Name: Visualiseren van Dengue Virus via Alexa Fluor Labeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Leer fluorescente labeling van het denguevirus met Alexa Fluor voor microscopische analyse. Deze methode maakt visualisatie van vroege virus-gastheerinteracties mogelijk voor virologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de National Medical Research Council, Singapore.

1. Alexa Fluor etikettering van dengue virus <ol><li> Voor de etikettering reactie, zuiveren dengue virus met sucrose kussen en de voorbereiding van de benodigde reagentia en apparatuur, zoals aangegeven in het protocol. </li><li> Bereid verse 0,2 M natriumbicarbonaat buffer, pH 8,5 (etikettering buffer), en 1.5M hydroxylamine buffer, pH 8,3 (stop reagens), vlak voor de etikettering en filter steriliseren met 0.2μm spuit filters. </li><li> Verdunnen van ongeveer 3x10 8 plaque-vormende eenheden (pfu) van gezuiverd dengue virus in 1 ml van de etikettering buffer in een 2ml buis. Dit kan worden opgeschaald naar evenredigheid voor de etikettering van de batch virus. </li><li> Los het gevriesdroogde Alexa Fluor 594 (AF594) succinimidyl esters tot 1 mm in de etikettering buffer direct voorafgaand aan de etikettering reactie. Andere fluorochromen van de Alexa Fluor kleurstof serie kan worden gebruikt volgens de eigen behoeften. Minimaliseer de blootstelling aan licht van deze stap verder. </li><li> Voeg 100μl van de 1mm AF594 kleurstof om de verdunde virus al roerend zachtjes met de pipetpunt. </li><li> Incubeer de etikettering reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in het donker. Meng door zachtjes te inversies elke 15 minuten. </li><li> Spin de buis kort in een tabletop centrifuge en voeg 100μl van stopreagens om de reactie mix al roerend zachtjes met de pipetpunt. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende een extra uur in het donker. Meng door zachtjes te inversies elke 15 minuten. </li></ol> 2. Zuiverende Alexa Fluor gelabeld dengue virus <ol><li> In de tussentijd, evenwicht de zuivering kolom met buffer van de keuze. In dit experiment, een PD-10 kolom geëquilibreerd met 25ml van HNE buffer (5mm Hepes, 150mm NaCl, 0,1 mm EDTA), pH 7,4, voor gebruik. </li><li> Van toepassing zijn de gelabelde virus naar de top van de kolom en beginnen met het verzamelen van de doorstroming als de gelabelde virus komt in de matrix. Vul de kolom met HNE buffer een keer al het label virus is binnengekomen de matrix. Gooi de eerste 2,5 ml van de doorstroom en het verzamelen van de volgende 2 ml van gelabeld virus fractie. </li><li> Aliquot en op te slaan gezuiverd AF594 gelabeld dengue-virus bij -80 ° C, weg van de lichtbron. </li></ol><ol><li> Dooi een aliquot en bepaal de titer van de gelabelde virus door plaque assay voor het gebruik van de batch van gelabelde virus. </li><li> Zaad 5x10 4 per putje van Vero-cellen, gekweekt in M-199 groeimedium, in een 4-wells plaat met een dekglaasje op de bodem van goed een dag voor de infectie. </li><li> Verwijder de kweeksupernatant in goed en de cellen met een multipliciteit van infectie van een van de gelabelde virus in 100μl volume (verdund in M-199 onderhoud medium zoals vereist) infecteren voor 10min bij 37 ° C. </li><li> Verwijder de inoculums en twee keer was de dekglaasjes in 1xPBS. </li><li> Fixeer de cellen in 3% paraformalydehyde voor 30 minuten. </li><li> Was de dekglaasjes 3 keer in 1xPBS. </li><li> Permeabilize de cellen met permeabilisatie oplossing, die 0,1% saponine en 5% BSA in 1xPBS voor 30 minuten. </li><li> Incubeer de cellen met onverdunde centrifugatie-verduidelijkt supernatant van 3H5 monoklonaal antilichaam hybridoma cultuur voor 1 uur in een vochtige kamer, beschermd tegen licht. </li><li> Was de dekglaasjes 3 keer in wasbuffer (1xPBS met 1 mM calciumchloride, 1 