Name: Zuivering van Hsp104, een eiwit Disaggregase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Leer de zuivering van Hsp104, een hexamerische AAA+ eiwitdisaggregase uit gist, met affiniteitschromatografie en gelpermeatie. Dit protocol levert hoogactief eiwit voor structurele en functionele studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de NIH (5T32GM008275-22) en een American Heart Association predoctorale gemeenschap (naar EAS), een scheikunde-biologie Interface Fellowship van de NIH (2T32GM071339-06A1) (tot MED), en subsidies van de NIH (1DP2OD002177-01 en NS067354-0110), De Ellison Medical Foundation en de Bill and Melinda Gates Foundation (naar JS).

1. Expressie van Hsp104 <ol><li> Het plasmide gebruikt voor de zuivering in E. coli, pPROEX-HTB-Hsp104, bevat de Hsp104 open reading frame onder de induceerbare controle van de TRC promotor 26. Het plasmide produceert Hsp104 met een N-terminale Zijn 6-tag die kan worden verwijderd door TEV protease splitsing. Transform pPROEX-HTB-Hsp104 in codon-geoptimaliseerde E. coli BL21-CodonPlus-RIL cellen (Stratagene, Agilent Technologies) met behulp van een typische bacteriële transformatie procedure (bijv. volgens de instructies van de fabrikant). Het is belangrijk dat het gebruik van een codon-geoptimaliseerde E. coli-stam omdat Hsp104 heeft een ongewone codon bias. </li><li> Inoculeren een 100 ml 2XYT cultuur (USB. Recept: 16g / L caseïne pepton, 10g / L gistextract, 5 g / L NaCl, pH 7,0) aangevuld met 100μg/mL ampicilline en 34μg/mL chlooramfenicol met verse transformanten en groeien 's nachts bij 37 ° C onder schudden bij max. 200 omw. </li><li> Inoculeren 10 ml van de overnacht cultuur in 6 X 1L 2XYT met 100μg/mL ampicilline en 34μg/mL chlooramfenicol in 2L kolven. Schudden op 250rpm bij 37 ° C tot OD 600 = 0.4 tot 0,6. Stop schudden en de temperatuur tot 15 ° C. te verlagen Laat cellen in evenwicht unagitated voor 30min in de couveuse tot aan 15 ° C. Zodra 15 ° C wordt bereikt induceren eiwit-expressie door het toevoegen van IPTG tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM. Hervatten schudden bij 250rpm 's nachts (12-16 uur). </li></ol> 2. Cel Oogst en Lysis <ol><li> Oogst cellen door centrifugeren (in een voorgekoeld rotor) bij 4.000 tpm voor 20min bij 4 ° C (we gebruiken een Sorvall RC 3BP + centrifuge). Volgende stappen moeten onmiddellijk worden uitgevoerd omdat Hsp104 activiteit is verminderd wanneer E. coli-cellen zijn bevroren. Bovendien moet alle volgende stappen worden uitgevoerd op ijs of bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer celpellets in prechilled (op ijs) 10 ml lysis buffer (40mm HEPES-KOH pH 7,4, 500mm KCl, 20mm MgCl 2, 2,5% (w / v) glycerol, 20mm imidazol, 5 urn pepstatine A, compleet proteaseremmer cocktail (een EDTA -vrij tablet/50mL), en 2 mm β-mercapto-ethanol). </li><li> Lyse cellen met een Franse pers (Emulsiflex) homogenisator dat een warmtewisselaar ondergedompeld in ijswater gebruikt. Voor het gebruik, ervoor zorgen dat alle cel klonten zijn opgelost. Na equilibreren homogenisator met lysis buffer, twee gaat door de cilinder met een druk van 15,000-18,000 psi voldoende is voor een volledige lysis. Als een Franse pers is niet beschikbaar is, kan incubatie met lysozyme, gevolgd door sonicatie worden gebruikt (zie discussie). Sla een kleine steekproef van gelyseerde cellen voor SDS-PAGE analyse (1μL) (Lysate in Fig. 2). </li><li> Verwijder celresten door centrifugatie bij 16.000 rpm voor 20min bij 4 ° C (we gebruiken een Sorvall RC5C + centifuge). Behouden supernatant voor de volgende stap en opslaan van een kleine steekproef (1μL) van supernatant voor SDS-PAGE-analyse (Ni Load in Fig. 2). </li></ol> 3. Hsp104 Zuivering <ol><li> Mix supernatans van stap 2.4 met 12ml (2 ml Ni-Sepharose kralen per 1 l van cellen) van 50% suspensie van lysis buffer in evenwicht gebracht Ni-Sepharose kralen (GE). </li><li> Langzaam draaien monster gedurende 3 uur bij 4 ° C, zodat Ni-Sepharose blijft gelijkmatig geschorst en schuimvorming wordt geminimaliseerd. Kortere incubatietijden zijn mogelijk, maar zal afnemen opbrengst. Bij 4 ° C in de aanwezigheid van protease-inhibitoren, weinig degradatie optreedt, en een 3 uur Ni-Sepharose incubatietijd neemt niet af activiteit van het eindproduct. Verzamel Ni-Sepharose door centrifugatie gedurende 2 minuten bij 4 ° C bij 2.000 tpm (Eppendorf centrifuge 5810R). Sla een kleine steekproef van supernatant voor SDS-PAGE analyse (1μL) en gooi de rest (Ni doorstroming (FT) in Fig. 2). </li><li> Was de opgehaalde Ni-Sepharose met 25 kolomvolumes wasbuffer (40mm HEPES-KOH pH 7,4, 150mm KCl, 20mm MgCl 2, 2,5% (w / v) glycerol, 20mm imidazol, 2mm β-mercapto-ethanol), 5 kolomvolumes wasbuffer met 1M KCl om verontreinigingen elektrostatisch gebonden aan Hsp104, en 25 kolomvolumes wasbuffer te verwijderen. Verzamel Ni-Sepharose na iedere wasbeurt door centrifugatie gedurende 2 minuten bij 4 ° C bij 2.000 tpm (Eppendorf centrifuge 5810R). Na elke wassen en centrifugeren cyclus, verwijder buffer door aspiratie. </li><li> Om Hsp104, mix Ni-Sepharose elueren met 1 ml elutiebuffer (40mm HEPES-KOH pH 7,4, 150mm KCl, 20mm MgCl 2, 2,5% (w / v) glycerol, 350mm imidazol, 2mm β-mercapto-ethanol) per 1 ml Ni-Sepharose en draaien bij 4 ° C gedurende 20 minuten. De hoge imidazol concentratie verstoort de Ni-kraal Zijn zes interactie. Verwijder de Ni-Sepharose met een lege 1,2 ml spin-kolommen (Bio-Rad) door middel van centrifugeren gedurende 2 min bij 4 ° C bij 2.000 tpm (Eppendorf centrifuge 5810R). Bespaar 1μL eluaat voor SDS-PAGE-analyse (Ni eluaat op in Fig. 2). Voor elke liter van cellen, is ~ 15 mg van Hsp104 verkregen bij deze stap. </li><li> Buffer uitwisseling eluaat in Buffer Q (20mm Tris-HCl pH 8, 0,5 mm EDTA, 5mM MgCl2, 50 mM NaCl) met behulp van MWCO 30.000 Amicon Ultra (Millipore) 15ml centrifugale concentrator eenheden. Eerst, eiwit dan concentreren op ~ 1,5 ml toe te voegen 14.5mL van Buffer Q tot eiwit verdunnen 10-voudig. Herhaal dit 3 keer voor-buffer uit te wisselen. De stijging van de pH en een laag zout zorgt ervoor dat Hsp104 een hoge negatieve lading heeft. </li><li> Zuiver Hsp104 via anion-uitwisseling chromatografie met behulp van een Buffer Q evenwicht Resource Q 6ML kolom (GE). Vóór injectie, wordt eiwit gefilterd door een lage eiwitbinding Millex GP PES Membrane 0.22μM spuit filter (Millipore). Wij werken met een debiet van 1mL/min. Afwassen zwak bindende eiwitten met 1 kolom volume van 20% Buffer Q + (20mm Tris-HCl pH 8, 0,5 mm EDTA, 5mM MgCl 2, 1 M NaCl). Elueer Hsp104 met een lineaire gradiënt (20% -50% Buffer Q +) over 5 kolomvolumes (afb. 3). Verzamel 1 ml fracties. Hsp104 en de meeste varianten typisch elueren bij ~ 400mm NaCl (31mS/cm). Bespaar monsters van piek fracties (1μL) voor SDS-PAGE analyse (Fig. 3, inzet). </li><li> Zijn 6-tag te verwijderen, uitwisseling eiwit met behulp van de Amicon centrifugale concentrator zoals hierboven beschreven (zie stap 3.5) in decollete buffer (20mm HEPES-KOH pH 7,4, 140mm KCl, en 10mm MgCl 2). Gebruik proTEV protease (Promega) of AcTEV protease (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. Voor Hsp104, hebben we ontdekt dat een hogere ratio's van de TEV protease: Hsp104 zijn vereist voor volledige decollete. We maken gebruik van een ratio van 1 protease eenheid per 12μg Hsp104. Splitsing moet worden uitgevoerd bij 30 ° C gedurende 2-4 uur, gevolgd door een 16 uur incubatie