Name: Chromatografische zuivering van sterk actieve gist Ribosomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Leer een snelle chromatografische zuiveringsmethode voor gistribosomen met behulp van een cysteïne-geladen SFO-link-kolom. Deze techniek scheidt ribosomen effectief van nucleases en proteasen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen iedereen bedanken van de leden van de Dinman laboratorium, waaronder Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, en Michael Rhodin voor hun hulp en inbreng aan dit project. Dit werk werd ondersteund door subsidies aan AM van de American Heart Association (AHA 0630163N) en JDD van de National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL werd ondersteund door een Amerikaanse Reinvestment and Recovery Act van 2009 aan te vullen aan de ouder-subsidie ​​(3R01GM058859-11S1).

1. De voorbereiding van een cysteine ​​geladen Sulfolink hars <ol><li> Bereid Sulfolink hars (Pierce) bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats een totaal van 10 ml van een 50% suspensie van Sulfolink koppeling gel zoals geleverd door de fabrikant in twee 10 ml plastic flacons met 5 ml verdeeld in elke flacon. </li><li> Kort centrifuge flacons bij 850 xg en verwijder voorzichtig supernatant. </li><li> Was de gel drie keer in koppeling-buffer (50 mM Tris, pH 8,5, 5 mM EDTA) door resuspenderen de kralen in 5 ml, centrifugeren even op 850 xg en het verwijderen van het supernatant met een pipet. </li><li> Voeg vervolgens vijf ml van een 50 mM oplossing van L-cysteïne in koppeling buffer aan elke buis en meng de slurry gedurende 1 uur bij 25 ° C. </li><li> Verwijder de resterende L-cysteïne door wassen zoals beschreven in stap 1.4 hierboven. </li><li> Resuspendeer de gel in 10 ml van een bindende buffer [20 mM HEPES, pH 7,6, 5 mM Mg (OAc) 2, 60 mM NH 4 Cl, 2 mM DTT], en evenwicht van de hars door wassen in 10 ml bindingsbuffer3 keer zoals beschreven in stap 1.4. Giet hars in een 10 ml centrifuge kolom, cap en opgeslagen bij 4 ° C. De hars capaciteit voor RNA-binding is ~ 20 A 260 eenheden per ml. </li></ol> 2. Chromatografische zuivering van ribosomen met behulp van een cysteïne geladen Sulfolink hars Opmerking: Als het werken met een stam waar de protease-activiteit blijkt te zijn een probleem, protease remming cocktails kan worden gebruikt in alle volgende buffers. <ol><li> Onderhoud van alle componenten op het ijs en voor te bereiden alle oplossingen met behulp van RNase-vrij water en steriele filtratie. </li><li> Grow gistcellen 's nachts tot midden-log fase (OD 595 = 0.6-1.2) in geschikte media. Pellet cellen door centrifugeren, en was een gram cellen in bindingsbuffer en centrifugeer bij 3700 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer cellen in 1 ml van een bindende buffer naar een totaal volume van ongeveer 2 ml, en verstoren met behulp van een gelijk volume van 0,5 mm glazen kralen gekoeld tot 4 ° C uzingen een Biospec Mini-bead beater (Bartlesville, OK). Monsters kunnen worden opgesplitst in meerdere buizen als dat nodig is. </li><li> Verwijder de ongebroken cellen, organellen, en cellulaire puin door centrifugatie bij 30.000 xg gedurende 30 minuten in een Beckman-Coulter Optima Max E ultracentrifuge (Fullerton, CA). </li><li> Vlak voor het gebruik, pellet de hars van een minuut bij 1000 xg tot de opslag oplossing te verwijderen. Twee ml van de hars wordt gebruikt voor elke gram een ​​van de cellen. </li><li> Verwijder cellysaat supernatanten van de 30.000 xg spin (S30), en zorg ervoor dat contaminatie van ofwel de lipide fractie aan de top of de cel puin op de bodem van de buizen, en plaats te minimaliseren direct in de in rekening gebrachte Sulfolink slurry. De lipide laag kan worden vermeden ofwel door het verwijderen of door te duwen uit de pipet na de tip heeft overschreden in het supernatant. </li><li> Incubeer de S30/Sulfolink mengsel op ijs zonder het te mengen gedurende 15 minuten. </li><li> Plaats de kolommen in 15 ml conische buizen en centrifugeer bij 1000 xg gedurender een minuut. </li><li> Plaats de doorstroomsysteem fracties in de kolommen, meng met de hand, en incubeer nog 15 minuten op ijs. </li><li> Plaats de kolommen in 15 ml conische buizen en centrifugeer bij 1000 xg gedurende een minuut. Gooi het doorstroomsysteem. </li><li> Cap kolommen en voeg 5 ml van de binding buffer. Meng kolommen met de hand tot geresuspendeerd, verwijdert u de doppen, en centrifugeer de kolommen centrifuge bij 1000 xg gedurende een minuut. Herhaal dit protocol