Name: Uitbreiding van de humane perifere bloed γδ T-cellen met behulp van zoledronaat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Leer een methode voor grootschalige expansie van humane perifere bloed γδ T-cellen met zoledronaat en IL-2 voor kankerimmunotherapie. Deze techniek gebruikt klinisch goedgekeurde middelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Isolatie van PBMC <ol><li> Draw bloed (7.5-8.0 ml) in een BD Vacutainer CPT celpreparaat Tube met Sodium Heparine. De buis bevat een natrium-heparine en een Ficoll-Hypaque dichtheid vloeistof, plus een polyester gel barrière die de twee vloeistoffen scheidt. Centrifugebuis / bloed bij kamertemperatuur (18 ° C tot 25 ° C) in een horizontale rotor (swing-out head) gedurende 20 min bij 1800 x g. Schakel centrifuge remmen uit. </li><li> Na het centrifugeren, de volgorde van lagen gebeurt als volgt (van boven naar beneden): a) plasma - b) perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) en bloedplaatjes - c) dichtheid oplossing - d) polyester gel - e) granulocyten - f) rode bloedcellen (afb. 1). </li><li> Verzamel een fractie van het plasma laag, waardoor 5 tot 10 mm van plasma boven de interfase zonder de cellaag. Het plasma kan worden gebruikt voor de cultuur (paragraaf 2.5). </li><li> Oogst de verrijkte fractie (PBMC) aan de interfase met een pipet en over te dragen aan een 15 ml conische buis. </li><li> Was de PBMC met 10 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), door het omkeren van de buis 5 keer, en centrifugeer 5 minuten bij 400 x g. </li><li> Tweemaal herhalen wassen stappen uit, waarna resuspendeer de celpellet in 5 ml PBS. Bepaal het aantal cellen. Meestal 1,3 x10 6 cellen worden gewonnen uit een ml volbloed. </li><li> Bepaal de frequentie en fenotype van γδ T-cellen in PBMC door flowcytometrie (deel 3) (afb. 2). </li></ol> 2. Uitbreiding van γδ T-cellen <ol><li> Centrifuge celsuspensies in 15 ml conische buizen gedurende 5 min bij 400 x g bij kamertemperatuur, en gooi de supernatant. </li><li> Bereid kweekmedium (CM) door het toevoegen van humaan IL-2 (IL-2) en zoledronaat (Zometa) tot eindconcentraties van 1000 IU / ml en 5 uM, respectievelijk. ALyS203 (Cell Science &amp; Technology Institute) of OPTMIZER (Invitrogen) media ondersteunen een goede uitbreiding van γδ T-cellen (meer informatie in de referenties 6 en 9). Zometa wordt geleverd in vloeibare vorm (4 mg/5-ml flacon). Ter voorbereiding op een 5 uM oplossing, voeg 50 ul van Zometa tot 30 ml kweekmedium. </li><li> Resuspendeer celpellet in kweekmedium en aan te passen aan 1x10 6 cellen / ml. </li><li> Pipetteer 1 ml van de CM met 1x10 6 cellen in elke well van een 24-well plaat. Voor grootschalige culturen, kunnen cellen worden gezaaid op 0,5 x 10 6 cellen / cm 2 op basis van de oppervlakte van de plaat putten, gerecht, of de kolf. </li><li> Dus voeg autoloog plasma (paragraaf 1.3), gepoolde humane AB sera, of FCS dat het ongeveer 10% van het volume van de cultuur (100 pi voor elk putje van een 24-wells plaat). Leg de platen in een vochtige 37 ° C, 5% CO 2 incubator gedurende 24-48 uur. </li><li> Handhaving van de cultuur op een cel dichtheid van 0,5 tot 2 x 10 6 cellen / ml. Voeg vers medium met humaan IL-2 (1000 IU / ml) alleen (zonder Zometa) om de 2-3 dagen, en overdracht van gekweekte cellen in nieuwe putten of flessen nodig, afhankelijk van de mate van celproliferatie (afb. 3). Levering plasma of serum aan het medium, zodat de serumconcentratie kan worden gehandhaafd ten minste 1%. </li><li> Oogst cellen op dag 12-14 en bepalen de frequentie, fenotype, en de functies van γδ T-cellen door flowcytometrie (zie hieronder). </li></ol> 3. Fenotypische analyse door flowcytometrie <ol><li> Transfer 200 ul monsters die 2 x 10 5 cellen om fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS) buizen. </li><li> Voeg 2 ml koud PBS en centrifugeer 5 minuten bij 400 x g. Dan, resuspendeer de pellets in 50 ul FACS buffer (PBS + 1% FCS + 0,1% natriumazide). Voeg 5 ul van elk antilichamen tegen de monsters (de monoklonale antilichamen zijn vermeld in tabel 1). </li><li> Incubeer op ijs in het donker gedurende 20 minuten. </li><li> Voeg 2 ml FACS buffer aan elk monster, en vervolgens vortex. Centrifuge monsters gedurende 5 min bij 400 x g bij 4 ° C. Decanteer zorgvuldig het supernatant. </li><li> Resuspendeer de cellen in 300 ul FACS buffer en vortex. Analyseer monsters op een flowcytometer (afb. 2). </li></ol> 4. IFN-γ productie test 10 <ol><li> De dag voor test, voor te bereiden stimulator cellen door het kweken van 3-5 x10 5 Daudi cellen / ml in RPMI 1640 medium plus 10% FCS (RPMI-10) 's nachts met Zometa (5 uM) (hierna aangeduid Z-Daudi). </li><li> Verzamel Z-Daudi en resuspendeer in RPMI-10 op 2x10 6 cellen / ml. Voeg 100 ul van de Z-Daudi (2x10 5) aan elk putje van een ronde bodem 96-well plaat. </li><li> Bereid γδ T-cellen op 2x10 6 cellen / ml in RPMI-10 bevat Brefeldine A bij 20 ug / ml. Breng 100 ul van γδ T-cel suspensie (2x10 5) aan elk putje met Z-Daudi cellen of om putten (100 ul RPMI-10 alleen, of RPMI-10 met 20 ng / ml forbol 12-myristaat 13-acetaat controle[PMA] plus 2 ug / ml van ionomycine). </li><li> Meng door en neer te pipetteren meerdere malen. Incubeer gedurende 4 uur in een 37 ° C, 5% CO 2 incubator. </li><li> Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 400 x g bij 4 ° C en resuspendeer de pellets in 200 ul van koude PBS. </li><li> Breng de monsters naar FACS buizen. Voeg 4 ml van de