Name: Isolatie van CD133 + lever stamcellen voor klonale expansie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Leer CD133+ leverstamcellen isoleren uit muizenlever voor klonale expansie en functionele analyse. Deze methode combineert weefseldigestie, magnetische afrijning en flowcytometrie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr Rountree erkent de huidige steun van de Children&#39;s Miracle Network, National Institute of Health, K08DK080928 en R03DK088013, en de American Cancer Society Research Scholar Award, MGO-11651. Dr Rountree erkent dat deze procedure in eerste instantie werd ontwikkeld en verfijnd, terwijl gefinancierd door de Pediatric Scientist Development Program (NICHD Grant Award K12-HD00850).

<ol><li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD133-expressing+murine+liver+oval+cell+population+with+bilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential.</a> Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).</li>
<li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+liver+cancer+stem+cells+from+methionine+adenosyl+transferase+1A-deficient+mice+demonstrate+resistance+to+transforming+growth+factor+%28TGF%29-beta-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">CD133+ liver cancer stem cells from methionine adenosyl transferase 1A-deficient mice demonstrate resistance to transforming growth factor (TGF)-beta-induced apoptosis.</a> Hepatology. 49, 1277-1286 (2009).</li>
<li>Rountree, C. B., Ding, W., He, L., Stiles, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+CD133-expressing+liver+cancer+stem+cells+in+liver-specific+phosphatase+and+tensin+homolog+deleted+on+chromosome+10-deleted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Expansion of CD133-expressing liver cancer stem cells in liver-specific phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10-deleted mice.</a> Stem Cells. 27, 290-299 (2009).</li>
<li>Rountree, C. B., Senadheera, S., Mato, J. M., Crooks, G. M., Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+liver+cancer+stem+cells+during+aging+in+methionine+adenosyltransferase+1A-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Expansion of liver cancer stem cells during aging in methionine adenosyltransferase 1A-deficient mice.</a> Hepatology. 47, 1288-1297 (2008).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> J. Cell. Physiol. 213, 286-300 (2007).</li>
<li>Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> Hepatology. 43, 45-53 (2006).</li>
<li>Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+Stem+Cells.+III.+Emergent+themes+of+liver+stem+cell+biology%3A+niche%2C+quiescence%2C+self-renewal%2C+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal Stem Cells. III. Emergent themes of liver stem cell biology: niche, quiescence, self-renewal, and plasticity.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290, 189-193 (2006).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+liver+repopulating+capacity+of+murine+oval+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells.</a> Proc Natl Acad Sci U. S. A. 100, 11881-11888 (2003).</li>
<li>Greenbaum, L. E., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+stem+cells+in+liver+repair+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of stem cells in liver repair and fibrosis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 222-229 (2011).</li>
<li>Choi, S. S., Omenetti, A., Syn, W. K., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Hedgehog+signaling+in+fibrogenic+liver+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of Hedgehog signaling in fibrogenic liver repair.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 43, 238-244 (2011).</li>
<li>Khurana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scopolamine+treatment+and+muscarinic+receptor+subtype-3+gene+ablation+augment+azoxymethane-induced+murine+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Scopolamine treatment and muscarinic receptor subtype-3 gene ablation augment azoxymethane-induced murine liver injury.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 333, 639-649 (2010).</li>
<li>Sell, S., Leffert, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Liver cancer stem cells.</a> J. Clin. Oncol. 26, 2800-2805 (2008).</li>
<li>Lee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+prognostic+subtype+of+human+hepatocellular+carcinoma+derived+from+hepatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells.</a> Nat. Med. 12, 410-416 (2006).</li>
<li>Sell, S., Dunsford, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+stem+cell+origin+of+hepatocellular+carcinoma+and+cholangiocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evidence for the stem cell origin of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma.</a> Am. J. Pathol. 134, 1347-1363 (1989).</li>
<li>Amin, R., Mishra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+stem+cells+and+tgf-Beta+in+hepatic+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liver stem cells and tgf-Beta in hepatic carcinogenesis.</a> Gastrointest Cancer Res. 2, 27-30 (2008).</li>
<li>Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor%2Fstem+cells+give+rise+to+liver+cancer+due+to+aberrant+TGF-beta+and+IL-6+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Progenitor/stem cells give rise to liver cancer due to aberrant TGF-beta and IL-6 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci. 105, 2445-2450 (2008).</li>
<li>Kitisin, K., Pishvaian, M. J., Johnson, L. B., Mishra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+stem+cells+and+molecular+signaling+pathways+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liver stem cells and molecular signaling pathways in hepatocellular carcinoma.</a> Gastrointest Cancer Res. 1, 13-21 (2007).</li>
<li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+fails+to+differentiate+into+liver+epithelium+during+murine+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bone marrow fails to differentiate into liver epithelium during murine development and regeneration.</a> Hepatology. 45, 1250-1260 (2007).</li>
<li>Shimano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+oval+cells+have+the+side+population+phenotype+defined+by+expression+of+ATP-binding+cassette+transporter+ABCG2%2FBCRP1%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expression of ATP-binding cassette transporter ABCG2/BCRP1.</a> Am J Pathol. 163, 3-9 (2003).</li>
<li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+isolation+and+clonal+identification+of+self-renewing+bipotent+hepatic+progenitor+cells+in+adult+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric isolation and clonal identification of self-renewing bipotent hepatic progenitor cells in adult mouse liver.</a> Hepatology. , (2008).</li>
<li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+and+characterization+of+self-renewing+pluripotent+stem+cells+in+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver.</a> J Cell Biol. 156, 173-184 (2002).</li>
<li>Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM-positive+hepatocellular+carcinoma+cells+are+tumor-initiating+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+features%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features.</a> Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).</li>
<li>Yamashita, T., Budhu, A., Forgues, M., Wang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hepatic+stem+cell+marker+EpCAM+by+Wnt-beta-catenin+signaling+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-beta-catenin signaling in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 67, 10831-10839 (2007).</li>
<li>Furuyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cell+supply+from+a+Sox9-expressing+progenitor+zone+in+adult+liver%2C+exocrine+pancreas+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine.</a> Nat Genet. 43, 34-41 (2011).</li>
<li>Kordes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+hepatic+stellate+cells+are+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 410-417 (2007).</li>
<li>Berg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Growth+Factor+10+is+critical+for+liver+growth+during+embryogenesis+and+controls+of+hepatoblast+survival+via+b-catenin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Growth Factor 10 is critical for liver growth during embryogenesis and controls of hepatoblast survival via b-catenin activation.</a> Hepatology. , (2007).</li>
<li>Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+stem+cell+and+maturational+liver+lineage+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology.</a> Hepatology. 53, 1035-1045 (2011).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+restriction+of+human+hepatic+stem+cells+to+mature+fates+is+made+efficient+by+tissue-specific+biomatrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds.</a> Hepatology. 53, 293-305 (2011).</li>
<li>Galicia, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+hepatic+tumor+progenitor+cells+in+Pten-null+mice+requires+liver+injury+and+is+reversed+by+loss+of+AKT2%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2.</a> Gastroenterology. 139, 2170-2182 (2010).</li>
<li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+of+murine+liver+tumor+cells+promotes+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion.</a> Hepatology. 52, 945-953 (2010).</li>
</ol>

