Single Cell Fate Mapping in de zebravis
5 oktober 2011
Een methode wordt beschreven om enkele cellen met een gekooide fluorescerend eiwit met behulp van twee-foton absorptie van een Ti photoactivate: Sapphire femtoseconde laser oscillator. Het lot kaart brengen van de gefotoactiveerd cel, wordt immunohistochemie gebruikt. Deze techniek kan worden toegepast op elk celtype.
Het algemene doel van het volgende experiment is om fate mapping en lijnage tracing uit te voeren van geselecteerde enkele cellen in zebravis-embryo's. Dit wordt bereikt door middel van chemische conjugatie van verkapte fluoresceïne aan dextran met een hoog moleculair gewicht. Vervolgens wordt de voorbereide verkapte fluoresceïne dextran micro geïnjecteerd in zebravis-embryo's, die vervolgens wordt foto geactiveerd in geselecteerde cellen door middel van twee-foton absorptie.
Na foto activering van de embryo's wordt immunohistochemische analyse uitgevoerd om de ontkapte fluoresceïne dextran te detecteren om de geactiveerde cellen te fate mappen. Uiteindelijk kan deze methode worden gebruikt om de lijnage bijdrage en weefsel lokalisatie van de foto geactiveerde enkele cellen te bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals standaard fluorescentiemicroscopie, is dat het kan worden gebruikt om enkele cellen differentieel te labelen voor faith mapping.
Deze methode kan ons helpen om belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie te beantwoorden, zoals hoe ongedifferentieerde voorlopercellen kunnen bijdragen aan verschillende weefseltypen. Visuele demonstratie is cruciaal omdat de embryo mounting en foto activeringsstappen moeilijk te leren zijn op basis van eenenkele tekstbeschrijving. Voordat u begint, synthetiseert u verkapte fluoresceïne dextran en bewaart deze in met metaalfolie bedekte buizen. Injecteer vervolgens embryo's in het stadium van één tot twee cellen met het gesynthetiseerde verkapte fluoresceïne dextran.
Nadat de embryo's het juiste ontwikkelingsstadium hebben bereikt, coateert u ze. Monteer vervolgens de gecoate embryo's in lage smeltende aeros Voor foto activering. Wanneer de aeros is gestold, laadt u de LSM vijf 10-software.
Plaats een transparante gele filter in de witte lichtbundel en selecteer vervolgens scan nieuwe afbeelding en klik op start deskundige modus. Selecteer het laser tabblad, zet de argon iron en de mi tai laserbronnen aan. Stel de mi tai golflengte in op zeven 40 nanometer.
Selecteer vervolgens het config tabblad. Stel de optische pad configuraties in voor de argonne ion en de mi tai laser. Selecteer vervolgens het scan tabblad.
Verander het objectief in 20 keer 0,8. Stel de maximale scan snelheid in door te klikken op max set mode methode en nummer om respectievelijk lijnengemiddelde en een te selecteren onder het kanalen tabblad. Schakel alle laserbronnen uit behalve de mi tai. Plaats vervolgens een vermogensmeter in de optische straalbundel en selecteer vervolgens de con-knop om continu scannen te activeren.
Stel het transmissiepercentage af totdat de vermogensmeter een gemiddeld laservermogen van 47 milliwatt leest. Stop vervolgens de scan door de stop knop te selecteren onder het kanalen tabblad. Schakel de mi tai laserbron uit en selecteer de argon iron.
Selecteer vervolgens de snelle XY-knop opnieuw onder het kanalen tabblad, pas de pin hole aan. Detecteer versterking, versterk a en offset en versterk opnieuw voor de Argonne iron laser om de beste beeldkwaliteit te bereiken. Gebruik de stage controller om de cel te vinden en scherp te stellen die moet worden geactiveerd, klik vervolgens op de stop knop. Gebruik het cropgereedschap om de geactiveerde cel bij te snijden zodat de crop factor onder het mode tabblad 50 tot 70 weergeeft.
Stop vervolgens de scan door de stop knop te selecteren onder het kanalen tabblad. Schakel de argonne ion laser uit en selecteer de My Tai laser onder het mode tabblad. Stel de scansnelheid in op 31,46 seconden.
Selecteer vervolgens de enkele knop om de scan te starten voor de tweefoton activering van de verkapte fluoresceïne dextran van de geselecteerde cel. Na activering, ga naar het kanalen tabblad en deselecteer nu de mi tai laser en selecteer de argon ion laser opnieuw. Zet vervolgens onder mode de zoomfactor op een.Volgende.
Onder de snelheidskop, klik op de max-knop om de snelste scansnelheid in te stellen. Om het foto geactiveerde gebied te bekijken, selecteert u snel xy. Selecteer vervolgens het kanalen tabblad en pas de pin hole en detecteer opnieuw aan, controleer of het foto geactiveerde gebied niet door laser is geablateerd.
Nadat u de foto geactiveerde embryo's hebt voorbereid voor immuno detectie van ontkapte fluoresceïne dextran door het protocol in de bijbehorende handleiding te volgen. Was de embryo's zes keer in PBT en twee keer in AP-buffer. Breng de embryo's vervolgens over naar negen welborden in AP-buffer.
Zuig vervolgens de AP-buffer op en voeg N-B-T-B-C-I-P toe. Stop de N-B-T-B-C-I-P kleuringsontwikkeling door de N-B-T-B-C-I-P oplossing af te zuigen. Was vervolgens de embryo's in PBT.
Herstel nu de embryo's en schud ze vijf minuten op een roterend platform op kamertemperatuur. Herhaal vervolgens het wassen van PBT nog twee keer. Monteer ten slotte de embryo's in 0,6% lage smeltende aros en verzamel afbeeldingen van de foto geactiveerde cellen met behulp van een rechtopstaande compound microscoop.
