Visualiseren van Dengue Virus via Alexa Fluor Labeling
9 juli 2011
Profiterend van de vooruitgang in de ontwikkeling fluorofoor en imaging technologie, een eenvoudige methode van Alexa Fluor etikettering van dengue virus was ontwikkeld om het begin van de interacties tussen virus en cel visualiseren.
Het algemene doel van dit experiment is om denguevirus fluorescent te labelen voor microscopische studies. Bereid de benodigde buffers en zuiver het denguevirus met sucrose cushion. Herstel de Amy React Alexa flow kleurstof en denguevirus in labelbuffer. Label het denguevirus met honderd micromolar van Alexa flow.
Laat een uur intrekken en stop de labelreactie met het subreagens. Zuiver het gelabelde denguevirus door middel van een grootte-exclusiekolom. Retitereer het gelabelde virus door middel van een plaque-assay en schat de mate van labelen door middel van een immunofluorescentie-assay.
Hallo, ik ben Sam Jang van de DSO National Laboratories en werk in het laboratorium van Dr. Wee in het programma voor opkomende infectieziekten na de afstudeeropleidingen van NUS. Vandaag laat ik zien hoe je Denki-virus fluorescent kunt labelen met Amy Reactive Alexa flu kleurstof voor beeldstudie. Alexa, flu kleurstof, zijn superieur voor de stabiliteit en zijn minder pH-gevoelig dan gebruikelijke kleurstoffen zoals fluoresceïne en ruminetask, waardoor ze ideaal zijn voor onderzoek naar cellulaire opname en endosomale transport van het virus.
Alexa fout gelabeld denguevirus zal het begrip van dengue-pathogenese vergemakkelijken. Dus laten we beginnen. Voor de labelreactie bereid je verse labelbuffer en stopreagens voor volgens het geschreven protocol en zuivert het denguevirus door middel van sucrose cushion. Voeg een geschikt volume van het gezuiverde denguevirus toe aan labelbuffer in een microcentrifugebuis om een concentratie van 300 miljoen vormende eenheden per milliliter te bereiken.
Dit kan proportioneel opgeschaald worden. Voor batchlabeling van virus. Herstel de gelyofiliseerd Alexa floor kleurstof tot één millimolair in labelbuffer vlak voor de labelreactie.
Minimaliseer vanaf nu de blootstelling aan licht. Voor demonstratiedoeleinden wordt de Alexa floor kleurstof onbeschermd achtergelaten tegen licht, 800 microliters van de een millimolair. Voeg Alexa flow kleurstof toe aan het verdunde denguevirus terwijl je zachtjes roert met de micropipettip.
Laat een uur incuberen bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, vermengd door zachte omkeringen om de 15 minuten. Na een uur centrifugeer de buisjes kort. Voeg 800 microliters van de subregio toe terwijl je zachtjes roert met de micropipet en laat nog een uur incuberen bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, vermengd door zachte omkeringen om de 15 minuten.
Gelijktijdig, geeft u de zuiveringskolom aan met 25 milliliter HNE-buffer. Na de incubatie van één uur, brengt u het gelabelde virus aan op de kolom en begint u met het verzamelen van de doorstroming. Vul de kolom met HNE-buffer.
Zodra alle gelabelde virus het matrix is binnengekomen, gooi de eerste 2,5 milliliter van de doorstroming weg en verzamel de volgende twee milliliter van de gelabelde virusfractie. Bewaar en bekijk het gezuiverde gelabelde virus bij min 80 graden Celsius. Bepaal de titel van het gelabelde virus door middel van een plaque-assay.
In een typisch experiment zou er een daling van minder dan een tiende in de virustitel moeten worden waargenomen. Na het labelen dient een immunofluorescentie-assay te worden uitgevoerd om de mate van labelen te evalueren. Hiervoor telt u virale cellen met behulp van een hemo cytometer en een geschikt volume cellen tot groeimedium om een dichtheid van 50.000 cellen per milliliter te bereiken.
Zie één milliliter virale cellen per put in een vierputtenplaat met een steriele glazen deksel. Laat de cellen een nacht incuberen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Haal de plaat uit de incubator en zuig de bovenste vloeistof op uit de put. Infecteer de cellen met ongeveer één MOI van het gelabelde virus in een volume van honderd microliters gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius.
Verwijder het inoculum en was de cellen met 0,5 milliliter PBS-buffer per put. Doe dit nogmaals. Fixeer de cellen met 200 microliters van 3% per voor multi hoogte per put bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
Was de cellen drie keer met 0,5 milliliter PBS-buffer per put. Bewaar de cellen met behulp van een oplossing bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Verwijder het deksel met een fijne pincet.
Laat het overtollige vocht weglopen door de rand van het deksel te bevochtigen. Schuif het deksel tegen een papieren doek. Plaats de celzijde van het deksel.
Laat het op 25 microliters dengue e-eiwitantilichaam op een stuk parfum. Laat een uur incuberen in een vochtige kamer bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Breng het deksel vervolgens over naar een zesputtenplaat en voeg twee milliliter wasbuffer per put toe.