bij 4 ° C. Uiteindelijke Hsp104 concentratie moet tussen de 20-75μM monomeer. Afbrekende eventuele resterende His6-gelabeld Hsp104 en TEV protease met Ni-Sepharose (GE) door de toevoeging van Ni-Sepharose dan tot het bedrag van Hsp104 in de splitsing reactie (veronderstellen kralen kunnen binden 15 mg eiwit per ml verpakt hars). Verwijder de kralen met lege spin-kolommen (Bio-Rad) door het centrifugeren voor 2min bij 2.000 tpm bij 4 ° C. Te verzamelen monsters voor en na de splitsing (1μL) voor SDS-PAGE analyse splitsing, en de verwijdering van niet-geknipte eiwit (afb. 4) te verzekeren. </li><li> Exchange naar grootteklasse uitsluiting buffer (20mm HEPES-KOH pH 7,4, 140mm KCl, 10 mM MgCl2, 0,1 mm EDTA, 1 mM DTT) met behulp van MWCO 30.000 Amicon Ultra (Millipore) zoals beschreven in stap 3.5. </li><li> Verder te zuiveren Hsp104 via size-exclusion chromatografie. Gebruik grootte uitsluiting buffer in evenwicht gebracht Superose 6 of Superdex 200 kolom (zowel van GE) (fig. 5). Vóór injectie, wordt eiwit gefilterd door een lage eiwitbinding Millex GP PES Membrane 0.22μM spuit filter (Millipore). Voor minder dan 10 mg eiwit, kan de grootte van 10/300 kolommen (24ml) worden gebruikt en 0,5 ml fracties worden verzameld. Voor monsters groter is dan 10 mg, moet de grootte van 12/60 kolom (120 ml) worden gebruikt en 1 ml fracties worden verzameld. Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor flow-rate en sample volumes worden geladen. Na zuivering wordt Hsp104 fracties samengevoegd zoals getoond in Fig. 5 en geconcentreerd in Amicon Centrifugaal Concentrator Units (Millipore). Hsp104 wordt opgeslagen zoals hieronder beschreven. Te wijten aan het verlies van materiaal in het scheiden van Hsp104 afbraakproducten en verontreinigingen van de uiteindelijke opbrengst van gezuiverd full-length Hsp104 is ~ 1-3 mg per liter van het starten van cultuur. </li></ol> 4. Hsp104 Disaggregase Activiteit <ol><li> Na zuivering, is het een goede gewoonte om Hsp104 activiteit in een desaggregatie test te beoordelen. Normaal gesproken maken we gebruik van een luciferase reactivering analyse 2 (Fig. 6). In deze test, Hsp104 in combinatie met het Hsp70 chaperonne-systeem (Hsp70 en Hsp40) disaggregates ureum-gedenatureerde vuurvlieg luciferase aggregaten 2. Oplosbare luciferase katalyseert de oxidatie van luciferine om oxyluciferine, een reactie die licht releases. Door het monitoren van luminescentie, de relatieve reactivering, en daarom disaggregatie, kan van luciferase worden bepaald. Hsp104 moet kunnen synergetisch samenwerken met de Hsp70 co-chaperonne-systeem. De hoeveelheid nuttig toegepast luminescentie is afhankelijk van de exacte Hsp70: Hsp40 paar benut. We routinematig werk Hsp72 en Hsp40 (Assay Designs). Op zijn minst moet actief Hsp104 produceren een 5-voudige toename van de reactivering van de luciferase in vergelijking met de reactivering van Hsp72: Hsp40 alleen (Fig. 6). Hsp104 bereidingen die niet aan dit niveau van activiteit te bereiken worden verwijderd. </li></ol> 5. Hsp104 Opslag <ol><li> Voor de korte termijn opslag kan Hsp104 worden bewaard bij 4 ° C in grootte-uitsluiting buffer. Toch zal de activiteit dalen na 2-3 dagen bij 4 ° C en scherp na 1 week bij 4 ° C. Voor de uitsplitsing assays adviseren wij Hsp104 moeten zo snel mogelijk worden gebruikt na zuivering. Idealiter zou Hsp104 direct worden gebruikt voor amyloïd disaggregatie assays. </li><li> Als eiwit moet worden opgeslagen op lange termijn, is Hsp104 uitgewisseld in opslag buffer (20mm HEPES-KOH pH 7,4, 140mm KCl, 10 mM MgCl2, 0,1 mm EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol (w / v)). 