu worden gebruikt voor verdere statistische analyse, zoals hoofdcomponentenanalyse of PCA met behulp van gratis softwarepakketten zoals het getoonde R.
Hier is een voorbeeld van protonen-NMR-spectra verkregen met behulp van de gedemonstreerde procedure. De spectra zijn afkomstig van twee tijdstippen van een microcosmos-experiment en vertonen duidelijke verschillen als gevolg van algenmetabole activiteiten. Het spectrum van dag vier vertoont een aanzienlijke overvloed aan pieken, in het bijzonder in het gebied van 3 tot 4 ppm vergeleken met het monster van dag één.
Deze pieken kunnen worden toegeschreven aan suikers geproduceerd door bloeiende diatomeeën binnen het microkosmos. In een vergelijkbaar experiment werd een PCA-scoreplot afgeleid uit bend in Mr.Spectra, die de eerste twee hoofdcomponenten weergeeft, gebruikt om de groei van natuurlijke planktongemeenschappen in kunstmatig en natuurlijk zeewater te vergelijken. Deze statistische benadering reduceert multidimensionale gegevens naar een eenvoudiger formaat; hier, tweedimensionaal, om de structuur in de onderliggende datapunten te onthullen.
Beide assen of één van de assen vertonen hier meer overeenkomst. Duidelijke metabole verschillen tussen de twee behandelingen zijn zichtbaar. De gegevens uit dit experiment werden gebruikt voor het uitvoeren van een multi-omics analyse.
De combinatie van NMR met genomische gegevens over de samenstelling van de gemeenschap, gebaseerd op denaturerende gradiëntgelelektroforese van 18 S- en 16 S-R-R-N-A genen, laat eveneens duidelijke patronen in de microbiële gemeenschap zien tussen natuurlijke en kunstmatige zeewatermicrokosmen. Een dergelijke correspondentie tussen het metaboloom en het genoom van natuurlijke systemen demonstreert het nut van deze aanpak. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een geschikte techniek toe te passen om contaminatie na deze procedure te minimaliseren.
Andere methoden, zoals creatie-analyse op omics-niveau, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de wijze waarop het microbioom correleert met bepaalde metabolieten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het extraheren van metabolieten uit microbiële planktonische gemeenschappen met behulp van nucleaire magnetische resonantiespectroscopie. De procedure omvat filtratie op speciaal geprepareerde filters, lyofilisatie en daaropvolgende extractie van wateroplosbare metabolieten, wat metabolomische studies naar het milieu faciliteert.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Omgevingsmetabolomics
- Microbiële Ecologie
- Kernmagnetische Resonantiespectroscopie
Achtergrond
- Metabolietenextractie is essentieel voor het bestuderen van microbiële gemeenschappen.
- Kernspinresonantiespectroscopie biedt inzicht in de samenstelling van metabolieten.
- Filtratiemethoden verhogen de concentratie van metabolieten uit monsters.
- Deze aanpak kan worden toegepast op zowel natuurlijke als experimentele microbiële systemen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor de extractie van metabolieten uit microbiële planktonische gemeenschappen.
- Het mogelijk maken van gedetailleerde analyse van metabolieten met behulp van NMR-spectroscopie.
- Het bevorderen van het vakgebied van de milieu-metabolomics.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van filters om extractables te verwijderen.
- Filtratie van microbiële monsters op voorbereide filters.
- Lyofilisatie van het monstermateriaal.
- Extractie van wateroplosbare metabolieten voor analyse.
Belangrijkste resultaten
- De methode concentreert en extraheert met succes metabolieten uit microbiële gemeenschappen.
- NMR-spectroscopie analyseert de geëxtraheerde metabolieten effectief.
- De benadering is toepasbaar op zowel natuurlijke als experimentele monsters.
- De resultaten dragen bij aan het begrip van de metabolische profielen van microbiële gemeenschappen.
Conclusies
- Deze methode verbetert de studie van microbiële metabolomics.
- Het biedt een kader voor toekomstig onderzoek in milieumetabolomics.