Zuig de bovenste vloeistof op. Herhaal deze wasstappen nogmaals twee keer na de laatste wasbeurt. Verwijder het deksel uit de put met behulp van een fijne fp.
Laat het overtollige vocht weglopen door de rand van het deksel te bevochtigen. Schuif het deksel tegen een papieren doek. Plaats de celzijde van het deksel.
Laat het op 25 microliters Alexa floor voor acht acht antimuis secundair antilichaam op een stuk parfum. Laat 45 minuten incuberen in een vochtige kamer bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Na de incubatie, breng het deksel over naar een zesputtenplaat en was de cellen drie keer met twee milliliter wasbuffer voor elke wasbeurt. Na de laatste wasbeurt verwijdert u het deksel uit de put en spoelt u eenmaal af in geïoniseerd water.
Laat het overtollige vocht weglopen door te bevochtigen tegen een papier. Monteer het deksel op een microscooplicht met acht microliters milde montageoplossing. Laat de montageoplossing een nacht lang stollen bij vier graden Celsius.
De monster is nu klaar om met een fluorescente of confocale microscoop te worden bekeken. Plaats een kleine druppel immersieolie op het oppervlak van het deksel en bevestig de microscoop. Schuif naar de microscooptafel.
Pas het tafeloppervlak aan totdat het microscoopobjectief in contact komt met de immersieolie. Voor een helder beeld, zet de omgevingslichten uit met behulp van de Zes Zen-software. Klik op het oculaire tap voor directe observatie van het monster door het oc
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het fluorescent labelen van het dengue-virus met behulp van Alexa Fluor voor microscopische analyse. De aanpak maakt het mogelijk om vroege interacties tussen het virus en gastcellen te visualiseren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Virologie
- Fluorescentiemicroscopie
- Celbiologie
Achtergrond
- Dengue-virus is een belangrijke mondiale gezondheidszorg.
- Begrip van virus-celinteracties is cruciaal voor het ontwikkelen van antivirale strategieën.
- Fluorescent labelen verbetert de visualisatie van deze interacties.
- Vooruitgang in beeldtechnologieën vergemakkelijkt gedetailleerde studies.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het labelen van dengue-virus.
- Om de interacties tussen dengue-virus en gastcellen te visualiseren.
- Om het begrip van de vroege stadia van virale infectie te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van noodzakelijke buffers voor labelen.
- Zuivering van dengue-virus met behulp van sucrose-cushion.
- Reconstitutie van Alexa Fluor-kleurstof in labelbuffer.
- Labelen van het virus met een specifieke concentratie kleurstof.
Belangrijkste resultaten
- Succesvol fluorescent labelen van dengue-virus.
- Visualisatie van virus-celinteracties onder een microscoop.
- Beoordeling van de labelefficiëntie door middel van immunofluorescentie-assay.
- Retitratie van gelabeld virus met behulp van plaque-assay.
Conclusies
- De methode biedt een eenvoudige en effectieve manier om dengue-virus te labelen.
- Fluorescent labelen helpt bij het bestuderen van virus-gastinteracties.
- Deze techniek kan worden toegepast op andere virale studies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Direct fluorescent labeling of dengue virus with Alexa Fluor enables precise visualization of virus-cell interactions, supporting early-stage mechanistic studies in infectious disease research. This capability enhances predictive confidence in target validation and informs translational strategies for antiviral and vaccine development. The method's compatibility with live virus and quantitative imaging strengthens its value across discovery and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of virus entry and trafficking mechanisms in host cells.
- Supports biological de-risking by clarifying early infection events relevant to pathogenesis.
- Facilitates functional target validation through visualization of labeled virus interactions.
- Improves predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized approach for preparing fluorescently labeled virus for imaging-based assays.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of labeling efficiency via immunofluorescence and plaque assays.
- Enables scalable batch labeling suitable for high-content screening platforms.
- Supports reliable evaluation of antiviral compound effects on virus-cell entry and trafficking.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by preserving virus infectivity post-labeling.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of intervention strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative imaging readouts.
- Facilitates biomarker alignment through colocalization analysis of viral and cellular markers.
Pipeline & Workflow Integration
This labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis-driven studies, assay development, and translational research on viral pathogenesis.
- Discovery Biology: Advances mechanistic understanding of virus-host interactions through direct visualization and quantitative colocalization.
- Screening: Delivers reproducible, labeled virus preparations for imaging-based screening of antiviral candidates.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as overlap coefficients and infectivity titers for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains functional virus for use in disease-relevant cellular models and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable protocol for labeling other enveloped viruses in diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage virology research.
- Operational Value: Standardizes virus labeling and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral and vaccine candidates based on quantitative imaging data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, fluorescence microscopy, and quantitative image analysis.
- Needs access to high-quality imaging platforms and analytical software for colocalization studies.
- Demands rigorous buffer preparation and dye handling to ensure reproducibility and minimize cytotoxicity.
- Adaptable to other enveloped viruses with protocol optimization for specific viral systems.
- Dependent on maintaining virus viability and labeling efficiency for downstream applications.