100μl aliquots zijn snap ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C. Vries-dooi cycli drastisch te verminderen Hsp104 activiteiten moet worden vermeden. Wij raden langzaam ontdooien Hsp104 op ijs. Amyloid-disaggregase activiteit zal fors afnemen na 1 maand bij -80 ° C. </li></ol> 6. Representatieve resultaten en cijfers: <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Hsp104 is een bifunctionele disaggregase. Uitsplitsing van ongeordende aggregaten (zie links) vereist de medewerking van de Hsp70 chaperonne-systeem (Hsp70 en Hsp40) 2. Hsp104 renovaties amyloid aggregaten (zie rechts) bestelde zonder de hulp van Hsp70 en Hsp40 in vitro, maar Hsp70 en Hsp40 kunnen Hsp104 activiteiten aan te moedigen tegen amyloïde 26,28. Voor beide typen van geaggregeerde structuren, Hsp104 koppels ATP hydrolyse tot substraat translocatie door zijn centrale kanaal naar desaggregatie te bevorderen. Tyrosine-dragende porie loops te betrekken en shuttle substraat door het centrale kanaal 49-52. <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. SDS-PAGE analyse van de Ni-Sepharose affiniteitszuivering stap. Lysate, Ni Load, Ni FT en Ni eluaat monsters werden gefractioneerd door SDS-PAGE met behulp van een 4-20% Tris-HCl 1,0 mm Criterion gel (Bio-Rad) en Coomassie gekleurd . Merk op dat niet alle Hsp104 in staat is te binden aan de Ni-sefarose. BroadRange molecuulgewichtmerkers (Bio-Rad) worden weergegeven (links voorsorteren). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Resource Q zuivering van Ni-sepharose eluaat. Blauwe trace vertegenwoordigt absorptie bij 280nm en groen trace vertegenwoordigt% Buffer Q + (maximum bij 50%). De eerste piek, die elueert op 20% Q + bevat onzuiverheden, afbraakproducten en onjuist gevouwen Hsp104. De tweede en belangrijkste piek bevat correct gevouwen en actieve Hsp104. Debiet was 1ml/min. Gradiënt van 20-50% Q + is 30 minuten of 5 kolom volumes. Inzet: piek breuken worden opgelost door middel van SDS-PAGE analyse met behulp van een 4-20% Tris-HCl 1,0 mm Criterion gel (Bio-Rad) en Coomassie gekleurd. BroadRange molecuulgewichtmerkers (Bio-Rad) worden weergegeven (links). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. SDS-PAGE-analyse van proTEV protease decollete stap. Zijn 6-Hsp104 van Resource Q zuivering werd behandeld met proTEV protease gedurende 4 uur bij 30 ° C en vervolgens 16 uur bij 4 ° C. Monsters werden de gefractioneerd door SDS-PAGE met behulp van een 4-20% Tris-HCl 1,0 mm Criterion gel (Bio-Rad) en Coomassie gekleurd. Merk op dat proTEV gesplitst Hsp104 migreert sneller. TEV protease en ongekliefd Hsp104 zijn uitgeput met Ni-Sepharose zoals beschreven in stap 3.7. BroadRange molecuulgewichtmerkers (Bio-Rad) worden weergegeven (links). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Grootte-uitsluiting zuivering van Hsp104. Gekliefde Hsp104 werd verder gezuiverd via een Superose 6 gelfiltratie kolom (10/300, GE). Debiet = 0.4ml/min. De piek tussen de gestippelde lijnen vertegenwoordigt samengevoegde fracties. Inzet: piek breuken worden opgelost door middel van SDS-PAGE analyse met behulp van een 4-20% Tris-HCl 1,0 mm Criterion gel (Bio-Rad) en Coomassie gekleurd. BroadRange molecuulgewichtmerkers (Bio-Rad) worden weergegeven (links). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Luciferase assay reactivering. Gedenatureerde vuurvliegluciferase aggregaten (50nm) werden geïncubeerd met ofwel Hsp72 en Hsp40 (1 uM) (beide uit Assay Designs), Hsp104 (6μM monomeer) of Hsp104, Hsp72 en Hsp40 voor 90min bij 25 ° C. Gedenatureerd luciferase is alleen volledig geactiveerd in de aanwezigheid van zowel Hsp104 en Hsp40/Hsp72. Hersteld luminescentie wordt gemeten op een Infinite M1000 plaatlezer (Tecan). Waarden vertegenwoordigen gemiddelden ± SEM (n = 3).

