Patroonvorming van embryonale stamcellen Met behulp van de Bio Flip Chip
1 oktober 2007
Demonstreren we een eenvoudige methode voor het plaatsen van cellen op de gewenste locaties op een substraat. Deze methode patronen cellen door het opgooien van een siliconen chip met microwells gevuld met cellen op de ondergrond. Deze methode biedt een nieuwe manier te moduleren diffundeerbare en juxtacrine signalering tussen cellen.
Ik ben nickel Mital, een promovendus in het Bowman-lab. Vandaag ga ik spreken over een apparaat dat is ontwikkeld door twee voormalige studenten in ons lab, genaamd de bio flip chip.
Dit apparaat maakt het mogelijk om cellen op een substraat naar keuze van de onderzoeker af te leveren in een configuratie naar keuze van de onderzoeker. Het apparaat zelf, we hebben er hier een, is zeer eenvoudig. Het bestaat in feite uit kleine putjes in een stuk silicone.
Elke put is gewoonlijk zo ontworpen dat er slechts één cel in past, maar indien nodig kunnen we deze uiteraard groter maken. De vervaardiging van het apparaat is zo uitgevoerd dat de putten in dezelfde configuratie staan als waarin de cellen uiteindelijk op het substraat terechtkomen. Het apparaat zelf wordt daarom vervaardigd middels zachte lithografie.
In het bijzonder gebruiken we PDMS, wat poly dimethylsiloxaan is, en gieten we dit af van een siliciumwafer. We hebben er hier één. De mal-wafer zelf is gemaakt met standaard fotolithografie om een SU-8 fotolak te patroneren, die op de siliciumwafer is gesponnen.
Kortom, cellen worden overgebracht naar het gekozen substraat door de putjes op de bio-flipchip in wezen te vullen met deze cellen. Vervolgens brengen we de chip aan op het gekozen substraat, vaak een weefselkweekschijf van polystyreen. Ten slotte draaien we de combinatie om, waardoor de cellen uit de putjes op het substraat vallen.
Ik ben Stephanie Flavin. Ik ben een onderzoeker in mijn bacheloropleiding hier in het Goldman-lab, en vandaag zal ik laten zien hoe u de bio flip chip gebruikt om cellen de dag ervoor te patroneren. We willen een patroonexperiment uitvoeren.
We zullen de PDMS via plasmabonding bevestigen aan een glazen objectglas van één bij één inch. Vervolgens weken we de chip een nacht lang met de welzijde naar beneden in een PBS-oplossing. We zullen ook pakkingen snijden voor gebruik in het patroonexperiment en binder clips verzamelen die ebenfalls gebruikt zullen worden.
Breng 200 µL BSA aan op het oppervlak van elke chip. Schud het oppervlak van de chip met de pipetpunt om luchtbellen te verwijderen en laat de BSA-oplossing de putjes vullen. Laat de chips gedurende één uur onder de zu%)kap staan in de UV-lichtpassagecellen zoals gebruikelijk.
Zuig na één uur de BSA-oplossing van de chips af en spoel elke chip met 200 µL PBS. Breng 200 µL cellenoplossing aan met een dichtheid van 10⁶ cellen per ml. Nadat er vijf tot 10 minuten is gewacht tot de cellen in de putjes zijn gezakt, wordt het oppervlak van de chip gespoeld met PBS. Kantel de chip naar één hoek onder een hoek van ongeveer 15 graden en pipetteer de cellenoplossing langzaam af vanuit de onderste hoek van de chip.
Breng de chip terug in een horizontale positie en voeg langzaam 50 µL PBS toe aan de bovenhoek. Herhaal de wasstap indien nodig meerdere keren. Zodra de xls van het chipoppervlak zijn gewassen, voegt u ongeveer 50 µL medium toe aan de binnenste pakking van het schaaltje.
Voeg medium toe aan de bovenkant van elke chip. Keer vervolgens de schaal om en kantel deze terwijl u deze op het oppervlak van de chip plaatst, beginnend bij één hoek. Platte de schaal vervolgens op de chip om de vorming van luchtbellen tussen de schaal en de chip te voorkomen.
Bevestig aan elke zijde van de chip binder clips om deze op zijn plaats te houden. Verwijder de handvatten van elke binder clip, zodat de chip vlak op de schaal ligt wanneer deze wordt omgedraaid. Verplaats de chip naar de incubator en draai deze snel om, waarbij alle onnodige bewegingen worden vermeden.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe methode voor het positioneren van cellen op een substraat met behulp van een apparaat dat de bio flip chip wordt genoemd. Door een siliconen chip met microwells gevuld met cellen op het substraat te keren, kunnen onderzoekers de plaatsing van cellen effectief beheersen, waardoor de modulatie van signalering tussen cellen wordt verbeterd.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
- Bioengineering
Achtergrond
- De positionering van cellen is cruciaal voor het bestuderen van cellulaire interacties.
- Huidige methoden kunnen tekortschieten in de precisie van de celplaatsing.
- De bio flip chip biedt een eenvoudige en effectieve oplossing.
- Deze techniek kan zowel diffuse als juxtacrine signalering beïnvloeden.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor de plaatsing van cellen op substraten.
- Om het begrip van cel-signaleringsmechanismen te verbeteren.
- Om een hulpmiddel te bieden aan onderzoekers in diverse biologische velden.
Gebruikte methoden
- Ontwerp en fabricage van de bio flip chip.
