DNA-methylatie: bisulfiet Wijziging en Analyse
21 oktober 2011
De gouden standaard voor DNA methylatie analyse is genomische sequentie van bisulfiet omgezet DNA. Deze methode maakt gebruik van de verhoogde gevoeligheid van cytosine in vergelijking met 5-methylcytosine (5-MEC) tegen desaminering bisulfiet onder zure omstandigheden. Niet-gemethyleerd cytosines kunnen worden onderscheiden van gemethyleerd cytosines na PCR-amplificatie van het doel genomisch DNA.
Het algemene doel van deze procedure is om DNA-methyleringanalyse van CPG-dinucleotiden mogelijk te maken door genomische sequencing van door sulfiet geconverteerd DNA. Dit wordt bereikt door eerst het dubbelstrengs DNA te denatureren, zodat de bisulfietconversiereactie kan plaatsvinden. De tweede stap is om alle niet-gemethyleerde cytosinen in het genomische DNA om te zetten in uracil door bi-sulfiet-deaminering.
Deze reactie omvat drie fasen. De eerste is sulfatatie van de cytosine-residu door de toevoeging van B-sulfiet aan de vijf-zes dubbele binding. Ten tweede produceert hydraulische deaminering van het cytosine door een sulfietderivaat een SSL-bisulfietderivaat, en ten derde resulteert verwijdering van de sulfonaatgroep door alkalibehandeling in een SSL-residu.
Vervolgens wordt het doelgebied versterkt door bi-sulfietconversiespecifieke primers en PCR-amplificatie. De laatste stap is het klonen en sequencen van het PCR-product om een nucleotideresolutie te verkrijgen voor methylering over het DNA-molecuul. Uiteindelijk tonen de resultaten DNA-methylering van CPG-dinucleotiden in genomisch DNA door gebruik te maken van de verhoogde gevoeligheid van cytokine ten opzichte van vijf methylcytosine voor bisulfaatdeaminering onder zure omstandigheden.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals Southern Blood Analysis, is dat het single nucleotide resolutie van d-methylering mogelijk maakt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het epigenetisch veld, zoals de rol van DNA-methylering bij humane ziekten zoals kanker. Om DNA-monsters voor bi-sulfietconversie voor te bereiden, incubeer eerst twee microgram genomisch DNA met bi-sulfiet, DNA-lysebuffer en een totaal volume van 18 microliter gedurende één uur bij 37 graden Celsius.
Denatureer vervolgens het genomisch DNA door twee microliter vers bereide drie molare natriumhydroxide toe te voegen tot een uiteindelijke concentratie van 0,3 molair. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius in een waterbad, gevolgd door incubatie bij 90 graden Celsius gedurende twee minuten. Plaats de buisjes onmiddellijk gedurende vijf minuten op ijs in een hitteblok, centrifugeer de buisjes gedurende 10 seconden tot 10.000 Gs om ervoor te zorgen dat het DNA zich onderaan de buis bevindt, de gedenatureerde DNA-monsters zijn nu klaar voor B-celdeaminering, die als volgende zal worden gedemonstreerd.
Voorafgaand aan de sulfatatie- en hydrolytische deamineringsreacties, bereid verse oplossingen van 10 millimolair chinol en verzadigd natriummetabisulfiet pH 5,0. Aangezien het natriummetabisulfiet een verzadigde oplossing is, kunnen kleine klonten onopgelost blijven. Voeg de natriummetabisulfiet 208 microliter en chinol 12 microliter toe aan de gedenatureerde DNA 20 microliter in een uiteindelijk volume van 240 microliter.
Vortex de buisjes en centrifugeer gedurende 10 seconden om ervoor te zorgen dat alle druppels zich onderaan de buis bevinden. Bedek de monsters met mineraalolie. Incubeer de monsters gedurende vier tot 16 uur op 55 graden Celsius in een waterbad, afhankelijk van de hoeveelheid en kwaliteit van het DNA dat moet worden geconverteerd.
Het is belangrijk dat de bisulfietconversie in het donker plaatsvindt om oxidatie te voorkomen. Aan het einde van de juiste incubatietijd, draai de buisjes kort in een microcentrifuge om ervoor te zorgen dat al het vocht zich onderaan de buis bevindt. Pipetteer vervolgens voorzichtig de DNA-oplossing vanaf de bodem van de buis zonder enige mineraalolie op te nemen.
Voor de volgende stappen gebruikt ons laboratorium het Promega Wizard DNA-opruimingssysteem. Voeg één milliliter hars toe aan de DNA-monsters, draai de buis om te mengen en pipet de oplossing vervolgens in een spuit die aan een ontzoutingskolom is bevestigd. Ten slotte, om eventuele vrije bi-sulfietionen te verwijderen, passeer het bi-sulfietbehandelde DNA door de ontzoutingskolom en eludeer in 50 microliter Milli Q-water.
De volgende stap is het verwijderen van de bisulfiet-attic uit de uracilring door ontzouting. Om dit te bereiken, voeg 5,5 microliter vers bereid drie molare natriumhydroxide toe aan elk bisulfietbehandeld DNA-monster voor een uiteindelijke concentratie van 0,3 molair. Incubeer vervolgens de monsters gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius.
Centrifugeer de monsters kort en voeg vervolgens één microliter tRNA toe aan elk monster. Neutraliseer de oplossing door ammoniumacetaat toe te voegen tot een uiteindelijke concentratie van drie molair. Vervolgens ethanolprecipiteer het DNA.
