Name: Cut-loading: Een handig hulpmiddel is voor de behandeling van de omvang van Gap Junction Tracer koppeling tussen het netvlies Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Leer de cut-loading methode om gap-junction koppeling tussen retinale neuronen te onderzoeken onder gecontroleerde belichtingsomstandigheden. Deze techniek maakt kwantificering van elektrische synapsen in intact netvliesweefsel mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie ​​EY005102 om SCM en EY018640 aan CPR

1. Intact neurale netvlies voorbereidingen voor goudvissen, muizen en konijnen <ol><li> Voer de volgende stappen, waaronder die worden beschreven in "2) Cut-loading," onder constante omgevingstemperatuur (achtergrond) verlichting. Houdt u er rekening mee dat voor de toepassing van dit protocol, de procedures worden beschreven als uitgevoerd in constante duisternis (dwz onder zeer donkere (dwz "scotopic") voorwaarden ≤ 0,0001 lux) met behulp van infrarood nachtzicht bril, maar ook andere hogere intensiteit niveaus van constante omgevingstemperatuur verlichting kunnen worden in plaats daarvan gebruikt om het effect van de andere niveaus van ambient verlichting op gap junction tracer koppeling te bepalen. </li><li> Dark-aanpassen van de proefdieren (goudvis, muis of konijn) gedurende minstens een uur voor de operatie. </li><li> Zoals eerder beschreven 7, diep verdoven goudvis door ze te plaatsen in tricaïne methaansulfonaat (MS222, 150 mg / L van gebufferd (natrium-bicarbonaat-bevattende) aquarium water), en diep muizen verdoven met ketamine (100 mg/ Kg, ip) en rompun (10 mg / kg, ip). Diep verdoven konijnen met urethaan (oplaaddosis: 2,0 g / kg, ip) en ook gebruik maken van lokale verdoving intraorbital (2% Xylocaine), zoals eerder beschreven 8. Alle experimentele procedures met betrekking tot de zorg en het gebruik van dieren moet worden uitgevoerd in overeenstemming met federale richtlijnen en moeten worden beoordeeld en goedgekeurd door de lokale universiteit dier zorg en gebruik van de commissies. (Opmerking:. In de experimenten hier beschreven, alle experimentele procedures met betrekking tot de zorg en het gebruik van vissen, muizen en konijnen werden uitgevoerd in overeenstemming met NIH richtlijnen en werden beoordeeld en goedgekeurd door de Ohio State University Institutional Animal Care en gebruik Comite) </li><li> Voor vissen, muizen en konijnen, na enucleatie, verwijder het voorste gedeelte van elk oogbol. Plaats dan een stukje filtreerpapier op de top van het achterste deel van het oog en keer het filter met het oog, zodat het filter papier onder het achterste deel van het oog. Dan, met een fijnpincet ontleden de intacte neurale netvlies van de achterste deel van het oog door zachtjes afpellen van het pigment epitheel / choroidea / sclera, die verbonden zijn aan elkaar, van de neurale netvlies, die is bevestigd aan de filter papier. Dit gebeurt, snijd de oogzenuw met behulp van fijne verende schaar. De neurale netvlies, gericht fotoreceptor-kant naar boven, moet nu worden bevestigd aan de filter papier en gescheiden van de rest van het oog. </li></ol> 2. Cut-loading <ol><li> Dompel het netvlies in de oplossing zuurstofrijk Ringer's (tabel 1) in een 6-wells plaat (~ 5 ml / putje) gedurende 30 min onder constante omgevingstemperatuur (achtergrond) verlichting (bijv. onder zeer donkere (dwz "scotopic") voorwaarden) met of zonder een test drug. Onderhouden vis netvliezen in zuurstofrijk (5% CO 2 / 95% O 2) bicarbonaat-based Ringer's bij 22 ° C door het afdichten van de 6-well plaat met parafilm en onderhouden van muis en konijn netvliezen bij 36 ° C in een 5% CO 2 / 95% O <li> Bereid de tracer oplossing (meestal 100 pi), door het oplossen van neurobiotin (0,5%), een gebiotinyleerd molecuul, in Ringer-oplossing direct vóór dwars door het netvlies. Merk op dat 0,5% rhodamine dextran (hoog (&gt; 10.000) MW) kan worden toegevoegd aan de oplossing. Door zijn hoog moleculair gewicht, is rhodamine dextran niet over gap junctions en alleen etiketten cellen die zijn beschadigd door de snede. Zoals getoond in Fig. 3, dit is een handige manier om cellen die zich ophopen neurobiotin, omdat ze gewond zijn geraakt, van degenen die de tracer verzameld hebben door diffusie door gap junctions te onderscheiden. </li><li> Plaats de neurobiotin oplossing op een glas (of plastic) petrischaal, tikt u op het filtreerpapier, waarbij het netvlies is bevestigd, op een papieren handdoek om het overtollige Ringer te verwijderen, een scheermesje (of een ander scherp mes), duik in de neurobiotin oplossing en den maak een radiaal snijden door het netvlies en de filter papier. Indien gewenst, kan afstandhouders worden gebruikt, zodat de snede wordt gemaakt door het netvlies, maar niet de filtreerpapier. De snede moet worden gericht loodrecht op het netvlies oppervlak. Dompel het scheermes in