DNA-methylatie: bisulfiet Wijziging en Analyse

Het algemene doel van deze procedure is om DNA-methyleringsanalyse van CpG-dinucleotiden mogelijk te maken door genomische sequencing van met bisulfiet geconverteerd DNA. Dit wordt bereikt door eerst het dubbelstrengs DNA te denatureren, zodat de bisulfietconversiereactie kan plaatsvinden. De tweede stap is het converteren van alle ongemethyleerde cytosines in het genomische DNA naar uracil via bisulfietdeaminering.

Deze reactie bestaat uit drie fasen. De eerste is de sulfatering van het cytosineresidu door de additie van B-sulfiet aan de dubbele binding tussen de vijfde en zesde positie. Ten tweede produceert de hydrolytische desaminering van het cytosine door een sulfietderivaat een SSL-sulfietderivaat, en ten derde resulteert de verwijdering van de sulfonaatgroep door behandeling met een alkali in een SSL-residu.

Vervolgens wordt de doelregio geamplificeerd met bisulfietconversie-specifieke primers en PCR-amplificatie. De laatste stap is het kloneren en sequensen van het PCR-product om resolutie op enkel-nucleotide niveau te verkrijgen voor methylering over het DNA-molecuul. Uiteindelijk tonen de resultaten DNA-methylering van CpG-dinucleotiden in genomisch DNA aan door gebruik te maken van de verhoogde gevoeligheid van cytosine ten opzichte van 5-methylcytosine voor bisulfiet-deaminering onder zure omstandigheden.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals Southern-bloedanalyse, is dat deze resolutie op één nucleotide voor d-methylering mogelijk maakt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de epigenetica, zoals de rol van DNA-methylering bij menselijke ziekten zoals kanker. Om DNA-monsters voor te bereiden op bisulfietconversie, wordt eerst 2 µg genomisch DNA gedurende één uur bij 37 °C geïncubeerd met bisulfiet en DNA-lysisbuffer tot een totaal volume van 18 µL.

Denatureer vervolgens het genomische DNA door twee microliter vers bereide drie molaire natriumhydroxide toe te voegen tot een eindconcentratie van 0,3 molair. Incubeer de monsters 15 minuten bij 37 °C in een waterbad, gevolgd door incubatie bij 90 °C gedurende twee minuten. Plaats de buisjes na het gebruik van een heatblock onmiddellijk vijf minuten op ijs en centrifugeer de buisjes 10 seconden bij 10.000 Gs om te garanderen dat het DNA zich onderin de buis bevindt; de gedenatureerde DNA-monsters zijn nu klaar voor B-cel fight-deaminatie, wat in de volgende stap zal worden gedemonstreerd.

Bereid vóór de sulfatatie- en hydrolytische deamineringsreacties verse oplossingen voor van 10 millimolaire quinol en verzadigd natriumbisulfiet bij pH 5,0. Aangezien het natriumbisulfiet een verzadigde oplossing is, kunnen er kleine onopgeloste klontjes achterblijven. Voeg 208 µL natriumbisulfiet en 12 µL quinol toe aan 20 µL gedenatureerd DNA voor een eindvolume van 240 µL.

Vortex de buisjes en centrifugeer deze 10 seconden om ervoor te zorgen dat alle druppels zich onderin het buisje bevinden. Bedek de monsters met minerale olie. Incubeer de monsters gedurende vier tot 16 uur in een waterbad bij 55 °C, afhankelijk van de hoeveelheid en kwaliteit van het te converteren DNA.

Het is belangrijk dat de bisulfietconversie in het donker plaatsvindt om oxidatie te voorkomen. Centrifugeer de buisjes na de juiste incubatietijd kort in een microcentrifuge om ervoor te zorgen dat alle vloeistof zich onderin de buis bevindt. Pipetteer vervolgens voorzichtig de DNA-oplossing van de bodem van de buis, zonder mineraalolie op te nemen.