In deze figuur wordt een brightfield-afbeelding getoond links en een fluorescentiebeeld rechts van een verkapte fluoresceïne dex-streng micro-geïnjecteerd zebravis-embryo vóór foto activering. Zoals hier getoond, is het embryo gefoto activeerd in een van de somiten die wordt aangegeven door de pijl in de brightfield-figuur links met een golflengte van zeven 40 nanometer, een scantijd van 31 seconden en een gemiddeld laservermogen van 47 milliwatt. In de figuur rechts na foto activering kan fluorescentie van de ontkapte fluoresceïne dextran worden waargenomen in deze figuur.
Immuunkleuring van ontkapte fluoresceïne dextran wordt afgebeeld in een klein gebied in de laterale plaat, mesoderm van een 10. So mite-stadium embryo werd gefoto activeerd met behulp van dezelfde laserparameters als in de vorige figuur met behulp van de immunodetectieprocedure. Het geactiveerde gebied, zoals hier aangegeven door de pijl, kan worden geïdentificeerd met minimale achtergrondkleuring. Volgend deze procedure.
Aanvullende analyse, zoals immunokleuring voor verschillende weefselspecifieke markers, kan worden uitgevoerd om de locatie en het lot van ge
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het fotoactiveren van individuele cellen in zebravisembryo's met behulp van tweefotonabsorptie. De techniek maakt fate mapping van de geactiveerde cellen mogelijk via immunohistochemie, wat toepasbaar is op diverse celtypen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Fate mapping en lineage tracing zijn cruciaal voor het begrijpen van ontwikkelingsprocessen.
- Caged fluorescerende eiwitten maken gerichte activatie van specifieke cellen mogelijk.
- Tweefotonabsorptie biedt een precieze methode voor fotoactivatie.
- Deze techniek kan individuele cellen differentiëren voor gedetailleerde analyse.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor lineage tracing in zebravisembryo's.
- Om het begrip van de bijdrage van precursorcellen aan weefseltypen te vergroten.
- Om een visuele demonstratie van complexe procedures te bieden.
Gebruikte methoden
- Synthese van gecaged fluoresceïne-dextran voor micro-injectie.
- Fotoactivatie van geïnjecteerde embryo's met behulp van een Ti:Sapphire-laser.
- Immunohistochemische analyse om ongecaged fluoresceïne-dextran te detecteren.
- Beeldacquisitie met behulp van een rechtopstaande compoundmicroscoop.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle fotoactivatie van individuele cellen in zebravissenembryo's.
- Visuele bevestiging van lineage tracing via fluorescentiebeeldvorming.
- Demonstratie van minimale achtergrondkleuring bij immunodetectie.
- Potentieel voor verdere analyse met weefselspecifieke markers.
Conclusies
- Deze methode bevordert het onderzoek in de vasculaire biologie en ontwikkelingsstudies.
- Het maakt een gedetailleerd onderzoek van de cellinie en weefsellokalisatie mogelijk.
- Veiligheidsvoorschriften zijn essentieel bij het omgaan met chemische reagentia.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Single-cell fate mapping in zebravisjes met behulp van tweefoton-fotoactivatie en immunohistochemie maakt nauwkeurige lineage tracing van ongedifferentieerde precursorcellen mogelijk. Deze mogelijkheid is essentieel voor het verminderen van risico's bij vroege ontdekkingshypotheses en het verduidelijken van ontwikkelingspaden die relevant zijn voor de hematopoëtische en vasculaire biologie. De methode ondersteunt voorspellend vertrouwen op cruciale buigpunten bij beslissingen over portfolio's in de ontdekkingsfase.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om hypothesen over ontwikkelingslijnen te onderzoeken met een resolutie op enkelcelniveau.
- Ondersteunt functionele validatie van targets door de bijdragen van precursorcellen aan specifieke weefsels in kaart te brengen.
- Faciliteert mechanische risicoreductie van kandidaat-signaalpaden in ziekterelateerde systemen.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows voor fenotypische screening.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve single-cell labeling voor assay-standaardisatie.
- Maakt betrouwbare evaluatie van lineage-specifieke effecten bij compound-screening mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt ontwikkelingslijn-tracing uit met de ontdekking van translationele biomarkers in vasculaire en hematopoëtische modellen.
- Biedt continuïteit van vroege ontdekking tot preklinische validatie van celbestemming en weefsellokalisatie.
- Vermindert biologische ambiguïteit bij risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothese-testen tot lead-identificatie en preklinische modelvalidatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het testen van nulhypothesen en de verduidelijking van signaalpaden door nauwkeurige fate mapping van individuele cellen mogelijk te maken.
- Screening: Biedt reproduceerbare single-cell labelering die direct klaar is voor gebruik in assays voor downstream workflows.
- Analytica: Genereert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste read-outs voor comparatieve analyse van lineage-bijdragen.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinisch onderzoek door cellot-data af te stemmen op ziekte-relevante biomarkers.
- Enterprise-hergebruik: Biedt een veelzijdige, model-agnostische capaciteit voor lineage tracing over diverse biologische systemen heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert single-cell labeling en detectie voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door lineage-relaties in een vroeg stadium te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering en verdere ontwikkeling van assets in de ontdekkingsfase mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in micro-injectie, twee-fotonenmicroscopie en immunohistochemie.
- Afhankelijk van toegang tot confocale microscopen uitgerust met femtoseconde-lasers en beeldvormingsinfrastructuur.
- Vereist standaardisatie van fotoactivatie- en detectieprotocollen tussen teams.
- Aanpasbaar aan andere modelsystemen met een passende optimalisatie van de labelings- en detectiestappen.
- Foto-efficiëntie en detectiegevoeligheid kunnen de langetermijntracking in sommige contexten beperken.