mM magnesiumchloride en 0,1% saponine). </li><li> Incubeer de cellen met AF488 anti-muis IgG antilichaam, 1:100 verdund in permeabilisatie oplossing, voor 45 min in de vochtige kamer, beschermd tegen licht. </li><li> Was de dekglaasjes 3 keer in wasbuffer en spoel een keer in gedemineraliseerd water. </li><li> Dep de rand van dekglaasje tegen een papieren handdoek om overtollig water af te voeren en monteren op glasplaatje met 8μl Mowiol 4-88 met 2,5% Dabco. </li><li> Laat de montage oplossing een nacht ingesteld op 4 ° C voordat u deze bekijkt met behulp van een Zeiss confocale microscoop. Sequentiële overnames moet worden uitgevoerd spannend een fluorofoor in een tijd en schakelen tussen de detectoren gelijktijdig. </li><li> Beelden worden vervolgens geanalyseerd voor co-lokalisatie van de E-eiwit antilichaam kleuring met de gelabelde virus met behulp van de LSM Zeiss Zen-software om de mate van labeling te schatten. </li></ol> 3. Representatieve resultaten Een voorbeeld van de opbrengst van dengue virus gemerkt met AF594 kleurstof is weergegeven in figuur 2. Normaal gesproken, zou minder dan 10-voudige daling ten opzichte van de initiële titer waargenomen worden na succesvol etikettering. Toch moet worden opgemerkt dat alle buffers moeten vers worden bereid voor de etikettering om succesvol te zijn en de Alexa Fluor succinimidyl esters moet onmiddellijk worden gebruikt na reconstitutie als ze hydrolyseren in niet-reactieve vrije zuren in waterige oplossingen 8. Vervolgens de gelabelde virus moet worden gecontroleerd op voldoende fluorescentie voor gebruik in experimenten. Een eenvoudige immunofluorescentie test werd gedaan op Vero-cellen en de mate van de etikettering kunnen worden geschat op basis van de co-lokalisatie van de gelabelde virus met anti-E eiwit antilichaam kleuring. ScheidenAl cellen werden onderzocht en een typisch confocale afbeelding wordt weergegeven in figuur 3. Co-lokalisatie analyse van de beelden met behulp van de LSM Zen software aangetoond overlap coëfficiënten variërend 0,65 tot 0,8, wat suggereert dat ongeveer 65 tot 80% van de virionen waren gelabeld met de kleurstof. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1.De totale regeling beeltenis van de Alexa Fluor kleurstof etikettering van dengue virus procedure. Eerste, de relevante buffers en gezuiverd dengue virus zijn voorbereid. De Alexa Fluor kleurstof is opgelost en toegevoegd aan het dengue virus verdund in de etikettering buffer. De reactie is dan een uur later gestopt met de toevoeging van stopreagens. Vervolgens wordt het label virus gezuiverd door middel van een size exclusion kolom om gratis kleurstof te verwijderen. Tot slot wordt de gelabelde virus opnieuw getitreerd door plaque assay en getest voor fluorescentie. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Gemiddeld aantal levensvatbare virionen (pfu / ml) zoals bepaald op een plaque assay voor en na de AF594 etikettering. Een deel van de AF594 gelabeld dengue-virus is ontdooid en opnieuw getitreerd door plaque assay en het typisch shows minder dan 10-voudige daling ten opzichte van de start titer. Foutbalken geven de standaarddeviatie van duplicaten. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Co-lokalisatie van AF594 etiketten met dengue virus E eiwitten in Vero-cellen. Cellen gekweekt op dekglaasjes de dag voorafgaand waren geïnfecteerd met AF594 gelabeld dengue op MOI van een gedurende 10 minuten bij 37 ° C. De cellen werden vervolgens vast en voorzien van anti-E antilichaam, en onderzocht colocalization van E eiwit (groen) en AF594 etikettering (rood). Fluorescerende signalen werden zichtbaar onder 63x vergroting met behulp van Zeiss LSM 710 confocale microscoop. Schaal bar is 10μm. Geel geven gebieden van colocalization, zoals te zien in de inzet.