Dr Rountree krijgt ondersteuning van het onderzoek van Bayer Farmacie. Drs. Ding en Crooks en mevrouw Dang en mevrouw VanKirk hebben geen mededelingen te melden.

In tegenstelling tot de hematopoietische systeem, waarin hematopoietische stamcellen zijn verantwoordelijk voor een systeem dat celdifferentiatie replacesnormal fysiologische omzetsnelheid van leukocyten, rode bloedcellen en bloedplaatjes leverstamceltechnologie of volwassen progenitorcellen, niet deelnemen in normale lever homeostase. 5,6 Na acute leverbeschadiging of gedeeltelijke hepatectomie, hepatocyten, zoals gedifferentieerde lever epitheel, ondergaan verschillende rondes van proliferatie om de verloren lever massa te vervangen. 5,6 Alleen tijdens chronische blessure zijn lever waargenomen stamcellen te vermenigvuldigen. 1,5 -11 Deze volwassen, orgaan-specifieke stamcellen voorgesteld te differentiëren tot zowel hepatocyten en cholangiocyten. 1,5-8 Interessant is dat de overgrote meerderheid van leverkanker ontwikkelt zich op de achtergrond van chronische schade, en dus lever stamcellen ook hypothese te de voorlopers voor een subset van leverkanker. 2-4,12-17 One van de belangrijkste uitdagingen naar cel werk voort in de lever is isolatie van zeldzame populaties van cellen voor functionele analyse. Bijvoorbeeld, de meeste cellen in de lever hepatocyten, die aanzienlijk groter zijn dan cholangiocyten en kleinere niet-parenchymale cellen. Door het breken van de gehele lever in celcompartimenten (grote hepatocyten - parenchymale fractie en kleinere cellen - niet-parenchymale fractie), en verder selecteren van CD45 negatieve cellen (niet-hematopoëtische cellen), kunnen wij de startpopulatie van stamcellen verrijken meer dan 600-voudige. 1,18-21 We merken wij geenszins aangeeft dat de CD133 + populatie is een 100% zuiver stamcelpopulatie, maar duidelijk een heterogene populatie van cellen met verschillende afkomst en herbevolking potentieel. Een van de belangrijkste beperkingen van het veld definities van stamcellen en progenitorcellen. We gebruiken de term &quot;stamcel&quot; ruimer in dit werk, maar in strikte definitie, CD133 + niet-parenchymal cellen vormen een bi-lijn stamvader bevolking. Gezien de stand van de huidige stam en progenitor onderzoek in de lever, dit rapport geeft wel een startplaats voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in dit gebied. Als nieuwe markers ontstaan ​​zoals EpCAM, 22,23 of transcriptiefactoren, zoals Sox9, 24 kunnen worden opgenomen. Zo hebben we een vrij hoge mate van overlap tussen EpCAM + CD133 + cellen en cellen. In dit rapport hebben we detail een werkwijze voor de stamcel los van de normale muizen lever en chronische leverschade modellen, die aantonen verhoogde lever stamcel proliferatie. Deze methode heeft duidelijke voordelen ten opzichte van standaard immunohistochemie bevroren of formaline gefixeerde lever functionele studies met levende cellen kan worden uitgevoerd na isolatie. 1,3,4 Het specifieke doel van deze werkwijze is het isoleren van een relatief zuivere populatie lever stamcellen die kunnen klonaal worden uitgebreid in vitro. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; De belangrijkste beperking van deze procedure is dat de meerderheid van de geïsoleerde cellen niet levensvatbaar zal zijn na flowcytometrie (zie Problemen oplossen sectie). Dit is het gevolg van de uren nodig om de cellen te bereiden en de talrijke procedures nodig zijn om de populatie te verfijnen voor isolatie. Als de lever verteerd in enkele celsuspensie voor onmiddellijke FACS analyse zal het verschil in grootte tussen hepatocyten en andere niet-parenchymale cellen te creëren effectieve FACS gate onmogelijk. Als de lever niet-parenchymale cellen worden gebruikt, zonder uitsluiting van hematopoietische cellen, bestaat het risico dat een aanzienlijk aantal CD133 + cellen kunnen van hematopoietische oorsprong kan de fractie verontreinigen. Bovendien door verwerking van de cellen door de Miltenyi filter worden alleen enkele cellen en zeer kleine clusters van cellen verzameld. Dit zorgt ervoor dat het monster niet zal verstoppen de FACS inname naald. Alternatieven voor deze procedure omvatten mIJZIGING aan alternatieve celoppervlaktemarker, zoals CD49f, EpCAM of combinatie van merkers, zoals CD133 + + EpCAM Een tweede gepubliceerd rapport gebruikt een dichtheidsgradiënt de lever stamcellen te isoleren uit een niet-parenchymale fractie. Deze procedure vereist een Ultra-centrifuge (8000 xg), voegt aanzienlijke tijd om de procedure en in onze ervaring, aanzienlijk verminderd pre-FACS cellulaire opbrengst en post-FACS levensvatbaarheid. 8 Toekomstige experimenten een breder gamma van genexpressie analyse, inclusief foetale lever genen, zoals HNF3, HNF4α en αfp.In Bovendien Western blot analyse en immunocytochemie van tot expressie gebrachte eiwitten kunnen worden gebruikt voor RT-PCR resultaten van cellen in kweek te bevestigen. Een probleem om op te merken is recent werk dat CD133 expressie geïdentificeerd op leverstellaatcellen. 25 We hebben nu routinematig onze monsters te screenen op markers van stellaatcellen (zie Problemen oplossen sectie), en hebben niet identified aanzienlijke verontreiniging in onze fracties. Dit kan verband houden met verschillende technieken van lever spijsvertering en celisolatie. 2,3,26 Gebaseerd op het feit dat de meeste cellen niet levensvatbaar onmiddellijk na isolatie FACS raden wij de cellen uitgeplaat zijn, als bulk CD133 + cellen of enkele cellen, voor gebruik bij dieren. 5-7 dagen in vitro geeft significant betere resultaten van de tumor analyse. Bovendien, gezien de ontberingen van enkele cel isolatie, moet deze alleen worden uitgevoerd zodra kolonies kan worden uitgebreid van bulk CD133 + geïsoleerde cellen. Een uitvoerige bespreking van de verschillende kweekomstandigheden en scaffold proteïnen die kunnen worden gebruikt voor cultuur lever stam-en progenitorcellen is goed gekarakteriseerd door Lola Reid. Dit werk biedt alternatieve voorwaarden en wijzigingen, die onderzoekers kunnen nemen in hun onderzoeksprogramma keer elementaire isolatietechnieken worden beheerst. 27,28 Dr Reid&#39;s work biedt ook een meer gedetailleerde analyse van het geslacht biologie en rijping tussen hepatische stamcellen en daarvoor bestemde voorlopercellen. In termen van in vivo tumor analyse hebben we succes gehad met vers geïsoleerde cellen en cellen van klonaal geëxpandeerd CD133 + cellen in vitro, voornamelijk met 1x10 6 cellen. We hebben ons gericht ontwo genetische stammen van chronische leverschade, de MAT1a - / - en de lever specifieke PTEN - / - muizen, en we hebben gebruik gemaakt van zowel naakt muizen en wild-type muizen als gastheren voor tumorgroei. In onze ervaring, zal CD133 + lever stamcellen maken alleen tumoren gebruikt als ze geïsoleerd zijn van aanzienlijke leverbeschadiging modellen die pre-maligne. Merk op dat de tumoren gevormd uit CD133 + cellen algemeen hebben zowel hepatocellulair carcinoom en cholangiocarcinoom functies, hetgeen duidt op een stamcel-of progenitor cel oorsprong naar de tumoren. 2-4,29 Follow-up werk na tumoren worden gedocumenteerd includes standaard pathologische analyse van tumorweefsel (H &amp; E kleuring) en immunohistochemische kleuring. Bovendien kunnen tumoren worden gemalen en gedigereerd voor FACS analyse of re-cultuur. 