Cut-loading: Een handig hulpmiddel is voor de behandeling van de omvang van Gap Junction Tracer koppeling tussen het netvlies Neuronen
12 januari 2012
Een eenvoudige en handige methode om de mate van gap junction tracer koppeling tussen het netvlies neuronen te bepalen is beschreven. Deze techniek laat toe om de functie van de elektrische synapsen tussen neuronen in de retina intact te onderzoeken onder verschillende belichting omstandigheden en op verschillende tijdstippen van de dag en nacht.
Het algemene doel van het volgende cut loading-experiment is om de mate van tracerkoppeling van gap junctions tussen neuronen in de intacte retina onder gecontroleerde verlichtingsomstandigheden te onderzoeken. De eerste stap wordt bereikt door retina's te snijden met een scherp mes gedoopt in een oplossing van neuro biotin, een tracermolecuul dat kan diffunderen door open gap junction-kanalen, maar niet door celmembranen. In de tweede stap worden de retina's geïncubeerd in ringer's oplossing, wat tracerdiffusie door open gap junction-kanalen mogelijk maakt.
Als de gap junction-koppeling zwak is, zal neuro biotin-fluorescentie beperkt zijn tot retinale neuronen die dichtbij de snede liggen. Als de gap junction-koppeling daarentegen sterk is, zal de fluorescentie worden gedetecteerd in retinale neuronen ver van de snede. Het belangrijkste voordeel van cut loading boven bestaande technieken is dat het gemakkelijker is uit te voeren op neuronen met kleine cellichamen in intact weefsel van de neurale retina.
Het is ook gemakkelijker om de verlichtingsomstandigheden tijdens cut loading te controleren dan tijdens een elektrofysiologisch onderzoek van enkele neuronen in intact retinaweefsel. Omdat de lichtstimuli die worden gebruikt tijdens elektrische opname zelf kunnen leiden tot veranderingen in gap junction-koppeling, zal deze techniek worden gedemonstreerd door Dr. Chu Choi, een postdoc uit mijn laboratorium. Bij deze procedure wordt een goudvis minimaal een uur vóór de operatie in constante duisternis gehouden en worden alle volgende stappen totdat het retinale weefsel is gefixeerd, ook overdag in constante duisternis uitgevoerd. Diep anesthesieëren van de goudvis door 150 milligram per liter methaan sulfonaat toe te voegen aan het aquariumwater.
Vervolgens wordt de goudvis geofferd volgens federale en universitaire richtlijnen en worden de oogbollen voorzichtig verwijderd. Vervolgens wordt het voorste gedeelte van elke oogbol verwijderd. Plaats vervolgens een stuk filterpapier op de achterste gedeelte van het oog en draai het filterpapier en het oog om zodat het filterpapier onder het achterste gedeelte van het oog komt te liggen.
Verwijder nu voorzichtig de achterkant van het oog, inclusief de sclera en het pigmentepitheel van de in het donker aangepaste goudvis. Snijd de zenuw van de retina door met een stel fijne schaar. De neurale goudvis, met de fotoreceptorzijde omhoog, moet nu worden bevestigd aan het filterpapier vóór enucleatie, terwijl de vis onder narcose ligt bij vijf milliliter oxygeen op basis van koolzuur op basis van ringer-oplossing met of zonder testgeneesmiddel naar elke put van een zes puttenplaat na het dissecteren van de intacte neurale retina uit het achterste gedeelte van het oog.
Breng de retina's over naar de putten tijdens constante duisternis. Vervolgens worden de putten verzegeld met paraform en laat het weefsel 30 minuten incuberen. Bereid 100 microliters traceroplossing door 0,5% neuro biotin op te lossen in ringer-oplossing onmiddellijk vóór het snijden door de retina.
Voeg vervolgens de neuro biotin-oplossing toe aan een glazen petrischaal. Tik vervolgens voorzichtig op het filterpapier waaraan de retina is bevestigd op een papieren handdoek. Om overtollig ringer te verwijderen, dompelt u een scheermesje in de neuro biotin-oplossing en maakt u een loodrechte radiale snede door de retina en het filterpapier.
Dompel vervolgens het scheermesje opnieuw in de neuro biotin-oplossing en snijd de retina een tweede keer. Herhaal dit tot vier sneden per retina. Bij deze stap wordt de retina overgebracht naar verse ringer, medium met of zonder testgeneesmiddel gedurende 15 minuten om lading en diffusie mogelijk te maken.