de neurobiotin oplossing weer en snijd het netvlies een tweede keer. Herhaal dit tot 4 sneden per netvlies (zie figuur 1.). Gebruik een dissectie microscoop bij het maken van scheermes snijdt door de muis en andere kleine netvliezen. </li><li> Zoals getoond in Fig. 1, dompel het netvlies weer in medium verse Ringer's, met of zonder te testen geneesmiddel, met behulp van een 6-plaat goed (5 ml Ringer / well). Incubeer het netvlies gedurende 15 minuten om te zorgen voor het laden en diffusie. </li><li> Was drie keer voor 5 min elk met vers Ringer's medium met of zonder test drug. </li><li> Bevestig het netvlies met 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PBS, pH 7,4) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> 'S nachts wassen met 0,1 M PBS bij 4 ° C. </li><li> De volgende dag, reageer wet 2% streptavidine-Alexa 488 (eindconcentratie 10 pg / ml) in 0,1 M PBS + 0,3% Triton X-100, en overnacht bij 4 ° C te houden </li><li> Was drie keer voor 10 minuten elk met 0,1 M PBS bij RT </li><li> In PBS, het netvlies los van het filter papier en daarna, met een fijn penseel, plaats het netvlies, gericht fotoreceptor-kant naar boven, op een dia. </li><li> Voorzichtig monteren met Vectashield montage medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA). </li><li> Foto's maken met een laser scanning confocale microscoop (bijvoorbeeld Zeiss 510 META) op dezelfde vergroting, resolutie en instellingen voor elke experimentele conditie, zodat u de effecten van de verschillende experimentele omstandigheden (bijvoorbeeld te testen drugs verlichting voorwaarden) te vergelijken op de mate van gap junction tracer koppeling (Fig. 2A-C en Fig. 4A-C). Hoewel een enkel beeld kan bevatten alle van de gemerkte cellen, is het aanbevolen dat u een z-stack van de oppervlakte van belang te verzamelen en storten het in een enkelbeeld. </li></li></ol> 3. Kwantificering van de tracer koppeling met behulp van ImageJ <ol><li> In de LSM image browser, de afbeelding te openen, klik op Exporteren en sla de foto als een TIF-16 bit NIET gecomprimeerd bestand. Schaalbalk moeten worden opgenomen in deze TIF-beeld. </li><li> Met behulp van NIH ImageJ software, meten fluorescentie-intensiteit van de Alexa-488-gelabelde neurobiotin uit lage-vergroting beelden van de hele-mount netvlies. Open het TIF-bestand met behulp ImageJ-software en vervolgens trek een rechte lijn die overeenkomt met de schaal bar. Ga naar ANALYSEREN, SET SCALE en voer de bekende afstand en de eenheid van lengte, klik op OK. Nu meetresultaten kunnen worden gepresenteerd in gekalibreerde eenheden, zoals millimeters. </li><li> Selecteer het gebied van belang het gebruik van de rechthoekige selectie tool. De piek van de fluorescentie moet worden geplaatst aan de linker rand van uw selectie. Zorg ervoor dat er geen fluorescentie-signaal in de buurt van de rechter rand. Zo niet, draai de actieve afbeelding (IMAGE, en draai). </li><li> KlikkenANALYSE en PLOT PROFIEL. U ziet nu een curve met een exponentiële verval van links naar rechts. </li><li> Klik op COPY in het pop-up venster en plak deze in EXCEL. Nu zie je twee kolommen met de afstand van de snede (linker kolom) en de fluorescentie-intensiteit als functie van de afstand van de cut (rechter kolom). </li><li> Verdeel elke rauwe fluorescentie-waarde door de maximale fluorescentie waarde aan de relatieve fluorescentie-intensiteit te verkrijgen. </li><li> Kopieer twee kolommen die overeenkomen met de afstand van de cut (X) en de relatieve fluorescentie-intensiteit (Y), en plak ze in Origin software. </li><li> Fit met de exponentieel verval # 1 functie (fig. 2D en 4D figuur.), Die in de vorm: Y = Y 0 + Y max * exp (-x / λ) waarbij Y is de relatieve fluorescentie-intensiteit, Y o is de achtergrond fluorescentie, Y max is de maximale relatieve fluorescentie, λ is de space (lengte) constant, en x is de afstand van de snede. </li><li> Vergelijk de ruimte constant (λ)-waarden bij verschillende experimentele condities met behulp van de t-test of ANOVA (fig. 2E en Fig. 4E). Merk op dat alternatieve technieken voor kwantificering zijn beschreven door anderen 13,14. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Representatieve voorbeelden van fotoreceptorcel tracer koppeling, zoals bepaald door cut-laden worden gepresenteerd in de figuren 2 en 3 (vis) en Figuur 4 (konijn). Confocale beelden werden genomen met dezelfde instellingen te vergelijken (Fig. 2A-C en Fig. 4A-C) en de fluorescentie-intensiteit is uitgezet als functie van de afstand van de gesneden en gemonteerd door de exponentiële functie die in nummer 3.8 boven (fig. 2D en Fig. 4D). Ruimte constante waarden voor elke conditieworden getoond in de figuren 2E en 4E, illustreren dat de mate van gap junction tracer koppeling kan worden gekwantificeerd aan de hand van de cut-loading techniek. Daarnaast zijn de resultaten zeer