2-4,30 Tot slot hebben we gedetailleerd een procedure voor de isolatie, uitbreiding, en basiskarakterisering van CD133 + lever stamcellen en CD133 + kankerstamcellen. Trouble Shooting: CD45 verontreiniging: In stap 3 als er verontreiniging van CD45 + cellen, die worden beoordeeld door toevoeging van een CD45-FITC Ab voor FACS-analyse en isolatie, controleer dat de CD45 microbead antilichaam niet is verlopen en het filtraat werd verzameld alleen tijdens de filter is in de magnetische houder. Elke filtraat verzameld als het filter niet in de magnetische houder bevat CD45 + cellen. Low aantal cellen: Voor de niet-gewonde lever, de totale number van CD133 + niet-parenchymale geïsoleerd kan minder dan 10.000. Deze cellen zijn zeldzaam in de rustige lever. Een chronisch letsel model, zoals DDC 0,1% dieet, het aantal sterk toenemen tot 100.000 cellen. Als het totale aantal cellen is aanzienlijk lager dan deze nummers, een punt van overweging is de FACS Ab kleuring. Controleer of de CD133 Ab niet is verlopen, een slechte kleuring leidt tot een slechte opbrengst. Tevens raden uitvoeren van een FACS analyse van de lever niet-parenchymale cellen van de relatieve populatie vóór bepalen poging FACS isolatie. Laag cellevensvatbaarheid na FACS: Een van de problemen van de levensvatbaarheid kan worden gerelateerd aan hoe de cellen worden verwerkt en op welk tijdstip. Idealiter zou de hele cel isolatie procedure, stappen 1-4, worden uitgevoerd zonder enige vertraging tussen de stappen en voltooid in op dezelfde dag. Elke belangrijke vertraging tussen de stappen 1-4 zal sterk verminderen van de levensvatbaarheid van de cellen. Een tweede probleem in verband met cell levensvatbaarheid kan worden gerelateerd aan de mantel druk voor FACS isolatie. Wij raden u aan een lagere schede druk. Tenslotte wanneer de cellen worden geïsoleerd, moeten ze direct geplateerd, elke aanzienlijke opslag op ijs na sortering zal ook levensvatbaarheid. CD133 + niet-parenchymale heterogeniteit: Recente rapporten blijkt dat leverstellaatcellen kan ook CD133 expressie en enige plasticiteit. 25 Daarom naast controle bi-potentie genen met albumine en Krt19 aanvullende verificatie genen geassocieerd met stellaatcellen, zoals de gliale fibrillaire zure proteïne in zijn rustende stellaatcellen en alfa-gladde spier actine en desmine in geactiveerde stellaatcellen. 3,4,26 Bovendien is de CD133 + populatie vertegenwoordigt een bredere populatie progenitor. De toevoeging van een tweede marker, zoals EpCAM kan bijdragen dat de bevolking verder te verfijnen en beperken heterogeniteit.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogusnummer </th><th> Opmerkingen (optioneel) </th></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-018 </td><td> Met fenolrood </td></tr><tr><td> CD45 microkorrels </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-301 </td><td></td></tr><tr><td> Hepatocyt groeifactor </td><td> Sigma </td><td> H1404 </td><td></td></tr><tr><td> Epidermal Growth Factor </td><td> Sigma </td><td> E4127 </td><td></td></tr><tr><td> DNase </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> 1 gram </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> Roche </td><td> 1088874 </td><td></td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche </td><td> 0165921 </td><td></td></tr><tr><td> 70 micron zeef </td><td> Visser </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Omniscript RT </td><td> Quaigen </td><td> 205111 </td><td> 50 reacties </td></tr><tr><td> HotStarTaq </td><td> Quaigen </td><td> 203203 </td><td></td></tr><tr><td> Miltenyi LD kolom </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-901 </td><td></td></tr><tr><td> CD133-PE FACS Ab </td><td> eBioscience </td><td> 12-1331-82 </td><td></td></tr><tr><td> Laminine beklede platen </td><td> BD </td><td> 354410 </td><td> 96 goed </td></tr><tr><td> 0,05% trypsine EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-354 </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> RNeasy Micro Kit </td><td> Quaigen </td><td> 74004 </td><td> 50 kolommen voor 5x10 5 cellen of minder </td></tr><tr><td> Pharm Lyse </td><td> BD </td><td> 555899 </td><td> 10X concentratie </td></tr></tbody></table>