Was het drie keer met verse ringer, medium met of zonder testgeneesmiddel gedurende vijf minuten per keer. Fixeer vervolgens de retina met 4% para formaldehyde in 0,1 molaire fosfaatbufferoplossing op kamertemperatuur gedurende één uur. Was vervolgens de retina gedurende één nacht met 0,1 molair PBS bij vier graden Celsius door het in de koelkast te plaatsen op de volgende dag.
Reageer de retina met 2% streptavidin Alexa 4 88 in 0,1 molair PBS en 0,3% Triton X 100 tot een eindconcentratie van 10 microgram per milliliter en incubeer deze gedurende één nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag. Was de retina drie keer met 0,1 molair PBS bij kamertemperatuur elke keer gedurende 10 minuten.
Los de retina los van het filterpapier in PBS. Monteer vervolgens de retina met de fotoreceptorzijde omhoog op een dia met vector shield montagemedium met behulp van een fijne borstel. Breng de dia over naar een laserscanningconfocale microscoop en maak foto's bij dezelfde vergroting, resolutie en instellingen voor elke experimentele conditie, zodat vergelijkingen van de effecten van verschillende experimentele omstandigheden op de mate van functionele tracerkoppeling van gap kunnen worden gemaakt.
Hier is de mate van fotoreceptorceltracerkoppeling overdag in constante duisternis vergeleken met overdag in constante duisternis in aanwezigheid van een selectieve dopamine D twee receptorantagonist. Merk op dat de scheermesjesnede in beide afbeeldingen aan de linkerkant staat. Hoewel een enkele afbeelding alle gelabelde cellen kan bevatten, wordt aanbevolen om een Z-stack van het gebied van belang te verzamelen en deze samen te vouwen tot een enkele afbeelding.
Hier is de mate van fotoreceptorceltracerkoppeling terwijl men sequentieel door zo'n Zack beweegt. Merk op dat de scheermesjesnede in deze afbeelding aan de rechterkant staat. Om de mate van tracerkoppeling in de LSM-beeldbrowser te kwantificeren, opent u het beeld, klikt u op export en slaat u de afbeelding op als een TIF 16-bits niet-gecomprimeerd bestand. De schaalbalk moet in dit TIFF-beeld worden opgenomen met behulp van NIH Image J-software.
Meet de fluorescentie-intensiteit van Alexa 4 88-gelabeld neuro biotin vanaf afbeeldingen met lage vergroting van gatmontageretina's. Open het TIFF-bestand met behulp van Image J-software en teken vervolgens een rechte lijn die overeenkomt met de schaalbalk. Ga vervolgens naar analyseren, schaal instellen en voer de bekende afstand en lengte-eenheid in.
Klik vervolgens op OK. Nu kunnen de fluorescentiemetingen worden gepresenteerd in gekalibreerde eenheden zoals millimeters. Selecteer ver
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het bepalen van de mate van gap junction-tracerkoppeling tussen retina-neuronen. De techniek maakt het mogelijk om elektrische synapsen in de intacte retina te onderzoeken onder verschillende belichtingsomstandigheden.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Retinale biologie
- Cellulaire communicatie
Achtergrond
- Gap junctions faciliteren de communicatie tussen neuronen.
- Inzicht in tracerkoppeling kan onthullingen verschaffen over de neuronale functie.
- Bestaande methoden kunnen uitdagend zijn voor kleine cellichamen in intacte weefsels.
- Verlichtingsomstandigheden kunnen de koppeling via gap junctions beïnvloeden.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een handige methode voor het beoordelen van gap junction-koppeling.
- Het onderzoeken van de effecten van belichting op elektrische synapsen in neuronen van het netvlies.
- Het verbeteren van bestaande technieken voor het bestuderen van kleine neuronale structuren.
Gebruikte methoden
- Retina's worden gesneden en geladen met een neuro-biotine tracer.
- Incubatie in Ringer-oplossing maakt diffusie van de tracer mogelijk.
- Fluorescentie wordt geanalyseerd om de koppelingssterkte te bepalen.
- Experimentele condities worden gecontroleerd om externe invloeden te minimaliseren.
Belangrijkste resultaten
- De fluorescentie-intensiteit geeft de mate van tracer-koppeling aan.
- De resultaten variëren afhankelijk van de verlichtingsomstandigheden en het tijdstip van de dag.
- Cut loading blijkt effectief te zijn voor kleine neuronale structuren.
- Een vergelijkende analyse tussen verschillende experimentele opstellingen wordt gefaciliteerd.