reproduceerbaar. Gebruik van de cut-loading techniek als een middel om het kwantificeren van de omvang van de gap junction tracer koppeling wordt ook bevestigd door de bevinding dat fluorescentie-intensiteit exponentieel afneemt als een functie van de afstand van de snede in alle onderzochte gevallen 7,8 (zie ook Fig. 2D en 4D hier), wat aangeeft dat neurobiotin de fotoreceptoren ingevoerd via het scheermes geknipt en niet uit andere retinale sites. Bovendien is de kwalitatief vergelijkbaar dag / nacht verschil in fotoreceptorcel tracer koppeling waargenomen in goudvissen met de tracer injecties in enkele kegels en met cut-loading 7 onderbouwt cut-laden als een relatief nauwkeurig middel van het meten van de omvang van fotoreceptor koppeling. De cut-loading techniek kan ook worden gebruikt om andere vormen van elektrische synapsen in het netvlies te onderzoeken. Bijvoorbeeld, Figuur 5 laat zien dat konijn A-type (Fig. 5A) en B-type (Fig. 5B) horizontale cellen vertonen homologe tracer koppeling volgende cut-laden en verspreiding van neurobiotin onder donker aangepaste omstandigheden. <table border="1"><tbody><tr><td> Samenstelling </td><td> Vis </td><td> Muis </td><td> Konijn </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 120 </td><td> 117 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 20 </td><td> 25 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 2.5 </td><td> 5 </td><td> 3.1 </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgSO 4-7H 2 O </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> Glutamine </td><td> - </td><td> 0.1 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0.7 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Samenstelling van oplossingen van de Ringer's voor goudvissen, muis en konijn netvliezen. De concentraties zijn weergegeven in mM. De Ringer-oplossingen zijn geborreld met 5% CO 2 / 95% O 2 en gehandhaafd op 22 ° C (vis) of 36 ° C (zoogdieren). "-": Niet in de Ringer voor deze soort. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1:. Flow grafiek met de cut-loading procedure. Na isolatie of de intacte neurale netvlies, waren verschillende radiale sneden gemaakt door een mes dat voor het eerst werd gedompeld in 0,5% neurobiotin oplossing. Het netvlies werd geïncubeerd gedurende tracer laden en diffusie, en vervolgens gewassen voor fixatie met 4% paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M fosfaatbuffer (PB). Tracer koppeling werd onderzocht met behulp van streptavidine-geconjugeerde Alexa-488. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Dag-nacht verschil in fotoreceptor tracer koppeling in goudvis is onthuld door de cut-loading techniek. Fotoreceptorcel gap junction neurobiotin tracer koppeling werd uitgebreid in de nacht (B) en in de dagen na toepassing van spiperone (10 uM), een selectieve dopamine D 2-receptor antagonist (C), maar niet in de dag onder controle condities (A). D) De genormaliseerde relatieve fluorescentie-intensiteit als functie van de afstand van de bezuinigingen (aangegeven met pijlen in AC). E) Ruimte constant valUES verkregen uit de gegevens in D en andere experimenten (n = 4). *** P &lt;0.001. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Een representatief voorbeeld met fluorescentie in de fotoreceptorcel laag van een donker aangepaste goudvis netvlies 's nachts na cut-laden met een oplossing van zowel de neurobiotin en rhodamine dextran. Rhodamine dextran (aangegeven in rood), die niet verspreiden door middel van open gap junction kanalen vanwege het hoge moleculaire gewicht (&gt; 10.000 MW), alleen gelabelde cellen in de buurt van de snede. In tegenstelling, kunnen neurobiotin (aangegeven in groen) verspreid via gap junctions en gezien te worden in fotoreceptorcellen ver van de snede. De locatie van de snede wordt aangegeven door de pijl in elk paneel. Schaal bar: 200 micrometer. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Dag-nacht verschillenHet verschil in fotoreceptor tracer koppeling in konijnen netvlies is onthuld door de cut-loading techniek. Fotoreceptorcel gap junction neurobiotin tracer koppeling werd uitgebreid in de nacht (B) en in de dagen na toepassing van spiperone (10 uM) (C), maar niet in de dag onder controle condities (A). In AC, loodrecht uitzicht op de 3D-reconstructie van konijn fotoreceptoren dicht bij de snede weergegeven. D) De genormaliseerde relatieve fluorescentie-intensiteit als functie van de afstand tot de bezuinigingen. E) Ruimte constante waarden verkregen uit de gegevens in D en andere experimenten (n = 3). *** P &lt;0.001. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Cut-loading blijkt dat donker aangepaste konijn horizontale cellen zijn tracer gekoppeld. Zowel de A-type (A) en B-type (B) horizontale cellen in donker aangepaste konijn netvlies tentoongesteld homologe neurobiotin tracer koppeling.