<ol><li>Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &amp, Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fluorescent+Protein+Color+Palette%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Fluorescent Protein Color Palette.</a> Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li>
<li>Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+dengue+virus%3A+implications+for+flavivirus+organization%2C+maturation%2C+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion.</a> Cell. 108, 717-725 (2002).</li>
<li>Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethyl+sulfoxide+blocks+herpes+simplex+virus-1+productive+infection+in+vitro+acting+at+different+stages+with+positive+cooperativity.+Application+of+micro-array+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis.</a> BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).</li>
<li>Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+Alexa+Fluor+dye+labelling+of+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus.</a> J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Alexa+Fluor+Succinimidyl+Esters+%28Molecular+Probes%22">Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes</a>. , Invitrogen. (2009).</li>
<li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+proteins+stained+by+Alexa+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of proteins stained by Alexa dyes.</a> Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).</li>
<li>Freistadt, M. S., Eberle, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+poliovirus+for+flow+cytometric+cell+surface+binding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies.</a> J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).</li>
</ol>

Hoewel AF594 kleurstof werd gebruikt in dit rapport, een brede waaier van fluoroforen in de Alexa Fluor succinimidyl esters serie is leverbaar met vergelijkbare etikettering chemie. Dit kan uitbreiding van de etikettering van toepassing buiten beeldvorming. Flowcytometrie kan worden gebruikt als een alternatief voor de confocale microscopie voor het schatten van de mate van etikettering voor fluoroforen die kunnen worden opgewonden en gedetecteerd door de FACS apparaat. Alexa Fluor kleurstof...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Natriumbicarbonaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxylamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 159417 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxide </td><td> Merck </td><td> 106498 </td><td></td></tr><tr><td> AF594 succinimidyl esters </td><td> Molecular Probes, Invitrogen </td><td> A20004 </td><td></td></tr><tr><td> PD-10 kolom </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0851-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6147 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> M-199 </td><td> Invitrogen </td><td> 11150 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 4-well plaat </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> Einst </td><td> 0111520 </td><td></td></tr><tr><td> Microscoopglaasje </td><td> Sail Brand </td><td> 7105 </td><td></td></tr><tr><td> 3H5 hybridoma </td><td> ATCC </td><td> HB46 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> 1e Base </td><td> BUF-2040-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Saponine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S4521 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumchloride </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> Calciumchloride </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3306 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 15,812-7 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> DABCO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D27802 </td><td></td></tr><tr><td> Tafelblad centrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5424 </td><td></td></tr><tr><td> Confocale microscoop </td><td> Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td></td></tr></tbody></table> Voor te bereiden M-199 groeimedium, voeg 50 ml van FBS, 5 ml natrium pyruvaat en 5 ml van de niet-essentiële aminozuren tot 500 ml van M-199, steriele filter. Voor te bereiden M-199 onderhoud medium, voeg 15 ml van FBS, 5 ml natrium pyruvaat en 5 ml van de niet-essentiële aminozuren tot 500 ml van M-199, steriele filter.