Conclusies
- De cut loading-methode is een waardevol instrument voor het bestuderen van retinale neuronen.
- Verlichtingsomstandigheden hebben een aanzienlijke invloed op de koppeling via gap junctions.
- Deze techniek kan ons begrip van neuronale communicatie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Het beoordelen van gap junction-gemedieerde communicatie in retina-neuronen ondersteunt de validatie van targets bij de ontdekking van geneesmiddelen in de neurowetenschappen door mechanische risicoreductie van synaptische modulatoren mogelijk te maken. De cut-loading techniek levert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste tracerdiffusiegegevens onder gecontroleerde verlichting, waardoor het voorspellend vertrouwen in target-engagement studies in een vroeg stadium wordt vergroot. Deze aanpak neemt een belangrijke technische barrière weg bij het bestuderen van kleine neuronale structuren in intact weefsel, wat de ontwikkeling van reproduceerbare assays voor het verduidelijken van signaalpaden vergemakkelijkt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de koppeling van gap junction-tracers te kwantificeren als functionele readout van de elektrische synaptische sterkte.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie via gestandaardiseerde metingen van tracerdiffusie die de doelwitmodulatie door neurotransmitters of geneesmiddelen verduidelijken.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door het verstrekken van kwantitatieve waarden voor de ruimteconstante die de koppelingsefficiëntie onder verschillende experimentele omstandigheden weerspiegelen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gevalideerde biologische systemen (intacte retinae) met een gap junction-permeabiliteit die geschikt is voor downstream compound screening.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gestandaardiseerde tracer-loading- en diffusieprotocollen mogelijk onder constante duisternis, waardoor variabiliteit door lichtgeïnduceerde veranderingen in de conductantie wordt verminderd.
- Kwantitatieve output: Levert fluorescentie-intensiteitsprofielen op die genormaliseerd kunnen worden en gefit kunnen worden aan exponentiële vervalmodellen voor vergelijking tussen condities.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Ondersteunt het onderzoek naar de circadiane regulatie van gap junctions in het netvlies, een mechanisme dat relevant is voor visuele verwerkingsstoornissen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen de validatie van targets in de ontdekkingsfase en preklinische continuïteit door een consistente beoordeling van tracer-koppeling onder licht-/donkercondities mogelijk te maken.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Levert gegevens over de effecten van modulatoren (bijv. D2-receptorantagonisten) om go/no-go-beslissingen te onderbouwen op basis van bewijs van target-engagement.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door het mogelijk maken van hypothesetesten van gap junction-modulatoren voorafgaand aan de lead-identificatie, waarbij de resultaten direct bijdragen aan de target-confidentie en padanalyse.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door het effect van verlichting en farmacologische middelen op tracerdiffusie via gap junctions te isoleren.
- Screening: Levert assay-klare weefselpreparaten met kwantificeerbare tracerdiffusie, wat een betrouwbare evaluatie van compound-effecten op neuronale koppeling ondersteunt.
- Analytics: Genereert gekalibreerde fluorescentie-intensiteit en ruimteconstante-metingen die statistische vergelijking (bijv. T-test) van de koppelingssterkte tussen verschillende condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinisch werk door beoordeling mogelijk te maken van de regulatie van tracerkoppeling door de retinale klok en licht/donker-cycli, wat relevant is voor ziektemodellen.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van gap junction-koppeling over verschillende retinale neurontypen en soorten, waardoor redundante methodeontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in elektrische synaptische communicatie te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid door gecontroleerde belichting en gestandaardiseerde procedures voor het laden van tracers.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroegere go/no-go-beslissingen mogelijk te maken op basis van kwantitatieve gegevens over targetengagement.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door empirische gegevens te leveren over modulator-effecten onder verschillende temporele en farmacologische omstandigheden.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in retina-dissectie, het hanteren van tracers en fluorescentiemicroscopie onder gecontroleerde duisternis.
- Afhankelijk van instrumentatie voor micro-snijden, incubatie, confocale beeldvorming en fluorescentiekwantificering (bijv. ImageJ, Origin).
- Vereist standaardisatie tussen teams van verlichtingsprotocollen, tracerconcentraties en snijdiepte om reproduceerbare koppelingsmetingen te garanderen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het toepassen van de techniek op andere neuronale systemen of soorten met variërende weefseldikte en gap junction-permeabiliteit.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van permeabele tracers zoals neurobiotine en het onvermogen om niet-tracer-gekoppelde elektrische synapsen direct te beoordelen.