<ol><li>Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+coupling+and+neuronal+synchronization+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain.</a> Neuron. 41, 495-511 (2004).</li>
<li>Connors, B. W., Long, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+synapses+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrical synapses in the mammalian brain.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 393-418 (2004).</li>
<li>Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+diverse+types+of+retinal+neurons+show+tracer+coupling+when+injected+with+biocytin+or+Neurobiotin%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Many diverse types of retinal neurons show tracer coupling when injected with biocytin or Neurobiotin.</a> Neurosci. Lett. 125, 187-190 (1991).</li>
<li>Bloomfield, S. A., Völgyi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+functional+roles+and+regulation+of+neuronal+gap+junctions+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 495-506 (2009).</li>
<li>Weiler, R., Pottek, M., He, S., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+coupling+between+retinal+horizontal+cells+by+retinoic+acid+and+endogenous+dopamine%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Brain.+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Modulation of coupling between retinal horizontal cells by retinoic acid and endogenous dopamine.</a> Brain. Res. Brain. Res. Rev. 32, 121-129 (2000).</li>
<li>Xin, D., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nitric+oxide+on+horizontal+cells+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effects of nitric oxide on horizontal cells in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 17, 799-811 (2000).</li>
<li>Ribelayga, C., Cao, Y., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock+in+the+retina+controls+rod-cone+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The circadian clock in the retina controls rod-cone coupling.</a> Neuron. 59, 790-801 (2008).</li>
<li>Ribelayga, C., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+circadian+clock-controlled+neural+pathway+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a circadian clock-controlled neural pathway in the rabbit retina.</a> PLoS One. 5, e11020-e11020 (2010).</li>
<li>Ouyang, X., Winbow, V. M., Patel, L. S., Burr, G. S., Mitchell, C. K., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Kinase+A+mediates+regulation+of+gap+junctions+containing+connexin35+through+a+complex+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Mol.+Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway.</a> Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).</li>
<li>Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gap+junction+coupling+through+the+neuronal+connexin+Cx35+by+nitric+oxide+and+cGMP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Commun.+Adhes%22%5BJournal%5D)">Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP.</a> Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).</li>
<li>Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+modulates+intercellular+communication+among+cultured+chick+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes.</a> Brain. Res. 1031, 10-19 (2005).</li>
<li>Cusato, K., Bosco, A., Rozental, R., Guimarães, C. A., Reese, B. E., Linden, R., Spray, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+mediate+bystander+cell+death+in+developing+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gap junctions mediate bystander cell death in developing retina.</a> J. Neurosci. 23, 6413-6422 (2003).</li>
<li>Li, H., Chuang, A. Z., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+coupling+is+controlled+by+connexin+35+phosphorylation+in+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina.</a> J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).</li>
<li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+tracer+movement+through+homologous+gap+junctions+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).</li>
<li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+biotinylated+tracers+distinguishes+three+types+of+gap+junction+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina.</a> J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De cut-loading hier beschreven methode is een nuttige en eenvoudige techniek om de omvang van de gap junction tracer koppeling tussen het netvlies neuronen onder verschillende belichting omstandigheden en op verschillende tijdstippen van de dag en nacht te bepalen. Voordelen van deze techniek zijn de mogelijkheid om de mate van gap junction tracer koppeling tussen de neuronen in het netvlies intact weefsel te kwantificeren onder verschillende omstandigheden tijdens de verlichting dag en nacht en om dat te doen voor gekoppelde neuronen die met een kleine diameter somata hebben. Beperkingen van de techniek in de studie van gap junctions in intact weefsel vallen in twee algemene categorieën. Ten eerste kan tracer diffusie door middel van open gap junctions zijn relatief moeilijk waar te nemen als gevolg van een) de kleine diameter van of de lading in verband met de open kanalen en b) de relatieve hoeveelheden van gekoppelde cellulaire compartimenten 1,14,15. Dat wil zeggen, tracer diffusie van een kleine cel naar een grotere cel of een groep van gekoppelde cellen, compared naar tracer diffusie van een grotere cel naar een kleinere cel, kan moeilijker te detecteren, omdat tracer verdunning. Ten tweede, onder bepaalde fysiologische omstandigheden, kan de omvang van de tracer diffusie door gap junctions in intact weefsel niet nauwkeurig overeen met de sterkte van de gap junctions geleiding te wijten aan verschillen in de geleiding van kleine elektrische stroom-dragende ionen, in vergelijking met de doorlaatbaarheid van relatief grote tracer moleculen 1,14,15. In het algemeen, het bewijs van tracer-koppeling wijst er sterk op de aanwezigheid van werkende, open gap junction kanalen, maar onder bepaalde fysiologische omstandigheden, tracer diffusie kan niet plaatsvinden of worden nageleefd, ook al is elektrofysiologisch opnames van de aanwezigheid van werkende, open gap junctions suggereren. Het lijkt waarschijnlijk dat de cut-loading techniek ook kan worden gebruikt om de mate van gap junction tracer koppeling te onderzoeken tussen de neuronen in intact weefsel uit andere regio&#39;s van het centrale zenuwstelsel systeemteem.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> Tricaïne methaan sulfonaat (MS222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td><td> 150 mg / L van gebufferd aquarium water </td></tr><tr><td> Urethaan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U2500 </td><td> 2 g / dosis kgloading </td></tr><tr><td> Dual Tube Night Vision Goggle </td><td> Night Optics USA </td><td> D-221 </td><td></td></tr><tr><td> Filtreerpapier, Grade nr. 4 </td><td> Whatman papier </td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td> Fijn Tang, Dumont nr. 5, Biologie, 11 cm lang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11295-10 </td></tr><tr><td> Fijn Schaar, lente-loaded, 8 mm zaagblad, recht </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15025-10 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td> Vector </td><td> SP-1120 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Streptavidine-geconjugeerde Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11223 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Dextran rhodamine (hoog (&gt; 10.000) MW) </td><td> Invitrogen </td><td> D1817 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Vectashield afdekmedium </td><td> Vector </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Zeiss 510 META laser scanning confocale microscoop </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ Software </td><td> NIH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OriginPro 8.0 </td><td> OriginLab Corp </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cut-loading: een handig hulpmiddel is voor de behandeling van de omvang van gap junction tracer koppeling tussen het netvlies neuronen