koude PBS en centrifugeer de buizen gedurende 5 min bij 400 x g bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de pellets in 50 ul van de FACS-buffer met FITC-geconjugeerd anti-TCRVγ9 (5 pl) en PE/Cy5-conjugated anti-CD3 mAb (2,5 pl). Incubeer beschermd tegen licht gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 100 ul van IntraPrep reagens 1 en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 4 ml PBS aan elke buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie en voeg 100 ul van IntraPrep reagens 2. Incubeer 5 min bij kamertemperatuur zonder schudden. </li><li> Voeg 5 ul van PE-geconjugeerd anti-IFN-γ mAb aan de reageerbuis. Incubeer beschermd tegen licht gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 4 ml PBS aan elke buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g bij kamertemperatuur. Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie en resuspendeer de cel pellet in 0,5 ml FACS buffer. </li><li> Analyseer de cellen door flowcytometer. Poort op CD3 + TCRVγ9 + cellen en onderzoekt de expressie van IFN-γ (afb. 4). </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Het is belangrijk om het percentage van γδ T-cellen in PBMC bepalen aan het begin van de cultuur. Zoals getoond in Fig. 2 A, het percentage van de CD3 + + TCRVγ9 γδ T-cellen in PBMC was 1,6% op dag 0. De dominante bevolkingsgroepen werden CD27 + + CD45RA naïef of CD27 + CD45RA - centrale geheugen fenotypes. Wanneer γδ T-cellen efficiënt gestimuleerd werden, vormden zij clusters op dag 3-5 (afb. 3 A en B). Toen clustervorming werd uitgesteld, de groei van andere celtypen, zoals CD4 + en CD8 + T-cellen of αβ NK-cellen kunnen de groei van γδ T-cellen (Fig. 3 C en D) domineren. Na 14 dagen van de cultuur, de frequentie van γδ T-cellen steeg tot meer dan 93,8% van de gekweekte cellen in een succesvolle γδ T-celculturen (fig. 2 E). De gekweekte γδ T-cellen opgereguleerd NKG2D en CD69 expressie (afb. 2 G en H). Ze worden weergegeven CD27 - CD45RA - effector geheugen fenotype (afb. 2 F). De functies van γδ T-cellen werden geëvalueerd met betrekking tot de cytokine productie en cytotoxiciteit. De intracellulaire IFN-γ vlekken aangetoond dat γδ T-cellen IFN-γ geproduceerd in reactie op de PMA / ionomycine behandeling of Z-Daudi cellen die opgebouwd IPP na zoledronaat behandeling (afb. 4). Deze resultaten geven aan dat zoledronaat efficiënt kunnen stimuleren en uit te breiden functionele γδ T-cellen. <table border="1"><tbody><tr><td> buis </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> ECD </td><td> PE/Cy5 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> CD3 </td><td> CD19 </td><td> CD45 </td><td> CD14 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> CD3 </td><td> TCRαβ </td><td> CD4 </td><td> CD8 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> CD3 </td><td></td><td></td><td> CD56 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> TCRαβ </td><td> CD45 </td><td> CD3 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> NKG2D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> CD69 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> muis IgG1 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> CD45RA </td><td> CD27 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> muis IgG1 </td><td> muis IgG1 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Monoklonale antilichamen gebruikt in de meerkleurige kleuring van γδ T-cellen. Een voorbeeld van de fenotypische analyse van γδ T-cellen uitgevoerd in ons laboratorium wordt getoond in Fig. 2. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Scheiding van PBMC. Bloed (7,5-8,0 ml) wordt getrokken in een BD Vacutainer CPT celpreparaat Tube met natriumheparine en direct gecentrifugeerd gedurende 20 min bij 1800 x g. Na het centrifugeren, de resulterende lagen gezien vanaf boven naar bottom: a) Plasma - b) PBMC en bloedplaatjes - c) Dichtheid oplossing - d) Polyester gel - e) Granulocyten - f) rode bloedcellen. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Typische oppervlakte fenotype van γδ T-cellen. PBMC werden gestimuleerd met zoledronaat en IL-2 voor 14 dagen. Cellen werden gekleurd met FITC-gelabeld anti-TCR Vγ9 en PE/Cy5-labeled anti-CD3 aan de uitbreiding van γδ T-cellen (A en E) monitor. γδ T-cellen werden geïdentificeerd door hun expressie van TCRVγ9, en hun expressie van CD27 en CD45RA (B en F), NKG2D (C en G), of CD69 (D en H) werd onderzocht. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Vertegenwoordiger γδ T-cel-culturen. PBMC werden gestimuleerd met IL-2 (1000 IU / ml) en zoledronaat (5 uM). Representatieve velden worden weergegeven (IX71 omgekeerde microscoop [Olympus] x 200). Clusters en aggregaten van γδ T-cellen kunnen worden waargenomen op dag 3 (A) en dag 5 (B), wanneer γδ T-cellen met succes werden uitgebreid. Daarentegen werden er geen clusters of aggregaten waargenomen wanneer γδ T-cel-groei is niet voldoende (C en D). <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. IFN-γ productie. γδ T-cellen werden geïncubeerd met RPMI-10 alleen (A) of PMA / ionomycine (B) of Z-Daudi (C) voor 4 uur. Eerst werd oppervlakte-expressie van TCRVγ9 gekleurd en IFN-γ toen de productie werd onderzocht door IFN-γ intracellulaire kleuring. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Kinetiek van γδ T-cel cultuur. (A) Absoluut aantal van de gekweekte cellen, (B) percentage van de γδ T-cellen, en (C) absolute aantal γδ T-cellen op de aangegeven tijdstippen.