visualiseren van dengue virus via alexa fluor labeling

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

De vroege gebeurtenissen in de interactie tussen virus en cel kan hebben grote invloed op de uitkomst van de infectie. Het bepalen van de factoren die deze interactie van invloed zou kunnen leiden tot een beter begrip van de ziekte pathogenese en dus invloed vaccins of therapeutische design. Daarom zou de ontwikkeling van methoden om deze interactie probe nuttig zijn. Recente ontwikkelingen in fluoroforen ontwikkeling 1-3 en imaging technologie 4 kan worden benut om onze huidige kennis over dengue pathogenese te verbeteren en zo de weg vrijmaken voor de miljoenen van dengue besmettingen per jaar te verminderen. De omhulde dengue-virus heeft een externe steiger bestaat uit 90 enveloppe glycoproteïne (E)-dimeren de bescherming van de nucleocapside shell, die een enkele positieve streng RNA genoom 5 bevat. De identieke eiwitsubeenheden op het virus oppervlak kan dus worden voorzien van een amine reactieve kleurstof en gevisualiseerd door middel van immunofluorescentie microscopie. Hier presenteren we een eenvoudige methode voor de etikettering van dengue virus met Alexa Fluor succinimidylester kleurstof direct opgelost in een natriumbicarbonaat buffer die zeer levensvatbaar virus leverde na labeling. Er is geen gestandaardiseerde procedure voor de etikettering van levend virus en bestaande fabrikant protocol voor het eiwit labeling meestal de reconstructie van kleurstof in dimethylsulfoxide vereist. De aanwezigheid van dimethylsulfoxide, zelfs in kleine hoeveelheden, kan blokkeren productieve infectie van het virus en ook leiden tot cel cytotoxiciteit 6. De uitsluiting van het gebruik van dimethylsulfoxide in dit protocol zo beperkt deze mogelijkheid. Alexa Fluor kleurstoffen hebben superieure fotostabiliteit en zijn minder pH-gevoelig dan de gewone kleurstoffen, zoals fluoresceïne en rhodamine 2, waardoor ze ideaal zijn voor het onderzoek naar cellulaire opname en endosomale transport van het virus. De vervoeging van Alexa Fluor kleurstof had geen invloed op de opname van gelabelde dengue-virus door virus-specifieke antilichamen en zijn vermeende receptoren in gastheercellen 7. Deze methode zou kunnen hebben nuttige toepassingen in virologische studies.

Profiterend van de vooruitgang in de ontwikkeling fluorofoor en imaging technologie, een eenvoudige methode van Alexa Fluor etikettering van dengue virus was ontwikkeld om het begin van de interacties tussen virus en cel visualiseren.

Visualiseren van Dengue Virus via Alexa Fluor Labeling

De vroege gebeurtenissen bij de interactie tussen virus en cel kunnen een diepgaande invloed hebben op de uitkomst van de infectie. Het bepalen van de factoren die ...