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Naast de chemische synaptische transmissie, kunnen neuronen die zijn verbonden door gap junctions ook snel te communiceren via elektrische synaptische transmissie. Steeds meer aanwijzingen geeft aan dat gap junctions niet alleen toe elektrische stroom en synchrone activiteit tussen onderling verbonden of gekoppeld cellen, maar dat de kracht en effectiviteit van de elektrische communicatie tussen de gekoppelde cellen kunnen worden gemoduleerd voor een groot deel 1,2. Daarnaast is de grote interne diameter (~ 1.2 nm) van de vele gap junction kanalen vergunningen niet alleen elektrische stroom, maar ook de verspreiding van intracellulaire signaalmoleculen en kleine metabolieten tussen de cellen onderling verbonden, zodat gap junctions kan ook bemiddelen metabole en chemische communicatie . De kracht van gap junctions de communicatie tussen neuronen en de modulatie door neurotransmitters en andere factoren kan worden bestudeerd door gelijktijdig elektrisch gekoppeld opname van cellen en door het vaststellen van tHij mate van verspreiding van de tracer moleculen, die gap junction doorlaatbaar, maar niet doorlaatbaar membraan, na iontoforetische injectie in enkele cellen. Echter, kunnen deze procedures worden uiterst moeilijk uit te voeren op de neuronen met kleine somata in intacte zenuwweefsel. Talrijke studies op elektrische synapsen en de modulatie van elektrische communicatie zijn uitgevoerd in de gewervelde netvlies, omdat elk van de vijf netvlies neuron soorten wordt elektrisch verbonden met gap junctions 3,4. Steeds meer bewijs heeft aangetoond dat het circadiane (24-uurs) klok in het netvlies en de veranderingen in het licht stimulatie gap junction koppeling 3-8 te reguleren. Zo heeft recent werk laten zien dat de retinale circadiane klok gap junction koppeling tussen de staafjes en kegeltjes lichtgevoelige cellen afneemt gedurende de dag door een verhoging van dopamine D2 receptor activering, en dramatisch verhoogt rod-cone koppeling &#39;s nachts door het verminderen van D2-receptor activering <sup&gt; 7,8. Echter, niet alleen zijn deze studies zeer moeilijk uit te voeren op de neuronen met kleine somata in intacte neurale retinaal weefsel, maar het kan moeilijk zijn om afdoende te beheersen verlichting omstandigheden tijdens de elektrofysiologische studie van enkele retinale neuronen aan het licht-geïnduceerde veranderingen in gap junction te vermijden geleiding. Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het bepalen van de omvang van gap junction tracer koppeling tussen het netvlies neuronen onder verschillende belichting omstandigheden en op verschillende tijdstippen van de dag en nacht. Deze cut-loading techniek is een modificatie van schrapen laden 9-12, die gebaseerd is op het laden van kleurstof en verspreiding via een open gap junction kanalen. Schraap het laden werkt goed in gekweekte cellen, maar niet in dikke plakken, zoals intact netvlies. De cut-loading techniek is gebruikt om fotoreceptor koppeling in intacte vissen en zoogdieren netvlies 7, 8,13 studie, en kan gebruikt worden om te studeren koppeling tussenandere retinale neuronen, zoals hier beschreven.