isolatie van cd133 + lever stamcellen voor klonale expansie

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Leverstamceltechnologie of ovale cellen prolifereren bij chronische leverschade en voorgesteld te differentiëren tot zowel hepatocyten en cholangiocyten. Bovendien, lever stamcellen hypothese als de voorlopers voor een subset van leverkanker, hepatocellulair carcinoom. Een van de belangrijkste uitdagingen cel werken stam in elke vaste orgaan zoals de lever is het isoleren van een populatie van zeldzame cellen voor gedetailleerde analyse. Bijvoorbeeld, de meeste cellen in de lever hepatocyten (parenchymale fractie), die aanzienlijk groter zijn dan niet-parenchymale cellen. Door verrijking van het specifieke cellulaire compartimenten van de lever (ie parenchym en niet-parenchymale fracties) en het selecteren op CD45 negatieve cellen, kunnen we beginnen de populatie van stamcellen verrijken met meer dan 600 fold.The proceduresdetailed in dit rapport mogelijk een relatief zeldzame populatie van cellen van een orgaantransplantatie efficiënt worden gesorteerd. Dit proces kan worden gebruikt om isolateliver stamcellen van normale muizen lever en chronische leverbeschadiging modellen die verhoogde lever stamcelproliferatie tonen. Deze methode heeft duidelijke voordelen ten opzichte van standaard immunohistochemie bevroren of formaline gefixeerde lever functionele studies met levende cellen kan worden uitgevoerd na de eerste co-lokalisatie experimenten. Om de procedure die in dit rapport te bereiken wordt een werkrelatie met een op onderzoek gebaseerde flow-cytometrie kern sterk aangemoedigd als de details van FACS isolatie zijn sterk afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie en een sterke praktische kennis van elementaire flow-cytometrie procedures. Het specifieke doel van deze werkwijze is het isoleren van een populatie van lever stamcellen die klonaal kan worden uitgebreid in vitro.

Hier beschrijven we de isolatie van CD133 tot expressie lever stamcellen en kanker stamcellen van muizen gehele lever, een proces dat weefsel spijsvertering, cel verrijkingscocktail en flowcytometrie isolatie vereist. Wij omvatten methoden voor geavanceerde single cell isolatie en klonale expansie.

Isolatie van CD133 + lever stamcellen voor klonale expansie

Leverstamcellen, of ovalcellen, prolifereren tijdens chronische leverschade en worden verondersteld te differentiëren in zowel hepatocyten als cholangiocyten. In ...