Het algemene doel van dit experiment is om het denguevirus fluorescent te labelen voor microscopische studies. Bereid de benodigde buffers voor en zuiver het denguevirus met een sucrosekussen; reconstitueer de Amy React Alexa flow-kleurstof en het denguevirus in labelingsbuffer. Label het denguevirus met honderd micromolair Alexa flow.Incubeer gedurende één uur en stop de labelingsreactie met het sub-reagens. Zuiver het gelabelde denguevirus via een grootte-uitsluitingskolom. Titreer het gelabelde virus opnieuw met een plaque-assay en schat de graad van labeling via een immunofluorescentie-assay.Hallo, ik ben Sam Jang van de DSO National Laboratories, werkzaam in het lab van Dr. Wee binnen het programma voor opkomende infectieziekten na mijn studie aan de NUS graduate medical school. Vandaag ga ik u laten zien hoe u het Denki-virus fluorescent kunt labelen met een amino-reactieve Alexa flu-kleurstof voor beeldvormingsstudies. Alexa flu-kleurstoffen hebben een superieure stabiliteit en zijn minder pH-gevoelig dan veelvoorkomende kleurstoffen zoals fluoresceïne en rhodamine, waardoor ze ideaal zijn voor studies naar de cellulaire opname en het endosomale transport van het virus.Alexa-gelabeld denguevirus zal het begrip van de pathogenese van dengue faciliteren. Laten we beginnen. Bereid vóór de labelingsreactie verse labelingsbuffer en stop-reagens voor volgens het schriftelijke protocol en zuiver het denguevirus via een sucrosekussen; voeg een geschikt volume van het gezuiverde denguevirus toe aan de labelingsbuffer in een microcentrifugebuisje om een concentratie van 300 miljoen forming units per milliliter te bereiken.Dit kan proportioneel worden opgeschaald. Voor batchlabeling van het virus: reconstitueer de geliofiliseerde Alexa-kleurstof tot een concentratie van 1 mM in labelingsbuffer vlak voor de labelingsreactie.Minimaliseer vanaf deze stap de blootstelling aan licht. Ten behoeve van de demonstratie zal de Alexa-stroomkleurstof onbeschermd tegen licht blijven. Voeg 800 µL van de 1 mM Alexa-stroomkleurstof toe aan het verdunde denguevirus, terwijl u voorzichtig roert met de tip van de micropipet.Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, waarbij elke 15 minuten voorzichtig wordt gemengd door inversie. Centrifugeer de buisjes na één uur kort. Neem 800 µL van de subregio op terwijl er voorzichtig wordt geroerd met de micropipet; incubeer vervolgens nog een uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, waarbij elke 15 minuten voorzichtig wordt gemengd door inversie.Equaliseer ondertussen de zuiveringskolom met 25 milliliters HNE-buffer. Breng na de incubatie van één uur het gelabelde virus aan op de kolom en begin met het opvangen van de doorloop. Vul de kolom met HNE-buffer.Zodra al het gelabelde virus in de matrix is geïntroduceerd, wordt de eerste 2,5 milliliters van het doorstroomvolume weggegooid en worden de volgende twee milliliters van de gelabelde virusfractie opgevangen. Vries het gezuiverde gelabelde virus in bij -80 °C. Bepaal de titer van het gelabelde virus via een plaque-assay.In een typisch experiment mag een daling van de virustiter van minder dan tienvoudig worden waargenomen. Na de labeling dient een immunofluorescentie-assay te worden uitgevoerd om de graad van labeling te evalueren. Hiervoor moeten de virale cellen worden geteld met behulp van een hemocytometer en moet een passend volume cellen aan groeimedium worden toegevoegd om een dichtheid van 50.000 cellen per milliliter te bereiken.Voeg één milliliter virale cellen per put toe aan een vierputjesplaat met een steriel glazen dekglas. Incubeer de cellen overnight bij 37 °C met 5% koolstofdioxide. Haal de plaat uit de incubator en aspireer het supernatant uit de put; behandel de cellen vervolgens met ongeveer één MOI van het gelabelde virus in een volume van honderd µL gedurende 10 minuten bij 37 °C.Verwijder