- Vullen van de microwells met cellen.
- Omkeren van de chip op het gewenste substraat.
- Observeren en analyseren van celplaatsing en signalering.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle plaatsing van cellen op de beoogde locaties.
- Verbeterde modulatie van cel-signalering.
- Demonstratie van het gebruiksgemak van het apparaat.
- Potentiële toepassingen in verschillende experimentele opstellingen.
Conclusies
- De bio flip chip is een innovatief instrument voor celplaatsing.
- Deze methode kan een aanzienlijke impact hebben op studies naar cellulaire signalering.
- Toekomstig onderzoek kan deze techniek verder uitbreiden voor bredere toepassingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Precieze ruimtelijke controle over celpopulaties maakt mechanische ondervraging mogelijk van diffuseerbare en juxtacriene signaleringspaden, die cruciaal zijn voor targetvalidatie in op stamcellen gebaseerde ziektemodellen. De Bio Flip Chip biedt een substraat-onafhankelijke, chemie-behoudende methode om gedefinieerde cellulaire micro-omgevingen te patroonvormen, wat reproduceerbare assayontwikkeling voor fenotypische screening ondersteunt. Deze aanpak verhoogt het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door variabiliteit in cel-celcontact en blootstelling aan paracriene factoren te verminderen, waardoor de translationele continuïteit van in vitro modellen naar preklinische validatie wordt verbeterd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt hypothesetoetsing mogelijk over hoe lokale celdichtheid en ruimtelijke rangschikking de differentiatie van stamcellen en zelfvernieuwingspaden beïnvloeden.
- Operationele waarde: Elimineert stochastische variabiliteit door willekeurige uitplating, waardoor consistente juxtacriene en paracriene signaleringsinputs over replica's heen worden gegarandeerd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanische risicoreductie door de bijdrage van contactafhankelijke versus oplosbare signalering in studies naar target-engagement te isoleren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare, ruimtelijk gedefinieerde celarrays die compatibel zijn met high-content imaging en gemultiplexte read-outs.
- Operationele waarde: Maakt standaardisatie van assays voor cel-celinteracties mogelijk op polystyreen voor weefselkweek, glas, Matrigel en feederlagen zonder de chemie van het substraat te wijzigen.
- Schaalbaarheid: Compatibel met microcontact-printen voor het creëren van patronen van de extracellulaire matrix, wat combinatorische controle over adhesie- en signaleringsprikkels mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Patroneert embryonale stamcellen in gedefinieerde niches om ontwikkelingssignaleringspaden te modelleren die relevant zijn voor congenitale aandoeningen en regeneratieve geneeskunde.
- Preklinische modellering: Faciliteert dosis-responsanalyses van morfogenen of therapeutica in ruimtelijk gecontroleerde micro-omgevingen, waardoor de fysiologische relevantie wordt verbeterd.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Vermindert fout-positieven bij de identificatie van lead-verbindingen door ruis vanuit ongecontroleerde celaggregatie of variabele contactfrequentie te minimaliseren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De Bio Flip Chip integreert in vroege discovery-workflows door reproduceerbare patroonvorming van stamcellen mogelijk te maken voorafgaand aan blootstelling aan verbindingen, wat hypothese-gestuurde screening en mechanische follow-up bij lead-optimalisatie ondersteunt.
- Discovery Biology: Onderzoekt hoe de gedefinieerde ruimtelijke organisatie van embryonale stamcellen de lineage-specificatie en padactiviteit moduleert.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare cellulaire substraten voor het evalueren van effecten van verbindingen op contactafhankelijke en diffuse signalering.
- Analytics: Maakt kwantitatieve ruimtelijke mapping mogelijk van marker-expressie, proliferatie en apoptose als afhankelijke variabelen in gepatroneerde co-culturen.
- Translational Research: Modelleert menselijke ontwikkelingssignaleringscascades in ruimtelijk gecontroleerde systemen om de preklinische targetselectie te informeren.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een modulair patroonplatform dat aanpasbaar is aan meerdere celtypen, substraten en extracellulaire matrixconfiguraties over verschillende projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in target-validatie door biologische ruis van ongecontroleerde cel-celinteracties te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert de reproduceerbaarheid van assays door nauwkeurige, door de gebruiker gedefinieerde celplaatsing, onafhankelijk van variabiliteit in de zaaitechniek.
- Strategische waarde: Verbetert de efficiëntie van go/no-go-beslissingen door de signaal-ruisverhouding te optimaliseren in fenotypische screens die gericht zijn op intercellulaire communicatie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van modulatoren van juxtacriene pathways (bijv. Notch, Wnt) in ziektegebieden die worden gemedieerd door stamcellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in zachte lithografie en de omgang met PDMS voor de fabricage of aanschaf van chips.
- Afhankelijk van toegang tot plasma-bondingsapparatuur en UV/ozon-behandeling voor de preparatie van het substraat.
- Vereist gestandaardiseerde celpreparatie- en wasprotocollen om een efficiënte belading en vrijgave van de wells te waarborgen.
- Aanpassing aan 3D-matrices of microfluïdische systemen kan optimalisatie van de timing van het omdraaien (flip timing) en de oppervlakte-energie vereisen.
- Praktische beperking: De bezettingsgraad van de wells moet empirisch worden bepaald voor elk celtype en elke celgrootte om te voorkomen dat meerdere cellen in wells worden geladen die ontworpen zijn voor enkele cellen.