Voor de volgende stappen gebruikt ons laboratorium het Promega Wizard DNA Cleanup-systeem. Voeg één milliliter hars toe aan de DNA-monsters, keer de buis om om te mengen en pipetteer de oplossing vervolgens in een spuit die is bevestigd aan een ontzoutingskolom. Om tenslotte eventuele vrije bisulfiet-ionen te verwijderen, wordt het met bisulfiet behandelde DNA door de ontzoutingskolom geleid en opgelost in 50 µL Milli Q-water.

De volgende stap is het verwijderen van de bisulfiet-adducten uit de uracilring door middel van desalineren. Voeg hiervoor 5,5 µL vers bereide 3 M natriumhydroxide toe aan elk bisulfietbehandeld DNA-monster voor een uiteindelijke concentratie van 0,3 M. Incubeer de monsters vervolgens 15 minuten bij 37 °C.

Centrifugeer de monsters kort en voeg vervolgens één µL TRNA toe aan elk monster. Neutraliseer de oplossing door ammoniumacetaat toe te voegen tot een eindconcentratie van 3 M. Precipiteer vervolgens het DNA met ethanol.

Voeg 330 µL ijskoude, 100% ethanol toe en meng goed door omkering. Bewaar één uur tot een nacht bij -20 °C en centrifugeer vervolgens 15 minuten bij 14.000 ×g bij 4 °C. Verwijder daarna alle sporen van het supernatant en laat het neergeslagen DNA ongeveer 20 minuten aan de lucht drogen.

Na het luchtdrogen is het pellet bijna onzichtbaar; resuspendeer het DNA-pellet in 50 µL 0,1 XTE of water en laat dit ongeveer twee uur bij kamertemperatuur staan. Vortex de buisjes gedurende deze tijd af en toe om er zeker van te zijn dat het DNA is opgelost, gevolgd door een korte centrifugatie. Zodra het DNA is opgelost, kan het één tot 10 jaar bij -20 °C worden bewaard, afhankelijk van de hoeveelheid en kwaliteit van het DNA, of direct worden gebruikt. Voor PCR-amplificatie is de optimalisatie van de primers het meest uitdagende aspect van deze procedure.

Daarom worden de volgende richtlijnen gegeven om het succes van het primerontwerp te waarborgen. Om deze richtlijnen te illustreren, is de doelsequentie met sulfiet omgezet, zodat bij het uitschrijven omgezette cytosines verschijnen als blauwe Ts en niet-omgezette CPG-sites verschijnen als rode cgs. Primers moeten 24 tot 30 basenparen lang zijn om de specificiteit te garanderen. Primers moeten een vergelijkbare voorspelde TM boven de 50 °C hebben en niet meer dan één tot twee °C van elkaar verschillen.

Primers moeten meerdere bases bevatten met ongeveer 25% C naar T om de conversiespecificiteit te waarborgen. De laatste base aan het 3'-uiteinde moet een C naar T zijn. Om potentiële bias ten opzichte van gemethyleerde, ongemethyleerde of niet-geconverteerde templates te voorkomen, moeten D-N-A-C-P-G dinucleotiden in de primersequentie worden vermeden. Indien dit echter onvermijdelijk is, moet de cytosine in de CpG-site worden vervangen door een Y om een onbevooroordeelde amplificatie van geconverteerd DNA te helpen waarborgen.

Ontwerp sluttenest of semi-geneste primer-sets om, indien vereist, de specificiteit of sensitiviteit van de PCR-reactie te waarborgen. Bereid PCR-amplificatiereactiemengsels voor in aliquots van 25 µL voor optimalisatie. Elke reactie bevat door sulfiet omgezet genomisch DNA, DPS-primers, magnesiumchloride, kaliumchloride, tris-hydrochloride pH 8.3 en polymerase om te testen op amplificatiebias van gemethyleerd of ongemethyleerd materiaal.