Deze video demonstreert een procedure voor het isoleren van leverstamcellen om clonale expansie te bestuderen met behulp van CD 1 33 celoppervlakexpressie na chronische leverschade. Eerst wordt de lever verwijderd uit een muis met chronische leverschade en gedigesteerd om een enkelcel-suspensie te verkrijgen. Vervolgens wordt een lysisbuffer voor rode bloedcellen toegevoegd om de rode bloedcellen te verwijderen en de oplossing wordt door een magnetische kolom geleid die CD 45 antilichamen bevat om CD 45 leukocyten te verwijderen.De CD 45-gedepleteerde cellen worden vervolgens gesorteerd om CD 1 33-positieve leverstamcellen te verrijken. De uiteindelijk geïsoleerde CD 1 33-positieve leverstamcellen worden gekweekt en geëxpandeerd. In vitro-analyse van gen- en eiwitexpressie toont aan dat de geïsoleerde CD 1 33-positieve stamcellen in staat zijn om te differentiëren tot zowel hepatocyten als osteocyten.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de colokalisatie van markers met behulp van immunohistochemische technieken, is dat individuele cellen geïsoleerd kunnen worden voor clonale expansie en functionele analyse. Om de fenotypes van stam- en progenitorcellen te bevestigen, zal de techniek worden gedemonstreerd door mijzelf en He Dang, een promovendus in mijn laboratorium. Bereid alle buffers in media 24 uur van tevoren voor en bewaar alle oplossingen bij vier graden Celsius tot gebruik.Media, instrumenten, filters en buizen moeten steriel zijn en met steriele techniek worden gehanteerd. Om het risico op contaminatie te verminderen, dient het buikgebied van een geëuthanaseerde muis te worden afgeveegd met 70% ethanol. Open met steriele instrumenten de buikholte en leg de lever bloot op een blok.Verwijder de galblaas uit de geëxplanteerde lever en breng vervolgens de gehele lever in een gesloten steriele schaal over naar een laminaire flowkast. Gebruik een steriel scheermesje om de lever fijn te snijden met een combinatie van meerdere horizontale en verticale sneden. Verdeel de fijngesneden lever gedurende één minuut in vier delen en plaats elk deel in een eigen buis van 15 milliliter met 10 milliliter enzymdigestie-oplossing. Plaats de buizen vervolgens gedurende 45 minuten in een waterbad van 37 °C in een shaker die is ingesteld op één tot twee cycli per seconde.Veeg na de incubatie de buisjes af met 70% ethanol. Pipetteer vervolgens, onder een laminaire flowkap, het gedigesteerde leverpulp door een filter met een maaswijdte van 70 micron en verzamel het filtraat in een steriel schaaltje om de parenchymale fractie, die de grotere hepatocyten bevat, te verwijderen. Spoel het filter na met aliquots van 2 mL sterium gesupplementeerd D-M-E-M-F 12 medium.Gebruik het rubberen uiteinde van een spuitzuiger om de verteerde pulp door het filter te drukken. Herhaal dit proces vijf keer om een totaalvolume van ongeveer 20 milliliters te verkrijgen. Verdeel het filtraat over twee gelijke buizen van 15 milliliter en centrifugeer vervolgens bij 50 ×g gedurende één minuut bij vier graden Celsius.Na het centrifugeren wordt de supernatans overgebracht naar een buis met het label 'supernatans nummer één' en wordt het parenchymale pellet weggegooid. Om vervolgens de niet-parenchymale fractie te verzamelen, die de stam- en progenitorcellen bevat, wordt supernatans nummer één gecentrifugeerd bij 50 ×g gedurende één minuut.Breng het supernatant over naar een buis met het label supernatant nummer twee en gooi het pellet opnieuw weg. Centrifugeer vervolgens supernatant nummer twee bij 50 ×g gedurende één minuut.Breng na het centrifugeren de supernatant over naar een buis met het label supernatant nummer drie en verwirp het pellet. Centrifugeer vervolgens de uiteindelijke SNAT nummer drie bij 180 ×g gedurende acht minuten om de niet-parenchymale fractie te verkrijgen. Verwerp na het centrifugeren de supernatant en ga onmiddellijk over naar de volgende stap van het protocol, waarbij de rode bloedcellen en het pellet worden gelysis. De lysisbuffer voor rode bloedcellen en de mill tene-buffer die voor dit deel van de procedure worden gebruikt, moeten de avond vooraf zijn bereid en bewaard zijn bij 4 °C volgens de instructies in het bijbehorende geschreven document.Werk in een laminaire flowkast terwijl de cellen en oplossingen op ijs staan. Resuspendeer het niet-parenchymale pellet uit de bovenstaande stap in 1 mL van 1x verdunde lysisbuffer voor rode bloedcellen en breng dit over naar een buisje van 5 mL. Sluit het buisje en vortex dit voorzichtig gedurende 5 seconden.Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C. Bescherm tegen licht nadat er 15 minuten zijn verstreken. Centrifugeer de buis bij 200 ×g gedurende vijf minuten en discard na de spin het supernatant dat geliseerde rode bloedcellen bevat en resus.Suspendeer het pellet in één milliliter ijskoude en steriele lysisbuffer en centrifugeer dit 5 minuten bij 200 ×g. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en suspendeer het pellet opnieuw in één milliliter ijskoude en steriele lysisbuffer.Milton-buffer. Neem vervolgens 10 µL van deze cel-suspensie en voeg 10 µL stripe am blue toe. Tel de niet-parenchymale cellen met een hemocytometer om de CD 45 hematopoëtische celdepletie uit de niet-parenchymale fractie uit te voeren.Begin in de laminaire flowkast door de concentratie van de cellen aan te passen naar 10⁷ tot 10⁸ totale cellen in 100 µL melty buffer. Zorg ervoor dat de cellen en buffers gedurende de gehele procedure koud blijven.Breng vervolgens 20 µL CD45 microbead-antilichaam aan per 10 miljoen cellen en incubeer dit 15 minuten bij 4 °C. Voeg na de incubatie nog eens 2 mL buffer toe en centrifugeer 5 minuten bij 200 ×g. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en resuspendeer maximaal 10⁸ cellen in 1 mL.Plaats een Milt, willekeurige LD-magnetische kolom in een magnetische houder in een laminaire flowkast met een willekeurige buffer. Plaats een steriele buis van 5 mL onder het filter om het filtraat op te vangen. Laad vervolgens 2 mL.Smelt een willekeurige buffer om een voorwas van het filter uit te voeren. Zodra de wasbeurt is voltooid, worden de cellen op de kolom geladen. Wanneer de celsuspensie zich in de kolom bevindt, wordt één milliliter smelt e buffer toegevoegd om de kolom te wassen; voer deze wasbeurt nog twee keer uit.Gebruik de meegeleverde zuiger van een kolom niet om de filtratiesnelheid te verhogen. Nadat alle wasstappen zijn uitgevoerd, wordt het verzamelde filtraat van CD 45-gedepleteerde niet-parenchymale cellen vijf minuten gecentrifugeerd bij 200 ×g. Gooi de kolom met de vastgehouden CD 45-positieve cellen weg.Vervolgens wordt flowcytometrie uitgevoerd om CD133-positieve cellen te isoleren; resuspendeer de cellen in Milt-buffer tot 10⁷ cellen per 100 µL. Aliquoteer 100 µL in drie buisjes. Voeg aan het eerste buisje 2 µL CD133 PE-geconjugeerd antilichaam toe. Voeg aan het tweede buisje IgG PE-geconjugeerd antilichaam toe als controle.De derde buis met cellen dient als ongekleurde controle en wordt vijftien minuten bij vier graden Celsius in het donker geïncubeerd. Resuspendeer de cellen na de incubatie in twee milliliter kleuringsbuffer en centrifugeer 200 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in één milliliter Milton e-buffer. Gebruik vervolgens op de flowcytometer de ongekleurde cellen en de IGPE-gekleurde cellen om de sorteerparameters aan te passen voor een geoptimaliseerde gating van de CD 1 33-positieve celpopulatie.Onze FICO ERYN of RPE kan over het algemeen worden gebruikt met elke flowcytometer die een laser heeft die 488 nanometers uitzendt. Isoleer ten slotte de CD 1 33-positieve celpopulatie met behulp van een CD 1 33-positieve gate en verzamel de cellen in steriel gefiltreerd oval cell-medium. De cellen kunnen nu worden gekweekt en er kan clonale isolatie worden uitgevoerd, gevolgd door real-time PCR om de potentiële status van CD 1 33 te beoordelen.Positieve leverstamcellen werden geïsoleerd uit wildtype en MAT1A-knockoutmuizen zoals beschreven in deze video, hier te zien. CD133-positieve cellen maken 0,4% uit van de sterk verrijkte, CD45-gedepleteerde non-parenchymale controlefractie afkomstig uit niet-beschadigde lever van wildtypemuizen; bij de genetische knockout MAT1A -/-, een model voor chronische leverschade, breidt de CD133-positieve populatie zich tienvoudig of meer uit in dezelfde sterk verrijkte fractie.Na de sortering werden de cellen gekweekt en de klonen uitgebreid. Hier worden fasecontrastbeelden getoond van vier kolonies afgeleid van enkele CD 1 33-positieve cellen, uitgebreid op met laminine gecoate 96-wells platen. Deze cellen zijn zeven dagen na isolatie en vertonen kleine, compacte epitheelcelkolonies op dag zeven, wanneer de kolonies ongeveer 25 cellen tellen.RNA werd uit de cellen geïsoleerd en de genexpressie van de cholangiocytenmarker CK 19 werd geanalyseerd, zoals te zien is in deze RT-PCR-experimenten. De genexpressie toont expressie van de hepatocytenmarker albumine en de cholangiocytenmarker CK 19, wat de potentiële status bevestigt van CD 1 33-positieve cellen enkele weken na de initiële isolatie van CD 1 33-positieve enkelcellen en expansie in vitro. Er worden 1 × 10⁶ cellen van het mat one, A minus minus-model subcutaan geïnjecteerd in immuundeficiënte naaktmuizen. Pijlen geven tumoren aan die groeien vier weken na de injectie van de cellen.CD 1 33 positieve cellen uit toxine-geïnduceerde chronische leverschade, zoals CCL vier of een 0,1%DDC-dieet, vormen geen tumoren. Tumorvorming in vivo wordt gebruikt om het maligne potentieel of het kankerstamcel-fenotype binnen de stamcelpopulatie te identificeren. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in acht uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.Na deze procedure kunnen aanvullende markers zoals EPAM of andere markers worden toegevoegd. Technieken zoals side population flux kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het verfijnen van de oppervlaktemarkers van leverprogenitorcelpopulaties. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe leverstam- en progenitorcellen kunnen worden geïsoleerd met behulp van flowcytometrie.Vergeet niet dat werken met dierlijk weefsel gevaarlijk kan zijn en dat er bij het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen en het toepassen van correcte laboratoriumtechnieken.