Voeg ijskoud 100% ethanol 330 microliter toe en meng goed door omkering. Laat een uur tot een nacht op minus 20 graden Celsius staan, centrifugeer vervolgens 15 minuten bij 14.000 Gs bij vier graden Celsius. Verwijder vervolgens alle sporen van supernatant en laat het geprecipiteerde DNA ongeveer 20 minuten aan de lucht drogen.
Na het aan de lucht drogen is de pellet bijna onmogelijk te zien, hersuspendeer het DNA-pellet in 50 microliter 0,1 XTE of water, laat het op kamertemperatuur staan gedurende ongeveer twee uur. Gedurende deze tijd, vortex de buisjes af en toe om ervoor te zorgen dat het DNA is opgelost, gevolgd door een snelle centrifuge. Zodra het DNA is opgelost, kan het gedurende één tot tien jaar op minus 20 graden Celsius worden bewaard, afhankelijk van de hoeveelheid en kwaliteit van DNA, of onmiddellijk worden gebruikt. Voor PCR-amplificatie is primeroptimalisatie het moeilijkste aspect van deze procedure.
Daarom worden de volgende richtlijnen gegeven om succes bij het ontwerpen van primers te garanderen. Om deze richtlijnen te illustreren, is de doelsequentie door sulfiet omgezet, zodat wanneer geschreven, geconverteerde cytosinen als blauwe T's verschijnen en niet-geconverteerde CPG-plaatsen als rode cg's. Primers moeten 24 tot 30 basenparen lang zijn om specificiteit te garanderen. Primers moeten een vergelijkbaar voorspeld TM hebben b
Overzicht
Dit artikel beschrijft een procedure voor DNA-methylatieanalyse van CPG-dinucleotiden met behulp van genomische sequencing van bisulfiet geconverteerd DNA. De methode onderscheidt tussen ongemethyleerde en gemethyleerde cytosines, waardoor resolutie op enkelnucleotideniveau mogelijk is.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Epigenetica
- DNA-methylatie
- Genoomsequencing
Achtergrond
- DNA-methylatie speelt een cruciale rol in genexpressie.
- Traditionele methoden zoals Southern blotting hebben geen resolutie op enkelnucleotideniveau.
- Bisulfietconversie verhoogt de gevoeligheid voor het detecteren van methylatie.
- Deze techniek kan inzicht geven in menselijke ziekten, inclusief kanker.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het analyseren van DNA-methylatie met resolutie op enkelnucleotideniveau.
- Om de implicaties van DNA-methylatie in epigenetica te onderzoeken.
- Om bestaande methoden te verbeteren voor betere nauwkeurigheid in methylatiedetectie.
Gebruikte methoden
- Denaturatie van dubbelstrengs DNA.
- Bisulfietdeaminering om ongemethyleerde cytosines om te zetten in uracil.
- PCR-amplificatie met behulp van bisulfietspecifieke primers.
- Kloneren en sequencen van PCR-producten voor analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle conversie van ongemethyleerde cytosines naar uracil.
- Resolutie op enkelnucleotideniveau bereikt in methylatieanalyse.
- Voordelen aangetoond ten opzichte van traditionele methoden.
- Een kader geboden voor toekomstige studies in epigenetica.
Conclusies
- De methode maakt nauwkeurige analyse van DNA-methylatie mogelijk.
- Het heeft significante implicaties voor het begrijpen van genexpressie.
- Deze techniek kan helpen bij onderzoek naar ziekten zoals kanker.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate detection of DNA methylation at single nucleotide resolution is critical for target validation in epigenetic drug discovery, enabling mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. This method supports predictive confidence in preclinical models by linking methylation patterns to disease states such as cancer, informing portfolio prioritization. It provides a reproducible foundation for translational biomarker development and assay standardization across discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving methylation status at individual CpG dinucleotides.
- Operational Value: Provides quantitative, nucleotide-resolution data to de-risk epigenetic targets before lead identification.
- Predictive Value: Supports disease-relevant system modeling by correlating methylation with gene expression in cancer and differentiation models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates methylation maps that serve as standardized inputs for epigenetic screening campaigns.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through controlled bisulfite conversion and sequencing readouts.
- Scalability: Enables platform reuse across cell lines and tissue types for longitudinal methylation profiling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links methylation changes to phenotypic outcomes in preclinical disease models.
- Operational Value: Facilitates cross-functional alignment between discovery and preclinical teams via shared epigenetic datasets.
- Risk Mitigation: Informs go/no-go decisions by identifying epigenetic drivers of pathology early in the pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, providing epigenetic context that improves decision fidelity at each stage.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by clarifying whether observed phenotypes are methylation-dependent.
- Screening: Delivers quantitative methylation outputs that enable compound effect assessment in epigenetic assays.
- Analytics: Produces single-nucleotide methylation ratios that allow statistical comparison across treatment conditions.
- Translational Research: Connects epigenetic findings to biomarker strategies by identifying differentially methylated regions in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized epigenetic profiling capability applicable to multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in epigenetic target validation through base-resolution methylation data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of epigenetic measurements across sites and studies.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier identification of non-viable epigenetic targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by integrating epigenetic stability into preclinical candidate selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epigenetics, molecular biology, and nucleic acid handling.
- Dependent on thermal cyclers, sequencing platforms, and bisulfite conversion reagents.
- Necessitates standardized protocols for DNA denaturation, conversion, and cleanup to ensure consistency.
- Must account for DNA degradation risks during prolonged bisulfite incubation and alkaline desulfonation steps.
- Requires validation across diverse genomic contexts (e.g., CpG islands, repetitive regions) to ensure broad applicability.