<ol><li>Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3+T+cell+effector+functions%3A+a+blend+of+innate+programming+and+acquired+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).</li>
<li>Hintz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+%28E%29-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl+pyrophosphate+as+a+major+activator+for+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).</li>
<li>Gober, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T+cell+receptor+%CE%B3%CE%B4+cells+recognize+endogenous+mevalonate+metabolites+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells.</a> J Exp Med. 197, 163-168 (2003).</li>
<li>Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+of+gammadelta+T+cells+in+tumor+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology.</a> Cancer Res. 67, 5-8 (2007).</li>
<li>Roelofs, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+monocytes+are+responsible+for+gammadelta+T+cell+activation+induced+by+zoledronic+acid+through+accumulation+of+IPP%2FDMAPP%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP.</a> Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).</li>
<li>Dieli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+%CE%B3%CE%B4+T-lymphocyte+effector+functions+by+bisphosphonate+zoledronic+acid+in+cancer+patients+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo.</a> Blood. 102, 2310-2311 (2003).</li>
<li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronate+facilitates+large-scale+ex+vivo+expansion+of+functional+%CE%B3%CE%B4+T+cells+from+cancer+patients+for+use+in+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy.</a> Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).</li>
<li>Espinosa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+and+biological+activity+of+bromohydrin+pyrophosphate%2C+a+potent+stimulator+of+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells.</a> J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).</li>
<li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+profile+and+anti-tumor+effects+of+adoptive+immunotherapy+using+%CE%B3%CE%B4+T+cells+against+advanced+renal+cell+carcinoma%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study.</a> Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).</li>
<li>Murali-Krishna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+antigen-specific+CD8+T+cells%3A+a+reevaluation+of+bystander+activation+during+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection.</a> Immunity. 8, 177-187 (1998).</li>
<li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+culture+medium+on+the+expansion+of+T+cells+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy.</a> Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).</li>
<li>Abe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunological+evaluation+of+zoledronate-activated+V%CE%B39+%CE%B3%CE%B4T-cell-based+immunotherapy+for+patients+with+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma.</a> Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).</li>
<li>Nakajima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+study+of+adoptive+immunotherapy+for+recurrent+non-small-cell+lung+cancer+patients+with+autologous+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De hier gepresenteerde methode maakt een efficiënte uitbreiding van γδ T-cellen uit PBMC. γδ T-cellen geactiveerd en uitgebreid door zoledronaat en IL-2 te ontwikkelen compleet effector functies, weergegeven door cytokine productie en cytotoxiciteit. Het is gemeld dat de synthetische phosphoantigens bromohydrin pyrofosfaat (BrHPP) en 2-methyl-3-butenyl-1-pyrofosfaat (2M3B1PP) ook uit te breiden γδ T-cellen, maar ze zijn niet commercieel beschikbaar. In tegenstelling, is zoledronaat al een licentie voor klinische toepass...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens naam </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> ZOMETA </td><td> Novartis Pharma K. K </td><td></td><td> zoledronaat </td></tr><tr><td> Proleukin </td><td> Novartis Pharmaceuticals </td><td></td><td> humaan recombinant IL-2 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT celpreparaat Tube met natriumheparine </td><td> BD </td><td> 362753 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td><td></td></tr><tr><td> ALyS203-medium </td><td> Cell Science &amp; Technology Institute </td><td> 0301-7 </td><td></td></tr><tr><td> OPTMIZER </td><td> Invitrogen </td><td> 0080022SA </td><td></td></tr><tr><td> Brefeldine A </td><td> Sigma </td><td> B5936-200UL </td><td></td></tr><tr><td> forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) </td><td> Sigma </td><td> P1585-1mg </td><td></td></tr><tr><td> ionomycine </td><td> Sigma </td><td> 13909-1ml </td><td></td></tr><tr><td> IntraPrep </td><td> Beckman Coulter </td><td> A07803 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humaan CD3-FITC of PE/Cy5 </td><td> Beckman Coulter </td><td> A07746 FITC A07749 PE/Cy5 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humaan CD4-ECD </td><td> Beckman Coulter </td><td> 6604727 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humaan CD8-PE/Cy5 </td><td> Beckman Coulter </td><td> 6607011 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humaan CD14-PE/Cy5 </td><td> Beckman Coulter </td><td> A07765 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humaan CD19-PE </td><td> Beckman Coulter </td><td> A07769 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humaan CD45-ECD </td><td> Beckman Coulter </td><td> A07784 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humaan CD56-PE/Cy5 </td><td> Beckman Coulter </td><td> A07789 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humaan TCRαβ-PE </td><td> Beckman Coulter </td><td> A39499 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humaan TCR Vγ9-FITC </td><td> Beckman Coulter </td><td> IM1463 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humaan CD27-PE/Cy5 </td><td> Beckman Coulter </td><td> 6607107 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humaan CD45RA-ECD </td><td> Beckman Coulter </td><td> IM2711 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humaan CD69-PE </td><td> BD </td><td> 555531 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humaan NKG2D-PE </td><td> Beckman Coulter </td><td> A08934 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humal IFNy-PE </td><td> Beckman Coulter </td><td> IM2717U </td><td></td></tr><tr><td> Muis IgG1 isotype controle-PE </td><td> Beckman Coulter </td><td> A07796 </td><td></td></tr><tr><td> Muis IgG1 isotype controle-ECD of PE/Cy5 </td><td> Beckman Coulter </td><td> A07797 A07798 </td><td></td></tr></tbody></table>