Geen belangenconflicten verklaard.

Tijdlijn: Voor maximale Hsp104 activiteit raden wij aan dat de hele zuivering regeling zo snel worden afgerond mogelijk te maken. Echter, het aantal van zuivering stappen maakt een veeleisende schema dat niet altijd praktisch. Als de zuivering stappen worden uitgevoerd zo snel mogelijk, de tijd tussen het einde van de nacht uitdrukking tot en met de 2-4 uur incubatie bij 30 ° C met TEV protease is ongeveer 9-11 uur. Een mogelijke plek om te pauzeren is naar aanleiding van de TEV decollete stap. Indien absoluut no...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> BL21-CodonPlus-RIL competente cellen </td><td> Stratagene, Agilent Technologies </td><td> 230255 </td></tr><tr><td> 2XYT bouillon </td><td> USB </td><td> 75864 </td></tr><tr><td> Compleet, mini, EDTA-vrij proteaseremmer tabletten </td><td> Roche </td><td> 1836170 </td></tr><tr><td> Pepstatine A </td><td> Sigma </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Ni-Sepharose 6 Fast Flow </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5318-02 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 centrifugaalfilter eenheden (MWCO 30.000) </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> Resource Q - 6 ml kolom </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1179-01 </td></tr><tr><td> proTEV Protease </td><td> Promega </td><td> V6052 </td></tr><tr><td> AcTEV Protease </td><td> Invitrogen </td><td> 12575015 </td></tr><tr><td> Superose 6 10 / 300 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td></tr><tr><td> Hsp40 </td><td> Assay Designs </td><td> SPP-400 </td></tr><tr><td> Hsp72 </td><td> Assay Designs </td><td> ADI-NSP-555 </td></tr></tbody></table>