Gebruik een controlemonster dat voor 50% gemethyleerd en voor 50% ongemethyleerd is en volledig is omgezet met bisulfiet om de proportionele PCR-amplificatie na bisulfietconversie te testen. Gebruik specifieke primers en een PCR-reactiemengsel in een thermocycler met temperatuurgradiënt; stel de reactie in met een gradiënt van plus of min 3 °C ten opzichte van de TM van de primer over acht tot 10 buisjes, vortex de buisjes en centrifugeer ze kort in een microcentrifuge voordat u ze in de thermocycler plaatst. Deze figuur toont een agarosegel met een temperatuurgradiënt PCR-amplificatieprofiel van een mengsel van 50% gemethyleerd en ongemethyleerd DNA.

De PCR-amplicons en de banen gemarkeerd met T (baan twee, vijf en acht) zijn behandeld met een restrictie-enzym dat uitsluitend gemethyleerd DNA zal splitsen; optimale PCR-amplificatiecondities zouden gemethyleerde en ongemethyleerde amplicons proportioneel en zonder bias moeten amplificeren, wat resulteert in een gelijke hoeveelheid gesplitst en ongesplitst PCR-product, zoals hier te zien is. De optimale thermocyclingcondities voor niet-bevooroordeelde amplificatie liggen op 55,6 °C. Volledige conversie van het bisulfiet-DNA kan worden geanalyseerd door digestie met een cytosine-site-specifiek enzym dat uitsluitend niet-geconverteerd DNA zal splitsen in banen drie, zes en negen.

Volledige bisulfiet-DNA-conversie wordt hier aangetoond door de afwezigheid van geknipt DNA in alle drie de banen, baan drie, zes en negen. Deze real-time dissociatiegrafiek toont een gelijke proportie gemethyleerd en ongemethyleerd DNA (rode oranje lijn, 50/50 mix) vergeleken met de amplificatie van volledig gemethyleerd DNA (roze lijn m) en ongemethyleerd DNA (groene lijn U), die respectively dissociëren bij 82,9 °C en 86,9 °C. Dit geeft aan dat er geen amplificatiebias is op basis van de temperatuur waarbij de verschillende moleculen dissociëren.

De resulterende PCR-fragmenten uit de amplificatie van bisulfitbehandelde monsters kunnen worden gevisualiseerd via agarosegelelektroforese en gesequenced worden. Hier wordt direct een sequence-trace getoond van drie verschillende cellijnen waarbij de CpG-sites geel gemarkeerd zijn; cellijn X vertoont 100% methylering op alle drie de CpG-sites, terwijl cellijnen Y en Z variërende graden van methylering vertonen, zoals blijkt uit de hier getoonde overlappende GA-signalen. Figuur 4A is een sequence-trace van drie verschillende cellijnen met geel gemarkeerde CpG-sites.

Na directe sequencing van individuele klonen kan de methylatiestatus van de individuele moleculen worden weergegeven in een bisulfietkaart. Om de heterogeniteit van de methylatie te visualiseren, wordt de methylatiedichtheid bij individuele CpG-sites in het rood weergegeven. In deze representatieve bisulfietkaart is een high-throughput kwantitatieve methylatieanalyse van een monster te zien.

Het gebruik van sequenome epi typer-technologie kan een specifiek spectrum produceren dat afhankelijk is van de aanwezigheid van gemethyleerde cytosines, zoals getoond in dit voorbeeld in figuur vijf A. Een samenvatting van de ratio's in het monster kan vervolgens worden geëxtrapoleerd in de vorm van een epigram in figuur vijf B. Dit voorbeeld toont het percentage DNA-methylering bij elke CpG-site voor vier verschillende cellijnen. Ten slotte kan, na de ontwikkeling daarvan, een samenvattend methyleringsplot in figuur vijf C worden afgeleid uit het epigram. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de epigenetica om DNA-methylering en de rol daarvan bij menselijke ziekten te onderzoeken.