uitbreiding van de humane perifere bloed γδ t-cellen met behulp van zoledronaat

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Menselijke γδ T-cellen kunnen herkennen en reageren op een breed scala van stress-geïnduceerde antigenen, waardoor het ontwikkelen van aangeboren brede anti-tumor-en anti-infectueuze activiteit. 1 De meerderheid van de γδ T-cellen in het perifere bloed hebben de Vγ9Vδ2 T-cel-receptor. Deze cellen herkennen antigeen in een grote histocompatibiliteitscomplex-onafhankelijke wijze en ontwikkelen van sterke cytolytische en Th1-like effector functies. 1 Daarom, γδ T-cellen zijn aantrekkelijke kandidaat effector cellen voor immunotherapie van kanker. Vγ9Vδ2 T-cellen reageren op phosphoantigens zoals (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrofosfaat (HMBPP), dat wordt gesynthetiseerd in bacteriën via isoprenoide biosynthese, 2 en isopentenyl pyrofosfaat (IPP), dat wordt geproduceerd in eukaryote cellen door middel van de mevalonate pad. 3 In fysiologische toestand, de generatie van het IPP in nontransformed cel is niet voldoende voor de activatie van γδ T-cellen. Ontregeling van mevalonaat route in tumorcellen leidt tot een ophoping van IPP en γδ T-cellen te activeren. 3 Omdat aminobifosfonaat (zoals pamidronaat of zoledronaat) remmen farnesyl pyrofosfaat synthase (FPP), het enzym optreedt stroomafwaarts van IPP in de mevalonate route, intracellulaire niveaus van IPP en sensitibity te γδ T-cellen erkenning kan therapeutisch worden verhoogd door aminobifosfonaat. IPP accumulatie is minder efficiënt in nontransfomred cellen dan tumorcellen met een farmacologisch relevante concentratie van aminobifosfonaat, die ons in staat immunotherapie voor kanker door het activeren van γδ T-cellen met aminobifosfonaat. 4 Interessant, IPP zich ophoopt in monocyten wanneer PBMC worden behandeld met aminobifosfonaat, omwille van een efficiënte drug opname door deze cellen. 5 Monocyten die IPP accumuleren worden antigeen-presenterende cellen en stimuleren Vγ9Vδ2 T-cellen in het perifere bloed. 6 Op basis van deze mechanismen, hebben we een techniek ontwikkeld voor grootschalige uitbreiding van γδ T-celculturen met behulp van zoledronaat en interleukine -2 (IL-2). 7 Andere methoden voor de uitbreiding van γδ T-cellen maken gebruik van de synthetische phosphoantigens bromohydrin pyrofosfaat (BrHPP) 8 of 2-methyl-3-butenyl-1-pyrofosfaat (2M3B1PP). 9 Al deze methoden ex toelaten vivo-expansie, wat resulteert in grote aantallen γδ T-cellen voor gebruik in de adoptieve immunotherapie. Echter alleen zoledronaat is een FDA-goedgekeurde commercieel verkrijgbaar reagens. Zoledronaat-geëxpandeerde γδ T-cellen weer te geven CD27 - CD45RA - effector geheugen fenotype en hun functie kan worden geëvalueerd door IFN-γ productie test 7.