zuivering van hsp104, een eiwit disaggregase

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is een hexamere AAA + eiwit 1 van gist, die koppels ATP hydrolyse aan proteïne disaggregatie 20-10 (afb. 1). Deze activiteit verleent twee belangrijke selectieve voordelen. De eerste, renaturatie van wanordelijke aggregaten door Hsp104 staat stelt gist overleving na diverse eiwit-misfolding benadrukt, met inbegrip van warmte shock 3,5,11,12. Ten tweede, remodeling van de cross-beta-amyloïde fibrillen door Hsp104 maakt gist naar talloze prionen (besmettelijke amyloids) als een reservoir van nuttige exploiteren en fenotypische variatie erfelijk 13-22. Opmerkelijk, Hsp104 renovaties direct preamyloid oligomeren en amyloid fibrillen, waaronder die welke deel uitmaken van de gist prioneiwitten Sup35 en Ure2 23-30. Dit amyloid-remodeling-functionaliteit is een gespecialiseerde facet van gist Hsp104. De E. coli ortholoog, ClpB, niet verbouwen preamyloid oligomeren of amyloid fibrillen 26,31,32. Hsp104 orthologen zijn te vinden in alle koninkrijken van het leven, behalve, perplexingly, dieren. Inderdaad, of dierlijke cellen een enzymatische systeem bezitten dat paren eiwit uitsplitsing naar renaturatie (in plaats van degradatie) blijft onbekend 33-35. Zo hebben wij en anderen stelden dat Hsp104 zou kunnen worden ontwikkeld als een therapeutisch middel voor verschillende neurodegeneratieve ziekten die verband houden met de misfolding van specifieke eiwitten in giftige preamyloid oligomeren en amyloid fibrillen 4,7,23,36-38. Er zijn geen behandelingen die direct gericht zijn op de geaggregeerde soorten geassocieerd met deze ziekten. Toch Hsp104 lost giftige oligomeren en amyloïd fibrillen samengesteld uit alfa-synucleïne, die verbonden zijn met de ziekte van Parkinson 23 evenals amyloïd vormen van PrP 39. Belangrijk is dat Hsp104 vermindert de aggregatie van eiwitten en verbetert neurodegeneratie in knaagdiermodellen van de ziekte van Parkinson 23 en de ziekte van Huntington 38. In het ideale geval de therapie te optimaliseren en het minimaliseren van bijwerkingen, zou Hsp104 worden ontworpen en versterkt om selectief verbouwen specifieke aggregaten centraal in de ziekte in kwestie 4,7. Echter, de beperkte structurele en mechanistische begrip van hoe Hsp104 disaggregates zo&#39;n divers repertoire van geaggregeerde structuren en ongerelateerde proteïnen frustreert deze inspanningen 30,40-42. Het begrijpen van de structuur en het mechanisme van Hsp104, is het essentieel om de pure proteïne en herstellen zijn disaggregase activiteit studie met een minimum aan componenten. Hsp104 is een 102kDa eiwit met een pi van ~ 5.3, die hexamerizes in aanwezigheid van ADP-of ATP, of bij hoge concentraties eiwitten in de afwezigheid van nucleotide 43-46. We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol voor de zuivering van zeer actieve, stabiele Hsp104 van E. coli. Het gebruik van E. coli maakt vereenvoudigde productie op grote schaal en onze methode kan snel en betrouwbaar worden uitgevoerd voor tal van Hsp104 varianten. Ons protocol verhoogt Hsp104 zuiverheid en vereenvoudigt Zijn 6-tag verwijderen vergelijking met een eerdere zuiveringsmethode van E. coli 47. Bovendien is ons protocol is gemakkelijk en handig dan twee meer recente protocollen 26,48.