het inoculum en was de cellen met 0,5 milliliters PBS-buffer per putje. Herhaal deze procedure nog twee keer. Fixeer de cellen met 200 microliters 3% per multi height per putje bij kamertemperatuur gedurende 30 Minutes.Was de cellen drie keer met 0,5 milliliters PBS-buffer per well. Fixeer de cellen met fixatie-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 30 Minutes. Verwijder het dekglas uit de well met een fijne pincet.Drain het overtollige vloeistof door de rand van het dekglas weg te trekken. Schuif het tegen een wit stuk papier. Plaats de cellzijde van het dekglas.Breng 25 µL dengue e-proteïne antilichaam aan op een dekglasplaatje. Incubeer gedurende één uur in een bevochtigingskamer bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Verplaats vervolgens het dekglasplaatje naar een six-well plaat en voeg twee mL wasbuffer per putje toe.Zuig het supernatant af. Herhaal deze wasstappen nog twee keer na de laatste wasbeurt. Verwijder het dekglas uit de put met een fijne pincet.Laat het overtollige vocht weglopen door de rand van het dekglas aan te raken. Absorbeer het vocht met een papieren wisdoek. Plaats het dekglas op de celzijde.Breng 25 µL Alexa Fluor 488 anti-muis secundair antilichaam aan op een dekglasje. Incubeer gedurende 45 minuten in een vochtige kamer bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Nadat de incubatie is voltooid, brengt u het dekglasje over naar een 6-wellplaat en wast u de cellen drie keer met 2 mL wasbuffer per wasbeurt. Verwijder na de laatste wasbeurt het dekglasje uit de well en spoel het één keer af met gedeïoniseerd water.Klap het overtollige vloeistof weg door het tegen een papier te drukken. Bevestig het dekglas op een microscoopglaasje met acht µL milde monteermiddel. Laat het monteermiddel een nacht uitharden in de lucht bij vier °C.Het monster is nu klaar om gevisualiseerd te worden met een fluorescentie- of confocale microscoop. Plaats een kleine druppel immersie-olie op het oppervlak van het dekglas en bevestig de microscoopdia door deze op de objecttafel te klemmen.Stel de tafel zo in dat het objectief van de microscoop in contact komt met de immersie-olie. Voor een helder beeld schakelt u de omgevingsverlichting uit met de Zes Zen-software. Klik op het tabblad 'ocular' voor directe observatie van het monster via het oculair van de microscoop.Zoek een veld met cellen en stel de focus in. Schakel nu over naar de acquisitiemodus. Om crosstalk tussen fluorescerende kanalen te minimaliseren, selecteert u afzonderlijke tracks voor Alexa Fluor 488 en DAPI.Stel de kleurstoffen en acquisitie-instellingen in voor sequentiële excitatie en detectie. Pas de laservermogensversterking en offset aan om ervoor te zorgen dat het beeld niet over- of onderbelicht is. Leg het beeld vast en analyseer een gebied van interesse met behulp van de colokalisatiefunctie.De overlapcoëfficiënt kan worden gebruikt om de graad van markering van het denguevirus met de Alexa Flo-kleurstof te schatten. Er werd een eenvoudige immunofluorescentie-assay uitgevoerd op virale cellen en de graad van markering kan worden geschat aan de hand van de colocalisatie van het gemarkeerde virus met anti-e-eiwit; bij kleuring met anti-antilichamen varieerden de overlapcoëfficiënten van 0,65 tot 0,8, wat suggereert dat ongeveer 65 tot 80% van de varianten waren gemarkeerd met de Alexa Flo-kleurstof. Voor een succesvolle markeringsprocedure is het belangrijk om de markeringsbuffer voor te bereiden, verse reagentia te gebruiken en de Alexa Flo-kleurstof te reconstitueren vóór de markering.De te gebruiken kleurstofconcentratie kan verder worden geoptimaliseerd om aan uw specifieke behoeften te voldoen. Deze methode voor het horizon-labelen van het denguevirus kan potentieel worden aangepast om andere virussen te labelen. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw labelingsexperiment.