Een methode om γδ T-cellen uit het perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) uit te breiden wordt beschreven. PBMC-afgeleide γδ T-cellen worden gestimuleerd en uitgebreid met behulp van zoledronaat en interleukine-2 (IL-2). Grootschalige uitbreiding van γδ T-cellen kunnen worden toegepast op autologe cellulaire immunotherapie van kanker.

Uitbreiding van de humane perifere bloed γδ T-cellen met behulp van zoledronaat

Menselijke $\gamma\delta$ T-cellen kunnen een grote verscheidenheid aan stress-geïnduceerde antigenen herkennen en daarop reageren, waardoor ze een aangeboren brede antitumor- en ...

Deze video demonstreert de grootschalige expansie van menselijke perifere bloed gamma delta T-cellen met behulp van zoledronaat. Eerst wordt volbloed onderworpen aan dichtheidsgradiëntcentrifugatie om perifere bloed mononucleaire cellen of PBMC's te isoleren. De PBMC's worden gestimuleerd met zoledronaat om monocyten te laten fungeren als antigeenpresenterende cellen, en tevens met IL-2 om gamma delta T-cellen te stimuleren.De cellen worden tot 14 dagen geïncubeerd om gamma delta T-cellen te prolifereren. De analyse van de cultuur via flowcytometrie laat zien dat de meerderheid van de geoogste cellen een CD3-positief Vγ9-positief fenotype vertoont. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van de bestaande methode is dat deze al is gelicenseerd voor klinische toepassingen bij Zometa.Daarom is er een betrouwbaar reagens gemakkelijk beschikbaar voor de klinische preparatie van gamma delta T-cellen, wat aantoont dat de procedure zal worden uitgevoerd door makoto condo en amichi izumi celkweek. Technici uit mijn laboratorium beginnen deze procedure door perifere mononucleaire bloedcellen te isoleren uit volbloed, verzameld in een BD vacutainer CPT celpreparatiebuis met natriumheparine als antistollingsmiddel, en een vloeistof met een hoge dichtheid, plus een polyester gelbarrière die de twee vloeistoffen scheidt. Centrifugeer het monster op kamertemperatuur in een horizontale swing-out rotor gedurende 20 minuten bij 1800 ×g. Na het centrifugeren en het uitschakelen van de rem zullen de inhouden van de buis zijn gescheiden in vijf lagen.De bovenste gele laag bestaat uit plasma. Daaronder bevat een witachtige laag perifere mononucleaire bloedcellen en bloedplaatjes, die bovenop de lichtgele dichtheidsoplossing liggen. Een witte polyestergellaag scheidt dit van de granulocyten, die een grijze laag vormen bovenop de rode bloedcellen aan de onderzijde van de buis.Gebruik een pipette van twee milliliter om voorzichtig een fractie van de plasmalaag te verzamelen, waarbij vijf tot 10 millimeter plasma boven de interface blijft, en breng deze over in een conische buis van 15 milliliter. Bewaar de buis bij vier graden Celsius om te gebruiken voor de cultuur. Gebruik vervolgens een pipette van twee milliliter om de met PBMC verrijkte fractie bij de interface te oogsten en breng deze over in een conische buis van 15 milliliter.Om de PBMC te wassen, voegt u 10 milliliters PBS toe en keert u de buis vijf keer om. Centrifugeer de buis vervolgens vijf minuten bij 400 ×g. Herhaal de wasstappen tweemaal. Resuspendeer daarna de celpellet in vijf milliliters PBS en gebruik een hemocytometer om het aantal cellen te bepalen.Typisch worden 1,3 × 10⁶ cellen teruggewonnen uit één milliliter volbloed. Een fractie pbmc met 1 × 10⁶ cellen wordt gescheiden en op ijs bewaard voor analyse via flowcytometrie.Om de gamma delta T-cellen in het PBMC-monster te expanderen, worden de cel-suspensies in 15 milliliter conische buizen gedurende vijf minuten gecentrifugeerd bij 400 ×g bij kamertemperatuur. Gooi na het centrifugeren de supernatanten weg en resuspendeer de cellen in celkweekmedium, aangevuld met 1000 IU per milliliter IL-2 en 5 µM zoledronaat bij een dichtheid van 1 × 10⁶ cellen per milliliter. Zoledronaat remt farnesylpyrofosfaatsynthase in monocyten, wat leidt tot de accumulatie van isopentenylpyrofosfaat en de verschuiving van monocyten naar antigeen-presenterende cellen.Gebruik vervolgens een pipette. Breng 1 mL medium dat 1 × 10⁶ cellen bevat aan in elke put van een 24-wells plaat; de celconcentratie moet 0,5 × 10⁶ cm⁻² bedragen. Schaal dit voor grotere culturen dienovereenkomstig naar elke put van een 24-wells plaat.Voeg ofwel de eerder verzamelde 100 µL autoloog plasma, gepoolde menselijke AB-serum of FBS toe. Plaats de platen elke twee tot drie dagen in een bevochtigde 37 °C 5% CO2-incubator. Vervang het medium door vers serum-gesupplementeerd medium dat 1000 IU per milliliter menselijke IL-2 bevat.Wanneer de cellen een dichtheid van 0,5 tot 2 × 10⁶ cellen per milliliter bereiken, kunnen ze in een verhouding van een op twee worden overgeplaatst naar nieuwe putjes of flasks. Observeer de cellen gedurende meerdere dagen. Hier worden de cellen op dag nul getoond.De kleinere cellen zijn lymfocyten. De grotere cellen zijn monocyten. Ongeveer 24 uur later hechten de monocyten zich aan de bodem van de put.Na twee dagen hechten sommige lymfocyten zich aan monocyten; tegen de derde dag beginnen gamma delta T-cellen clusters te vormen. Na vijf dagen zijn grote clusters van cellen zichtbaar. In tegenstelling hiermee zullen er geen clusters of aggregaten worden waargenomen wanneer de groei van gamma delta T-cellen onvoldoende is. Wanneer de clustervorming is vertraagd.Zoals hier wordt getoond, domineert de groei van andere celtypen, zoals CD4-positieve of CD8-positieve alfa-bèta T-cellen of NK-cellen, de groei van gamma-delta T-cellen. Pipetteer de cellen op dag 12 tot 14 uitgebreid met een 10 milliliter pipette en oogst de cellen in 50 milliliter conische buizen. De cellen kunnen nu worden geanalyseerd met flowcytometrie om de frequentie, het fenotype en de functies van gamma-delta T-cellen te bepalen.Om een fenotypische analyse van PBMC's of geëxpandeerde gamma delta T-cellen uit te voeren, begint u met het overbrengen van monsters van 200 µL met 2 × 10⁵ cellen naar elk van de negen fluorescentie-geactiveerde cel-sorteertubes. Voeg 2 mL koud PBS toe en centrifugeer vijf minuten bij 400 ×g; resuspendeer de pellets vervolgens in 50 µL FACS-buffer en voeg 5 µL van elk van de vereiste antilichamen toe aan de monsters.Incubeer de monsters op ijs in het donker gedurende 20 minuten. Voeg na de incubatie twee milliliter FACS-buffer toe aan elk monster, en centrifugeer de monsters vervolgens gedurende vijf minuten bij 400 ×g bij vier °C met een vortex-centrifuge. Giet na het centrifugeren voorzichtig de supernatant af, resuspendeer de cellen in 300 µL FACS-buffer en vortex.Analyseer vervolgens de monsters op een flowcytometer om de functie van gamma delta T-cellen te evalueren. Hun vermogen om interferon gamma te produceren wordt geanalyseerd via intracellulaire interferon gamma-kleuring. Resuspendeer gamma delta T-cellen bij 2 × 10⁶ cellen per milliliter in RPMI 1640 met felden A bij 20 µg/mL.Felden A remt de secretie van interferon gamma, wat leidt tot de accumulatie van interferon gamma in de cel. Draag vervolgens 100 µL van de gamma delta T-cel suspensie over naar elke put van een 96-well plaat die 100 µL bevat van enkel RPMI 10, of RPMI 10 met 20 ng/mL van four. Ball 12 ate 13 acetate plus 2 µg/mL ionomycine of Z duddy cellen.Meng door meerdere malen met de pipet op en neer te zuigen. Incubeer gedurende vier uur in een incubator op 37 °C met 5% koolstofdioxide. Centrifugeer de plaat vervolgens gedurende vijf minuten bij 400 ×g bij 4 °C, en resuspendeer de pellets in 200 µL koud PBS.Breng de monsters over naar FACS-buizen. Voeg vervolgens vier milliliter koud PBS toe en centrifugeer de buizen vijf minuten bij 400 ×g bij vier