Een eenvoudige en handige methode om de mate van gap junction tracer koppeling tussen het netvlies neuronen te bepalen is beschreven. Deze techniek laat toe om de functie van de elektrische synapsen tussen neuronen in de retina intact te onderzoeken onder verschillende belichting omstandigheden en op verschillende tijdstippen van de dag en nacht.

Cut-loading: Een handig hulpmiddel is voor de behandeling van de omvang van Gap Junction Tracer koppeling tussen het netvlies Neuronen

Naast chemische synaptische transmissie kunnen neuronen die via gap junctions met elkaar zijn verbonden ook snel communiceren via elektrische synaptische ...

Het algemene doel van het volgende cut loading-experiment is om de mate van gap junction-tracerkoppeling tussen neuronen in het intacte netvlies te onderzoeken onder gecontroleerde verlichtingsomstandigheden. De eerste stap wordt bereikt door netvliezen door te snijden met een scherp mesje dat is gedoopt in een oplossing van neurobiotine, een tracermolecuul dat kan diffunderen door open gap junction-kanalen, maar niet door celmembranen. In de tweede stap worden de netvliezen geïncubeerd in Ringer-oplossing, wat diffusie van de tracer door open gap junction-kanalen mogelijk maakt.Als de koppeling via gap junctions zwak is, zal de neurobiotine-fluorescentie beperkt blijven tot de retinale neuronen die zich dicht bij de doorsnede bevinden. Daarentegen zal de fluorescentie bij een sterke koppeling via gap junctions worden gedetecteerd in retinale neuronen die ver van de doorsnede liggen. Het belangrijkste voordeel van cut loading ten opzichte van bestaande technieken is dat het eenvoudiger uit te voeren is bij neuronen met kleine cellichamen in intact retinaal neuraal weefsel.Het is bovendien eenvoudiger om de verlichtingsomstandigheden tijdens het laden van de coupes te controleren dan tijdens een elektrofysiologische studie van individuele neuronen in intact retinaal weefsel. Omdat de lichtstimuli die tijdens de elektrische registratie worden gebruikt zelf kunnen leiden tot veranderingen in de koppeling van gap junctions, zal de techniek worden gedemonstreerd door Dr. Chu Choi, een postdoc uit mijn laboratorium. Bij deze procedure wordt een goudvis gedurende ten minste één uur voor de operatie overdag in constant donker gehouden, en alle volgende stappen tot het moment dat het retinale weefsel wordt gefixeerd, worden overdag eveneens in constant donker uitgevoerd; annesteeseer de goudvis diep door 150 milligram per liter methaansulfonaat aan het aquariumwater toe te voegen.Offer daarna de goudvis aan volgens de federale en universitaire richtlijnen en verwijder voorzichtig de oogbollen. Verwijder vervolgens het anterieure gedeelte van elke oogbol. Plaats daarna een stuk filterpapier op het posterieure gedeelte van het oog en keer het filterpapier en het oog om, zodat het filterpapier zich onder het posterieure gedeelte van het oog bevindt.Verwijder nu voorzichtig de achterzijde van het oog, inclusief de sclera en het pigmentepitheel, van de donkergeadapteerde goudvis. Doorknip de oogzenuw van het netvlies met een fijne schaar. Het neurale netvlies van de goudvis, georiënteerd met de fotoreceptorzijde naar boven, moet nu vóór enucleatie aan het filterpapier worden bevestigd, terwijl de vis onder narcose is in 5 mL geoxygeneerde carbonate-gebaseerde Ringer-oplossing, met of zonder testmiddel, in elke put van een six-well plate, na dissectie van het intacte neurale netvlies uit het posterieure gedeelte van het oog.Overbreng de retinae naar de wells onder constante duisternis. Seal vervolgens de wells met parafilm en laat het weefsel 30 minuten incuberen. Bereid 100 µL tracer-oplossing voor door 0,5% neurobiotine op te lossen in ringersolution vlak voordat er door de retina wordt gesneden.Voeg vervolgens de neurobiotine-oplossing toe aan een glazen petrischaal. Tik daarna voorzichtig op het filterpapier waaraan het netvlies is bevestigd, terwijl u dit op een papieren handdoek houdt. Om overtollige Ringers-oplossing te verwijderen, doopt u een scheermesje in de neurobiotine-oplossing en maakt u een loodrechte radiale snede door het netvlies en het filterpapier.Doop daarna het scheermesje opnieuw in de neurobiotine-oplossing en snijd het netvlies een tweede keer. Herhaal dit tot maximaal vier sneden per netvlies. Breng het netvlies bij deze stap 15 minuten over naar vers Ringers-medium, met of zonder testdrug, om belading en diffusie mogelijk te maken.Was het drie keer met vers Ringer-medium, met of zonder testmedicijn, telkens gedurende vijf minuten. Fixeer vervolgens het retina met 4% paraformaldehyde in een 0,1 molaire fosfaatbufferoplossing bij kamertemperatuur gedurende één uur. Was het retina daarna overnacht bij vier graden Celsius met 0,1 molaire PBS door het in een koelkast te plaatsen tot de volgende dag.Behandel het netvlies met 2% streptavidine Alexa 4 88 in 0,1 molar PBS en 0,3% Triton X 100 tot een eindconcentratie van 10 micrograms per milliliter en laat dit overnight incuberen bij vier graden Celsius. Was het netvlies de volgende dag drie keer met 0,1 molar PBS bij kamertemperatuur, telkens