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering van zeer actieve Hsp104, een hexamere AAA + eiwit van gist, die koppels ATP hydrolyse aan eiwit desaggregatie. Deze regeling maakt gebruik van een His6-gelabeld bouwen voor affiniteitszuivering uit<em&gt; E. coli</em&gt; Gevolgd door anion-uitwisseling chromatografie, His6-tag verwijderen met TEV protease, en de grootte-uitsluiting chromatografie.

Zuivering van Hsp104, een eiwit Disaggregase

Hsp104 is een hexameer AAA+-eiwit1 uit gist, dat ATP-hydrolyse koppelt aan eiwitdisaggregatie2-10 (Fig. 1). Deze activiteit verleent twee belangrijke ...

Het algemene doel van deze procedure is om grote hoeveelheden zeer actief HSP 1 0 4 A protein deaggregate te produceren. Dit wordt bereikt door eerst HSP 1 0 4 tot expressie te brengen in geoptimaliseerde E. coli-cellen. Het HSP 1 0 4-eiwit wordt vervolgens gezuiverd met behulp van een histidine-affiniteitslabel, gevolgd door een ionenuitwisselingskolom.Na ionenuitwisselingschromatografie wordt de histidinetag afgesplitst met behulp van TEV-protease. De laatste zuiveringsstap bestaat uit het passeren van het afgesplitste HSP 1 0 4-eiwit door een gelfiltratiekolom.Bovendien wordt de Elif-reactivatieassay uiteindelijk gebruikt om vast te stellen of actief HSP 1 0 4 is gezuiverd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande protocollen is zowel het geringe aantal stappen als de grote opbrengst van zeer actief HSP 1 0 4 dat geschikt is voor structurele en mechanistische studies. Personen die nieuw zijn met deze methode kunnen problemen ondervinden omdat de meeste zuiveringsstappen op één dag plaatsvinden, wat resulteert in een demanding schema.Bereid vóór het begin van dit protocol alle benodigde buffers voor de zuivering van HSP 1 0 4 voor, zoals beschreven in het geschreven protocol dat bij deze video hoort. Exprimer vervolgens het HSP 1 0 4-eiwit gedurende de nacht in e coli volgens de procedure die in de tekst na de expressie wordt beschreven; oogst de cellen door centrifugatie. Resuspendeer de celpellets in 10 milliliters voorgekoelde lysisbuffer voorafgaand aan de cellysis met behulp van een French press homogenisator; zorg ervoor dat alle celklontjes zijn gesolubiliseerd. Nadat de homogenisator met lysisbuffer is geëquilibreerd, worden de cellen gelyseerd door twee keer door de cilinder te persen.Bij een snelheid van 15.000 tot 18.000 g verwijder ik het celdebris door centrifugatie en bewaar ik het supernatant voor verdere zuivering. Begin de zuivering van HSP 1 0 4 door het supernatant te mengen met een 50% slurry van lysisbuffer-geëquilibreerde nikkel SRO-beads. Roteer het monster langzaam gedurende drie uur bij vier graden Celsius, zodat de beads gelijkmatig gesuspendeerd blijven en schuimvorming tot een minimum wordt beperkt.Verzamel na incubatie de nikkelsferen door middel van centrifugatie. Was de teruggewonnen nikkelsferen met 25 kolomvolumes wasbuffer. Verzamel de kralen opnieuw door centrifugatie, waarna de wasbuffer via aspiratie kan worden verwijderd.Was de beads vervolgens met vijf kolomvolumes wasbuffer met één molair kaliumchloride, gevolgd door 25 kolomvolumes wasbuffer. Om HSP 1 0 4 te elueren, mengt u de nikkel sphero beads met elutiebuffer en roteert u deze 20 minuten bij vier graden Celsius.Scheid de beads van het eluaat door centrifugatie via lege 1,2 ml spin-kolommen. Elke liter cellen levert ongeveer 15 mg HSB 1 0 4 op.Concentreer op dit punt in de zuivering het eluaat tot ongeveer 1,5 milliliter met behulp van centrifugale concentratoreenheden met een molecular weight cutoff van 30 kDa. Voeg vervolgens 14,5 milliliter buffer Q toe om het eiwit tienvoudig te verdunnen.Herhaal dit proces drie keer met de buffer. Vervang de proteinen vóór de HSP 1 0 4-zuivering via anionenuitwisselingschromatografie. Filtreer het eiwit door een spuitfilter van 0.22 micromolar met een lage eiwitbinding.Inject vervolgens het eiwit op een Resource Q-kolom van 6 ml die is geëquilibreerd met buffer Q. Was zwak bindende eiwitten weg met één kolomvolume 20% buffer B en elueer HSB 1 0 4 met een lineaire gradiënt over vijf kolomvolumes, waarbij fracties van 1 ml worden opgevangen; HSB 1 0 4 en de meeste varianten elueren doorgaans bij ongeveer 400 millimolair natriumchloride. Om de hexa-histidine-tag te verwijderen, wordt het eiwit gewisseld met behulp van een centrifugale concentrator en wordt de tag afgesplitst met TEV-protease volgens de instructies van de fabrikant.Voer de splitsing uit bij 30 °C gedurende twee tot vier uur, gevolgd door een incubatie van 16 uur bij 4 °C. Verwijder alle resterende hexa-histidine-getagde HSB 1 0 4 en TEV-protease met nikkel-SRO's door de beads in overmaat toe te voegen ten opzichte van de hoeveelheid HSP 1 0 4 in de splitsingsreactie. Verwijder vervolgens de beads uit het monster via centrifugatie door lege spinzuilen.Om u voor te bereiden op de laatste zuiveringsstap, dient het eiwit te worden overgezet in een buffer voor grootte-uitsluitingschromatografie met behulp van centrifugale filtereenheden met een molecuulgewichtafsnijding van 30.000, na filtratie door een spuitfilter van 0,22 µm met een lage eiwitbinding. Zuiver HSP 1 0 4 verder via grootte-uitsluitingschromatografie met behulp van een buffer voor grootte-uitsluiting.EQUILIBREER de Superdex 200-kolom. Voer de FPLC-run uit volgens de instructies van de fabrikant. Verzamel na purificatie de HSP104-fracties en concentreer deze in centrifugale concentratie-eenheden. Vanwege materiaalverlies bij het scheiden van HSP104-degradatieproducten en contaminanten bedraagt de uiteindelijke opbrengst van gezuiverd volledig lengte HSP104 ongeveer één tot drie milligram per liter startcultuur.Hier wordt de SDS-PAGE-analyse van de nikkel-sefarose affiniteitszuivering getoond. Het histidine-getagde 105 kilodalton HSP 1 0 4-eiwit is zichtbaar in monsters genomen van het lysaat, de belading van de beads, de doorstroom van de beads en het eluaat van de beads. Let op dat niet alle HSP 1 0 4 in staat is om te binden aan de nikkel-sefarose; nikkel-affiniteitschromatografie wordt gevolgd door ionenuitwisseling op een Resource Q-kolom.De blauwe lijn stelt de absorptie bij 280 nanometer voor en de groene lijn stelt het percentage buffer B voor. De eerste piek, die elueert bij 20%B, bevat onzuiverheden, degradatieproducten en onjuist gevouwen HSP 1 0 4. De belangrijkste piek bevat correct gevouwen en actieve HSP 1 0 4, zoals aangetoond door SDS-PAGE-analyse na ionenuitwisseling. Het HEXA-histidine-HSP 1 0 4-eiwit is onderhevig aan splitsing van de His-tag door klieving met pro TV-protease.Let op dat prot v gesplitst HSP 1 0 4 sneller migreert dan het hexa-histidine en getagde eiwit. Gesplitst HSP 1 0 4 werd vervolgens verder gezuiverd via een AUP O zes gelfiltratiekolom. De piek tussen de stippellijnen vertegenwoordigt de samengevoegde fracties.Hier worden de resultaten van de luciferase-reactivatie-assay getoond, die wordt gebruikt om de disaggregatie-activiteit van HSP 1 0 4 te beoordelen. Gedenatureerde aggregaten van vuurvlieg-luciferase werden geïncubeerd met ofwel HSP 40 en HSP 72, HSB 1 0 4 of HSP 1 0 4, HSP 40 en HSB 72. Gedenatureerd luciferase wordt alleen volledig gereactiveerd in de aanwezigheid van zowel HSP 1 0 4 als HSP 40 en HSP 72, zoals blijkt uit de grote toename in luminescentie. Eenmaal beheerst kan dit protocol in twee dagen worden voltooid als het correct wordt uitgevoerd.

purification-of-hsp104-a-protein-disaggregase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een roman en zeer efficiënte twee-staps affiniteitschromatografie protocol is ontwikkeld en wordt in detail beschreven. De methode is gebaseerd op een kleine zuivering tag met twee inherente affiniteit en is van toepassing op een breed scala van target eiwitten met verschillende eigenschappen.