graden Celsius. Resuspendeer na het centrifugeren de pellets in 50 µL FACS-buffer met vijf microliters.Incubeer FE-geconjugeerd anti-TCRV gamma negen en 2,5 µL PE-Cy5-geconjugeerd anti-CD3 monoklonaal antilichaam gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Voeg na de incubatie 100 µL intra prep reagens 1 toe en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vier ml PBS toe aan elke buis en centrifugeer vijf minuten bij 400 ×g bij kamertemperatuur. Resuspendeer na het centrifugeren het pellet in 100 µL intra prep reagens 2 en incubeer vijf minuten.Voeg bij kamertemperatuur vijf µL PE-geconjugeerd anti-interferon gamma monoklonaal antilichaam toe aan de reageerbuis. Incubeer gedurende 15 minuten, beschermd tegen licht. Voeg bij kamertemperatuur vier mL PBS toe aan elke buis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 400 ×g. Verwijder bij kamertemperatuur het supernatant door aspiratie en resuspendeer de celpellet.In 0,5 milliliters fax-buffer. Analyseer de cellen via flowcytometrie, selecteer de CD3-positieve TCR v gamma nine-positieve cellen en onderzoek de expressie van interferon gamma. Het typische oppervlaktefenotype van gamma delta T-cellen wordt hier gedemonstreerd.Gamma delta T-cellen werden op dag nul geïdentificeerd op basis van hun expressie van CD3 en TCRV gamma nine. Het percentage CD3-positieve TCRV gamma nine-positieve gamma delta T-cellen in PBMC was 1,6%. De dominante populaties gamma delta T-cellen vertoonden CD27-positieve, CD45 RA-positieve naïeve, of CD27-positieve, CD45 RA-negatieve centrale geheugenfenotypes. De expressies van CD27 en CD45 RA worden gebruikt om hun naïeve of geheugenfenotype te bepalen.CD 27 positief. CD 45. RA positief is naïef.CD 27 positief. CD 45 RA negatief is centraal geheugen CD 27 negatief. CD 45.RA-negatief is effector memory. CD 27-negatief. CD 45.RA-positief is het terminaal gedifferentieerde fenotype. De activatiestatus van de cellen werd geanalyseerd aan de hand van NK G 2D of CD 69, zoals hier wordt getoond. Gamma delta T-cellen tot expressie brengen NK G 2D, maar geen CD 69.Na 14 dagen cultuur was de frequentie van gamma delta T-cellen toegenomen tot meer dan 93,8% van de gecultiveerde cellen. In succesvolle gamma delta T-celculturen vertoonden zij een CD 27-negatief CD 45 RA-negatief effector memory-fenotype. De gecultiveerde gamma delta T-cellen vertoonden een upregulatie van de expressie van nkg 2D en CD 69.De intracellulaire kleuring voor interferon gamma toonde aan dat gamma delta T-cellen interferon gamma produceerden als reactie op behandeling met PMA CIN of Z dwy-cellen die IPP hadden opgehoopt. Na behandeling met zoledronaat produceerden 97% en 19,6% van de gamma delta T-cellen interferon gamma in reactie op respectievelijk PMA CIN- en Z ddy-celstimulatie. Deze resultaten geven aan dat zoledronaat functionele gamma delta T-cellen efficiënt kan stimuleren en expanderen.De kinetiek van de gamma delta T-celcultuur uitgebreid met zoledronaat en IL-2 laat zien dat het absolute aantal gecultiveerde cellen exponentieel toenam tot 12 tot 14 dagen. Verrijking van gamma delta T-cellen werd relatief vroeg bereikt. Tegen dag zeven was bijna 80% van de gecultiveerde cellen gamma delta T-cellen. Het absolute aantal gamma delta T-cellen op de aangegeven tijdstippen demonstreert dat ongeveer 2,2 x 10⁸ gamma delta T-cellen verkregen kunnen worden uit 1 x 10⁶ PPMC die 1,6 x 10⁴ gamma delta T-cellen bevatten na hun ontwikkeling.Deze techniek plaveit de weg voor onderzoekers op het gebied van kankerimmunotherapie om klinische toepassingen bij vele verschillende soorten kanker te verkennen. Deze kweekmethode is gebruikt in klinische studies in fase één om de veiligheid en haalbaarheid van de overdracht van geëxpandeerde gamma delta T-cellen van donoren bij patiënten met kanker te evalueren.