gedurende 10 minuten.Los de retina los van het filterpapier in PBS. Monteer vervolgens de retina met een fijn penseel met de fotoreceptorkant naar boven op een objectglas met vector shield monteermedium. Plaats het objectglas in een laser-scanning confocale microscoop en maak foto's met dezelfde vergroting, resolutie en instellingen voor elke experimentele conditie, zodat de effecten van verschillende experimentele condities op de mate van functionele koppeling van de gap-tracer kunnen worden vergeleken.Hier is de omvang van de koppeling van de fotoreceptorcel-tracer overdag in constante duisternis, vergeleken met overdag in constante duisternis in aanwezigheid van een selectieve dopamine D2-receptorantagonist. Let op dat de scheidsneden in beide afbeeldingen zich aan de linkerzijde bevinden. Hoewel een enkele afbeelding alle gelabelde cellen kan bevatten, wordt aanbevolen om een Z-stack van het gebied van belang te verzamelen en deze samen te voegen tot één enkele afbeelding zoals hier getoond.Hier is de omvang van de koppeling van de photoreceptor-celtracer bij het sequentieel doorlopen van een dergelijke Zack. Let erop dat de scheiding met het scheermes in deze afbeelding zich aan de rechterkant bevindt. Om de omvang van de tracerkoppeling in de LSM-afbeeldingsbrowser te kwantificeren, opent u de afbeelding, klikt u vervolgens op exporteren en slaat u de afbeelding op als een TIF 16-bit niet-gecomprimeerd bestand; een schaalbalk moet in deze TIFF-afbeelding worden opgenomen met behulp van NIH ImageJ-software.Meet de fluorescentie-intensiteit van Alexa 4 88-gelabeld neurobiotine op basis van beelden met lage vergroting van hole mount retina's. Open het TIFF-bestand met Image J-software en trek vervolgens een rechte lijn die overeenkomt met de schaalbalk. Ga daarna naar analyze, set scale, en voer de bekende afstand en lengte-eenheid in.Klik vervolgens op oké. De fluorescentiemetingen kunnen nu worden weergegeven in gekalibreerde eenheden, zoals millimeters. Selecteer daarna het gebied van interesse met de rechthoekige selectietool.De fluorescentiepiek moet zich aan de linkerrand van uw selectie bevinden. Zorg ervoor dat er geen fluorescentiesignaal nabij de rechterrand aanwezig is. Klik op analyze and plot profile voor de dagcontrolegegevens die zijn verkregen in constante duisternis.Een curve met een exponentiële afname wordt van links naar rechts weergegeven. Klik vervolgens op kopiëren in het pop-upvenster en plak deze in Excel. Er zijn nu twee kolommen, één die de afstand tot de snede weergeeft en de andere de fluorescentie-intensiteit als functie van de afstand tot de snede.Ter vergelijking worden de bovenstaande stappen herhaald met gegevens die overdag in constante duisternis zijn verkregen. Deel bij de aanwezigheid van spit bro elke ruwe fluorescentiewaarde door de maximale fluorescentiewaarde om de relatieve fluorescentie-intensiteit te verkrijgen. Kopieer de twee kolommen die overeenkomen met de afstand vanaf de snede en de relatieve fluorescentie-intensiteit, en plak deze vervolgens in de Origin-software.Deze stappen worden getoond voor zowel de dagcontrole als het dagelijkse speeksel. Pas de data van dit punt aan de resultaten van de exponentiële vervalfunctie nummer één. Vergelijk de waarden van de tijdconstante bij verschillende experimentele condities met behulp van een T-test of ANOVA.Exponentiële functies en statistische analyses van data van de daggroep controle, daggroep pip rone en de nachtgroep controle worden ter vergelijking getoond. Hier zijn voorbeelden van de mate van koppeling van de tracer in fotoreceptorcellen in het donkergeadapteerde netvlies van de goudvis gedurende de dag A, de nacht B, en gedurende de dag in aanwezigheid van one, een selectieve dopamine D twee receptorantagonist, zoals onthuld door de cut loading-techniek. Alle confocale beelden zijn voor vergelijking met dezelfde instellingen genomen.In deze grafiek is de fluorescentie-intensiteit voor drie experimentele condities uitgezet als functie van de afstand tot de snede en gefit met de exponentiële functie. De cut loading-techniek wordt gebruikt om de mate van koppeling van tracers via gap junctions te kwantificeren door ruimteconstante-waarden te berekenen, zoals hier getoond voor drie experimentele condities. De cut loading-techniek kan ook worden gebruikt om elektrische synapsen tussen andere celtypen in het netvlies en in andere soorten te onderzoeken.Bijvoorbeeld, deze twee figuren illustreren dat horizontale cellen van type A en type B bij het konijn homologe tracer-koppeling vertonen na cut loading en diffusie van neurobiotine onder donkergeadapteerde omstandigheden. We hebben de cut loading-techniek gebruikt om de mate van tracer-diffusie via de gap junctions tussen staafjes en kegeltjes overdag en 's nachts te bestuderen. Daarnaast kan deze techniek worden gebruikt om te bepalen of tracer-koppeling tussen andere retinale neuronen wordt aangestuurd door de retinale klok en/of door specifieke licht-donkercondities.Het kan ook worden gebruikt om de tracerkoppeling tussen neuronen in andere hersengebieden te bestuderen.