visualizing-dengue-virus-through-alexa-fluor-labeling

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Functie-Spacer-Lipid (FSL) constructies kan de oppervlakte-eigenschappen van levende cellen en virions worden gewijzigd zonder verlies van vitaliteit. De methode vereist slechts een eenvoudige aanraking van een FSL bouwen oplossing met een cel / virion en spontaan en stabiele ondergrond incorporatie optreedt.

FSL Constructen: Een eenvoudige methode voor het wijzigen van Cell / Virion Oppervlakken met een bereik van biologische merkers zonder dat hun levensvatbaarheid

Detectie van virale RNA door fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH)

Adenovirus deeltjes zijn ontworpen om zowel de onnatuurlijke aminozuur analoog azidohomoalanine of de azido suiker...

Chemoselectieve Wijziging van Viral oppervlakken via bioorthogonal Klik Chemie

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

Source: Zaeck, L., et al. High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue. J. Vis. Exp. (2019). This video demonstrates the process of preparing and imaging mouse brain tissue infected with the rabies virus (RABV) to evaluate infection progression. It outlines key steps, including tissue staining with fluorescent markers, dehydration, clearing, and mounting for confocal laser scanning microscopy, culminating in the generation of a three-dimensional...

Three-Dimensional Visualization of a Rabies Virus Infection in Mouse Brain Tissue

De bevestiging van virionen aan een oppervlak is een vereiste voor enkelvoudige virion imaging door Super-resolution fluorescentie imaging of atomic force microscopie (AFM). Hier demonstreren we een monstervoorbereidingsmethode voor gecontroleerde hechting van virionen op glasoppervlakken die geschikt zijn voor gebruik in AFM- en superresolutiefluorescentiebeeldvorming.

Monstervoorbereiding voor single virion atomic force microscopie en superresolutie fluorescentie beeldvorming

Virussen of extracellulaire blaasjes werden immunogevangen met 15 nm magnetische nanodeeltjes gekoppeld aan antilichamen die oppervlakte-antigenen herkennen. De gevangen virionen of blaasjes werden gelabeld met fluorescente antilichamen tegen andere oppervlakte-antigenen. De resulterende complexen werden gescheiden in een hoog magnetisch veld en geanalyseerd met conventionele flowcytometers die werden geactiveerd door fluorescentie.

Flow Virometry Analyseer antigene Spectra van Virions en extracellulaire blaasjes

Hier presenteren we een gevoelige, snelle en discriminerende post-gel kleuring methode om image-ASE Tagged met RNA mango aptameren I, II, III, of IV, met behulp van een native of denaturerende Polyacrylamide gel elektroforese (pagina) gels. Na het runnen van standaard pagina gels, mango-gecodeerde RNA kan gemakkelijk worden gekleurd met TOT1-Biotine en vervolgens geanalyseerd met behulp van de meest beschikbare fluorescentie lezers.

Fluorescerende visualisatie van mango-Tagged RNA in Polyacrylamide gels via een Poststaining methode

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een fluorescentiebeeldvormingsbenadering, multiplex immunofluorescent cell-gebaseerde detection van DNA, RNA en protein (MICDDRP), een methode die in staat is tot gelijktijdige fluorescentie eencellige visualisatie van virale eiwitten en nucleïnezuren van verschillende type en gestrandheid. Deze aanpak kan worden toegepast op een breed scala aan systemen.

Eencellige multiplexed fluorescentie beeldvorming om virale nucleïnezuren en eiwitten te visualiseren en HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika-virus en influenza-infectie te controleren

Hier beschrijven we een eenvoudige methode die RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-FISH) combineert met immunofluorescentie om ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA te visualiseren. Dit protocol kan het begrip van de moleculaire kenmerken van SARS-CoV-2 RNA-host interacties op eencellig niveau vergroten.

Visualisatie van SARS-CoV-2 met behulp van Immuno RNA-Fluorescentie In Situ Hybridisatie

Het hier beschreven protocol schetst een snelle en effectieve methode voor het meten van neutraliserende antilichamen tegen het SARS-CoV-2 spike-eiwit door het vermogen van herstellende serummonsters te evalueren om infectie te remmen door een verbeterd groen fluorescerend eiwit-gelabeld vesiculaire stomatitisvirus pseudotyped met spike glycoproteïne.

Detectie van SARS-CoV-2 neutraliserende antilichamen met behulp van high-throughput fluorescerende beeldvorming van pseudovirusinfectie

Leer fluorescente labeling van het denguevirus met Alexa Fluor voor microscopische analyse. Deze methode maakt visualisatie van vroege virus-gastheerinteracties mogelijk voor virologisch onderzoek.

Visualiseren van Dengue Virus via Alexa Fluor Labeling

Meer video's verkennen