expansion-of-human-peripheral-blood-t-cells-using-zoledronate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Ex vivo Uitbreiding van Tumor-reactieve T-cellen door middel van Bryostatin 1/Ionomycin en de Gemeenschappelijke Gamma Chain Cytokines Formulering

Hier beschrijven we een methode om efficiënt uit te breiden en te zuiveren van grote aantallen menselijke NK-cellen en beoordelen hun functie.

Uitbreiding, zuivering, en functionele beoordeling van de humane perifere bloed NK-cellen

De differentiatie van precursorcellen in osteoclasten wordt gereguleerd door cytokinen en groeifactoren. Hier worden een nieuwe genoverdrachtstechniek voor differentiatie van osteoclasten in vivo en celkweekprotocollen voor het differentiëren van precursorcellen in osteoclasten in vitro beschreven als een methode om de effecten van cytokinen op osteoclastogenese te bestuderen.

A Novel In vivo Gene Transfer Techniek en In vitro Cel-gebaseerde testen voor de studie van botverlies bij musculoskeletale aandoeningen

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een in vitro menselijke preklinische model van osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten gekweekt met borst kanker cellijnen na te bootsen de kanker cel-osteoclast interactie. Het model kan worden gebruikt om verdere van ons begrip van metastase biomineralisatie en therapeutische opties te verbeteren.

Ontwikkeling van een menselijke preklinische Model van Osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten mede gekweekt met borst kanker cellijnen

Hier presenteren we een protocol voor het opwekken en scoren van ziekten in een Xenogenic graft-versus-hostziekte (xenoGVHD) model. xenoGVHD biedt een in vivo model om immunosuppressie van menselijke T-cellen te bestuderen. Daarnaast beschrijven we hoe we menselijke T-cellen in weefsels met digitale PCR kunnen detecteren als een hulpmiddel om immunosuppressie te kwantificeren.

Inductie en scoren van transplantaat-versus-gastheer ziekte in een xenogene Murine model en kwantificering van menselijke T cellen in muizen weefsels met behulp van digitale PCR

We beschrijven een humaan perifeer bloed mononucleaire cel (PBMC) — op basis van gehumaniseerd xenotransplantaatmodellen is muismodel voor translationeel immuno-oncologisch onderzoek. Dit protocol kan dienen als een algemene richtlijn voor het vaststellen en karakteriseren van vergelijkbare modellen voor I-O-therapie beoordeling.

Een humane perifere bloed mononucleaire cel (PBMC) Engrafted gehumaniseerd xenograft model voor translationele immuno-oncologie (I-O) onderzoek

Graft-versus-host ziekte is een belangrijke complicatie na allogene beenmergtransplantatie. Dendritische cellen spelen een cruciale rol in de pathogenese van graft-versus-host ziekte. Het huidige artikel beschrijft een nieuw beenmergtransplantatieplatform om de rol van dendritische cellen te onderzoeken bij de ontwikkeling van graft-versus-host ziekte en het graft-versus-leukemie-effect.

Beenmergtransplantatie Platform om de rol van dendritische cellen in graft-versus-host ziekte te onderzoeken

Gepresenteerd is een protocol voor de uitbreiding van Gamma-Delta (γδ) T-cel geneesmiddel product. Lymfocyten worden geïsoleerd door elutriatie en γδ-verrijkt met zoledroninezuur en interleukine-2. Alfa-bèta T-cellen worden uitgeput met behulp van een magnetisch scheidingsapparaat van klinische kwaliteit. De γδ-cellen worden samen met K562-afgeleide, kunstmatige antigeen-presenterende cellen en uitgebreid.

Uitbreiding en verrijking van gamma-delta (γδ) T-cellen uit ontfereend menselijk product

Osteoclasten zijn belangrijke bot-resorberende cellen in het lichaam. Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor de in vitro differentiatie van osteoclasten van menselijke perifere bloedmonocyten. Deze methode kan worden gebruikt als een belangrijk hulpmiddel om de biologie van osteoclasten in homeostase en bij ziekten verder te begrijpen.

Differentiatie van functionele osteoclasten van humaan perifeer bloed CD14+ monocyten

Hier hebben we in vivo osteo-organoïden ontwikkeld die worden getriggerd door botmorfogenetische eiwit-2-geladen gelatineschars om therapeutische hematopoëtische stam-/voorlopercellen te oogsten voor de reconstructie van een beschadigd hematopoëtisch en immuunsysteem. Over het algemeen kan deze aanpak een veelbelovende celbron zijn voor celtherapieën.

In vivo osteo-organoïde benadering voor het oogsten van therapeutische hematopoëtische stam-/voorlopercellen

Leer een methode voor grootschalige expansie van humane perifere bloed γδ T-cellen met zoledronaat en IL-2 voor kankerimmunotherapie. Deze techniek gebruikt klinisch goedgekeurde middelen.

Uitbreiding van de humane perifere bloed γδ T-cellen met behulp van zoledronaat

Meer video's verkennen