isolation-of-cd133-liver-stem-cells-for-clonal-expansion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het isoleren van volwassen stamcellen uit spier-en zachte weefsels op basis van de cel naleving snelheid kolf.

Het isoleren van stamcellen uit Soft musculoskeletale weefsels

This video describes the technique of isolating CD133 negative and positive melanoma stem cells from a primary melanoma cell line using magnetic-activated cell sorting. The CD133 positive melanoma CSCs are further studied to understand the mechanisms of melanoma tumorigenesis.

Melanoma Stem Cell Isolation: A Method to Obtain CD133 Positive and Negative Melanoma Cells Using Magnetic-activated Cell Sorting

This video demonstrates the isolation of lymphocytes, including natural killer cells or NK cells, from human liver tissue for selective expansion. Enzymatic and mechanical digestion, followed by density gradient separation, promotes lymphocyte isolation, including NK cells. The collected lymphocytes can be further used for the selective expansion of NK cells.

Natural Killer Cell Isolation from Liver Tissue for Selective Expansion

This video demonstrates a technique for generating human immune system (HIS) mice. CD34+ hematopoietic stem cells (HSCs) are isolated from human cord blood buffy coat cells using antibody-coated magnetic beads. The CD34+ HSCs are expanded in a growth medium enriched with cytokines and cryopreserved. Finally, the thawed HSCs are injected into an immunodeficient mouse pup to establish the HIS mouse model.

Isolating Cord Blood Hematopoietic Stem Cells to Generate Human Immune System Mice

Dit artikel beschrijft de bereiding van vers verkregen melanoomweefsel in primaire celculturen en hoe verontreinigingen van erytrocyten en fibroblasten uit de tumorcellen. Tot slot beschrijven we hoe...

Patiënt Derived Cell Cultuur en isolatie van CD133<sup&gt; +</sup&gt; Vermeende Cancer Stem Cells van Melanoom

Beschreven hierin is een protocol om de infiltrerende leukocyten van de decidua basalis en decidua parietalis - de menselijke moeder-foetus interface - te isoleren en verder te bestuderen. Dit protocol handhaaft de integriteit van celoppervlaktemarkeringen en levert voldoende levensvatbare cellen op voor downstream-toepassingen, zoals bewezen door flowcytometrie-analyse.

Isolatie van leukocyten uit de Human Maternal-foetale Interface

Er wordt een techniek beschreven om menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van dezelfde donor te isoleren. De verschillende leverceltypen vormen de basis voor functionele levermodellen en weefselengineering. Deze nieuwe methode streeft ernaar om levercellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid te isoleren.

Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells

We beschrijven een betrouwbare methode om primaire tumorspecifieke endotheelcellen te isoleren en te kweken van genetisch gemanipuleerde muismodellen.

Isolatie en Cultuur Uitbreiding van Tumor-specifieke endotheelcellen

Lever verwondingen worden begeleid door voorlopercellen cel expansie die een heterogene populatie cellen vertegenwoordigt. Nieuwe indeling van deze cellulaire compartiment zorgt voor de onderscheidende meerdere subsets. De hier beschreven methode laat de flowcytometrieanalyse en hoge zuiverheid isoleren van diverse subsets die kunnen worden gebruikt voor verdere tests.

Isolatie en Verrijking van Liver Progenitor subsets geïdentificeerd door een Novel Surface Marker Combinatie

Dit protocol illustreert een veilige en efficiënte procedure voor het wijzigen van de CD133+ hematopoietische stamcellen. De voorgestelde niet-virale, magnetische polyplex gebaseerde benadering verschaffen een basis voor de optimalisatie van de cel van de stam van de therapeutische effecten ook monitoring van het product door de overheid gereguleerde cel via magnetische resonantie beeldvorming.

Protocol voor MicroRNA overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel Engineering gecombineerd met magnetische Targeting

Het doel van dit artikel is om een gestandaardiseerde aanpak te bieden om menselijke hepatische voorloperdifferentiatie van pluripotente stamcellen te induceren. De ontwikkeling van deze procedure met kant-en-klare mediaformuleringen biedt de gebruiker een gemakkelijk systeem om menselijke levercellen te genereren voor biomedisch onderzoek en vertaling.

Hepatische voorloperspecificatie van pluripotente stamcellen met behulp van een gedefinieerd differentiatiesysteem

Leer CD133+ leverstamcellen isoleren uit muizenlever voor klonale expansie en functionele analyse. Deze methode combineert weefseldigestie, magnetische afrijning en flowcytometrie.

Isolatie van CD133 + lever stamcellen voor klonale expansie

Meer video's verkennen