cut-loading-useful-tool-for-examining-extent-gap-junction-tracer

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft hoe u synaps nummer zowel in gedissocieerde neuronale cultuur en in de hersenen secties met behulp van immunocytochemie kwantificeren. Met behulp van vak-specifieke antilichamen, we label presynaptische terminals alsmede ten aanzien sites van postsynaptische specialisatie. We definiëren synapsen als punten van colocalization tussen de signalen die door deze markers.

Het kwantificeren van Synapsen: een immunocytochemie-gebaseerde test te Synapse Number Kwantificeer

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van agar-embedded netvlies plakken die geschikt zijn voor elektrofysiologie en Ca2 + beeldvorming. Deze methode laat toe om te studeren lint-type synapsen in het netvlies microcircuits met behulp van directe patch-clamp opnames van enkele presynaptische zenuwuiteinden.

Patch-clamp capaciteitsmetingen en Ca 2 + Imaging bij Single zenuwuiteinden in het netvlies Slices

Wij beschrijven een eenvoudige en goedkope methode voor het inbrengen hoge concentratie van fluorescerende en calcium-gevoelige kleurstoffen in neuronen of neuronale kanaal met een polyethyleen zuig pipet.

Retrograde Laden van zenuwen, Tracts, en Spinal Roots met fluorescente kleurstoffen

Immunohistochemie protocollen worden gebruikt voor de lokalisatie van een specifiek eiwit in het netvlies te bestuderen. Calcium beeldvormende technieken worden gebruikt om calcium dynamiek in retinale ganglioncellen en hun axonen te bestuderen.

Immunohistochemische en Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Deze presentatie demonstreert een methode waarbij elektroporatie van adherante, gekweekte cellen wordt gebruikt voor het bestuderen van intercellulaire, junctionele communicatie, terwijl de cellen groeien op een plaatje dat bedekt is met geleidend en transparant indium-tinoxide.

Een functionele test voor Gap Junctionele Onderzoek; Elektroporatie van hechtende cellen op indiumtinoxide

Dit protocol beschrijft een scalpel loading-fluorescerende kleurstof overdracht techniek die intercellulaire communicatie meet door middel van gap junction kanalen. Spleetovergangen intercellulaire communicatie is een belangrijke cellulaire proces waardoor weefsel homeostase wordt onderhouden en verstoring van deze cell signaling heeft nadelige gevolgen voor de gezondheid.

Gap Junctionele intercellulaire communicatie: Een functionele Biomarker om de negatieve gevolgen van de Giftige stoffen en toxines te beoordelen, en gezondheidsvoordelen van Natural Products

Dit protocol laat zien hoe whole-cell patch clamp opname uit te voeren op het netvlies neuronen uit een flat-mount voorbereiding.

Patch Clamp Registratie van Starburst amacrine Cellen in een flat-mount voorbereiding van Deafferentated Mouse Retina

Hier beschrijven we een methode voor het laden van een calciumgevoelige kleurstof door de kikker zenuwstomp in de zenuwuitgangen. We presenteren ook een protocol voor de opname en analyse van snelle calcium transiënten in de perifere zenuw eind.

Een calciumkleurstofverf in de zenuwlengte van de kikker laden door de zenuwstomp: Calcium Transient Registratie in de Kikker Neuromusculaire Junction

Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de organisatie van de astrocytic netwerken. De beschreven methode minimaliseert bias om beschrijvende maatregelen van deze netwerken zoals cellen, grootte, ruimte en positie binnen een kern. Anisotropie is beoordeeld met een vectoriële analyse.

Analyseren van de grootte, de vorm en de directionaliteit van netwerken van gekoppelde astrocyten

Hier presenteren we een protocol voor een roman gap junction intercellulaire communicatie assay ontworpen voor de high-throughput screening van gap junction-modulerende chemicaliën voor drugontdekking en toxicologische beoordeling.

Een jodide-geel fluorescerende eiwit-Gap Junction-intercellulaire communicatie Assay

Dit werk presenteert een alternatief flatmount retina-preparaat waarbij de verwijdering van fotoreceptorcellichamen een snellere verspreiding van antilichamen en verbeterde patchpipettoegang tot binnenste retinale neuronen mogelijk maakt voor immunohistochemie, in situ hybridisatie en elektrofysiologische experimenten.

Split Retina als een verbeterde flatmount-voorbereiding voor het bestuderen van neuronen in de binnenste nucleaire laag in het netvlies van gewervelde dieren

Leer de cut-loading methode om gap-junction koppeling tussen retinale neuronen te onderzoeken onder gecontroleerde belichtingsomstandigheden. Deze techniek maakt kwantificering van elektrische synapsen in intact netvliesweefsel mogelijk.

Cut-loading: Een handig hulpmiddel is voor de behandeling van de omvang van Gap Junction Tracer koppeling tussen het netvlies Neuronen (Video) | JoVE Journal

Cut-loading: Een handig hulpmiddel is voor de behandeling van de omvang van Gap Junction Tracer koppeling tussen het netvlies Neuronen

Meer video's verkennen