- Verdere toepassingen kunnen leiden tot inzichten in microbiële interacties en functies.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Omgevingsmetabolomics kampt met uitdagingen op het gebied van gevoeligheid bij het bestuderen van microbiële gemeenschappen met een lage dichtheid, wat de toepasbaarheid van NMR in vroege discovery-workflows beperkt. Deze op filtratie gebaseerde concentratiemethode maakt niet-gerichte metabolietprofilering uit planktonische systemen mogelijk, wat hypothesevorming in de microbiële ecologie en exploratie van translationele biomarkers ondersteunt. Door de detecteerbaarheid van metabolieten te verbeteren, vergroot deze aanpak het voorspellende vertrouwen bij doelwitvalidatie en mechanistische risicoreductie voor toepassingen in de milieugezondheid.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door verschuivingen in metabolieten van de gehele gemeenschap vast te leggen als reactie op omgevingsprikkels.
- Operationele waarde: Biedt gestandaardiseerde protocollen voor filterpreparatie en lysis om technische variabiliteit bij de extractie van metabolieten te verminderen.
- Strategische waarde: Ondersteunt portefeuilletriage via reproduceerbare detectie van metabolietbiomarkers die gekoppeld zijn aan microbiële stress- of adaptatiepaden.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream NMR-screening door wateroplosbare metabolieten uit monsters met een lage dichtheid te concentreren.
- Operationele waarde: Garandeert assay-standaardisatie via lyofilisatie en extractie met kaliumfosfaatbuffer, wat de reproduceerbaarheid tussen verschillende runs verbetert.
- Strategische waarde: Verhoogt de screeningparaatheid voor studies naar effecten van verbindingen in microbiële co-culturen of synthetische gemeenschapsmodellen.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert ziekterelevante systeemmodellering door metaboloom-genoomcorrelatie mogelijk te maken in natuurlijke en kunstmatige zeewatermicrokosmen.
- Operationele waarde: Ondersteunt translationele continuïteit via multi-omics-integratie, waarbij metabolietspectra worden gekoppeld aan genomische gegevens over de samenstelling van de gemeenschap.
- Strategische waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door consistente metabolische signaturen te identificeren over verschillende milieugradiënten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in vroege discovery-workflows door hypothesetoetsing in microbiële systemen mogelijk te maken, gaat over tot screening via gestandaardiseerde metabolietextractie en ondersteunt translationeel onderzoek door middel van multi-omics data-alignering.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van pathways door veranderingen in metabolieten in planktonische gemeenschappen vast te stellen na experimentele manipulaties.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid en kwantitatieve resultaten via NMR-detecteerbare metabolietconcentraties na filtratie en lysis.
- Analytics: Genereert spectrale gegevens die geschikt zijn voor statistische analyse, zoals PCA, wat vergelijking van condities en patroonherkenning mogelijk maakt.
- Translationeel Onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit via de correspondentie tussen het metaboloom en het genoom in natuurlijke systemen, ter ondersteuning van de afstemming van biomarkers.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar filtratie- en extractieplatform dat toepasbaar is op diverse aquatische microbiële modellen.
Operationele en Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in microbiële metabolietresponsen te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid door middel van voorbehandeling van filters en geautomatiseerde lysestappen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door reproduceerbare metabolietprofielen te leveren voor biologische risicoreductie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk via detecteerbare metabolietverschuivingen gekoppeld aan microbiële groei of stressfenotypen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in filtratietechnieken, lyofilisatie en NMR-monsterpreparatie om contaminatie te voorkomen en herstel van metabolieten te waarborgen.
- Is afhankelijk van toegang tot NMR-spectrometers met mogelijkheden voor watersuppressie en software voor spectrale verwerking en binning.
- Maakt cross-team standaardisatie van filterbehandeling, extractiebuffers en datanormalisatieprotocollen noodzakelijk voor reproduceerbare resultaten.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij variërende monsterdichtheden, waarbij opeenvolgende filtraties of volumaanpassingen nodig zijn voor gemeenschappen met een lage abundantie.
- Bevat praktische beperkingen zoals interferentie door residuele paramagnetische zouten in mariene monsters, waarvoor optionele spoelstappen vereist zijn om de spectrale kwaliteit te behouden.