Orthogonale Protein Purification Gesteund door een Small Bispecifieke Affiniteit Tag

Source: Murata, T., et al. Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a step-by-step procedure for the purification of a polyhistidine-tagged protein secreted from Streptococcus mutans.

A Procedure for the Purification of a Polyhistidine-Tagged Protein from Streptococcus mutans

In het huidige protocol, demonstreren we een zeer efficiënte en kosteneffectieve kleinschalige eiwitreiniging methode, die de zuivering van recombinante eiwitten mogelijk maakt door de unieke combinatie van een splitsbaar GST-tag en een kleine His-tag.

GST-Zijn zuivering: een twee-staps Affiniteitszuivering Protocol Meegevende Full-length gezuiverde eiwitten

Dit artikel beschrijft het gebruik van een vuurvlieg luciferase-GFP-fusie-eiwit te...

Gekoppeld Testen voor Monitoring Protein Refolding in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Gist-eiwitopathiemodellen zijn waardevolle instrumenten om de toxiciteit en aggregatie van eiwitten die betrokken zijn bij ziekten te beoordelen. Hier presenteren we methoden voor het screenen van Hsp104 variantenbibliotheken op toxiciteitsonderdrukkers. Dit protocol kan worden aangepast om elke eiwitbibliotheek te screenen op toxiciteitsonderdrukkers van elk eiwit dat toxisch is in gist.

Isoleren versterkt Hsp104 Varianten Met behulp Gist proteïnopathie Modellen

Een procedure wordt gepresenteerd voor het uiteinde van de dCACHE periplasmische ligand bindend domein van Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 van integratie-organen en de zuivering aan opbrengst milligram hoeveelheden eiwit.

Methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de Chemoreceptor-Ligand bindend domein

Hier presenteren we een robuust en geoptimaliseerde protocol voor de productie van milligram hoeveelheden native, tag-vrije monomeren en fibrillen van de exon1 van het eiwit Huntingtin (Httex1) op basis van de voorbijgaande fusie van kleine ubiquitin verwante modifier (SUMO).

Generatie van eigen, niet-gecodeerde Huntingtin Exon1 monomeer en fibrillen met behulp van een SUMO Fusion strategie

Een van de meest uitdagende stress voorwaarden die organismen tijdens hun leven tegenkomen gaat de accumulatie van oxidanten. Tijdens oxidatieve stress afhankelijk cellen sterk zijn van moleculaire chaperones. Hier presenteren we methoden voor het onderzoeken van de redox-gereglementeerde anti-aggregatie activiteit, evenals het monitoren van de structurele veranderingen in het bestuur van de Chaperon-functie met behulp van HDX-MS.

Hsp33 de Redox-gereglementeerde Chaperone activiteit definiëren en in kaart brengen van de wijzigingen van de conformationele op Hsp33 met behulp van spectrometrie van de massa van de Exchange waterstof-deuterium

Hier beschrijven we een methode voor de zuivering van histidine-gelabelde pyrophosphokinase enzymen en met behulp van Dunnelaagchromatografie van radioactief gelabelde substraten en producten voor de enzymatische activiteit in vitroassay. De enzym activiteit bepaling geldt in grote lijnen aan kinase, nucleotide cyclase, of fosfor-overdracht reactie waarvan mechanisme nucleotide trifosfaat hydrolyse omvat.

Een zuivering en In Vitro activiteit Assay voor een (p) ppGpp Synthetase van Clostridium difficile

Dit protocol beschrijft een zuiveringsmethode voor recombinant tag-vrij calcium bindend proteïne S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor humane monocyt stimulatie testen.

Zuivering van de menselijke S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor Immuuncelstimulatie

Dit artikel beschrijft een methodologie voor het tot overexpressie brengen van recombinant Nsp15, een toxische nuclease, in een C41(DE3) expressiesysteem, gevolgd door zuivering van het gelabelde eiwit met behulp van affiniteits- en grootte-uitsluitingschromatografie. Deze protocollen kunnen worden aangepast voor andere uitdagende giftige eiwitten.

Overexpressie en zuivering van een toxische nuclease van Escherichia coli

Leer de zuivering van Hsp104, een hexamerische AAA+ eiwitdisaggregase uit gist, met affiniteitschromatografie en gelpermeatie. Dit protocol levert hoogactief eiwit voor structurele en functionele studies.

Zuivering van Hsp104, een eiwit Disaggregase

Meer video's verkennen