het wassen twee keer. </li><li> Voeg 1,5 ml elutie buffer (20 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM KCl, 2 mM DTT, 0,5 mg / ml heparine) om elke kolom. Meng slurries met de hand, en incubeer op ijs gedurende 2 minuten </li><li> Plaats kolommen in nieuwe 15 ml conische buizen en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 1 minuut. Verzamel eluaat. Herhaal de elutie stap eens te meer, zodat de uiteindelijke combinatie monster volumes zijn ~ 3 ml. Gebruikte hars kan worden gewassen met elutiebuffer zonder heparine, gevolgd door evenwicht met bindende Buffer, en opgeslagen in 10 ml volumes van bindingsbuffer bij 4 ° C voor hergebruik later. </li></ol> 3. Puromycine behandeling Opmerking: Een alternatieve methode om te verwijderen vervuilende tRNA soorten is over te schakelen van een glucose rijk aan glucose uitgeput media om ribosoom afvoer te bevorderen. Echter, dit verandert de metabole status van de gistcellen, die ribosoom functie en concentratie zou kunnen beïnvloeden. Met het oog op de ribosomen strook van endogene peptidyl-tRNA, een behandeling met puromycine wordt uitgevoerd. <ol><li> Neutraliseren tot pH 7,5 100 mM puromycine oplossing door het toevoegen van 1 M KOH druppelsgewijs bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg geneutraliseerd puromycine oplossing voor ~ 1 mM uiteindelijke concentratie in eluaat. </li><li> Voeg 100 mM GTP tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM. </li><li> Incubeer gedurende 30 minuten bij 30 ° C. </li></ol> 4. Zuivering van ribosomen door sedimentatie door glycerol kussens <ol><li> Plaats een mlvan kussen buffer (20 mM HEPES, pH 7,6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM KCl, 2 mM DTT, 25% glycerol) in een 4 ml volume polycarbonaat ultracentrifuge buis. </li><li> Voorzichtig laag puromycine behandeld elutie fracties op de top van het kussen, en centrifugeer monsters op 100.000 xg overnacht bij 4 ° C. </li><li> Verwijderen van buizen uit de centrifuge rotor, en zuig supernatants. </li><li> Was de pellets met gezuiverde ribosomen tweemaal met 1 ml kussen buffer. </li><li> Resuspendeer ribosomen in 100 ul buffer kussen door lichte verstoring met een glazen staaf. </li><li> Na de onderbreking, bedek buizen met parafilm en schud bij een gematigde snelheid in een koude kamer vortex gedurende een uur. </li><li> Breng de inhoud naar een microcentrifugebuis, centrifugeren gedurende 5 minuten op maximale snelheid bij 4 ° C, en verwijder supernatant in de frisse buizen. </li><li> Herhaal de stappen 4,1 tot 4,7 met behulp van 2 ml van de buffer en kussen, behalve dat 100 ul van opslag buffer (50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 50 mM NH 4 Cl, 5 mM Mg(OAc) 2, is 1 mM DTT, 25% glycerol) worden gebruikt in de stappen 4.4 en 4.5 in plaats van kussen buffer. </li><li> Kwantificeren van de gezuiverde ribosomen spectrofotometrisch (1 A 260 = 20 pmol van gist ribosomen), en bewaar bij -80 ° C. Typische resultaten van 1 gram gist worden 300-400 pmol van ribosomen. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Een voorbeeld van RNA soorten uit elk van de drie belangrijkste stappen van het protocol is weergegeven in figuur 2. Terwijl rRNAs zijn de belangrijkste soorten die aanwezig zijn in totaal cellysaten (T) ook deze bevatten een groot aantal andere soorten RNA. Ribosomen gezuiverd van de Sulfolink kolom (SL) bevatten ook een grote hoeveelheid tRNA's als gevolg van de hoge affiniteit van de kolom bed voor deze soorten ook. Behandeling van deze fractie met puromycine resulteert in hydrolyse van peptiden van peptidyl-tRNA's, en bevordert dissociatie van deze soorten uit ribosomen. De puromycine behandelde monsters (Pm) gebrek aan co-purifying tRNA soorten, en vormen dus helemaal zuiver ribosomen. Zoals eerder gemeld 8, zijn deze ribosomen zijn zeer intact en biochemisch actief is, waardoor ze ideaal zijn substraten voor gedetailleerde functionele en structurele analyses. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Methode Flowchart. Chromatografisch zuivering van ribosomen met behulp van de cysteïne gekoppelde sulfolink hars is afgebeeld. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Representatieve analyse van de ribosoom de voorbereidingen. Totaal RNA soorten werden geëxtraheerd uit totaal cellysaten (T), Sulfolink gezuiverd ribosomen (SL) en Sulfolink gezuiverd ribosomen vervolgens behandeld met puromycine en afgezet door middel van een glycerol kussen (Pm). Lane M staat voor RNA grootte markers. Bands die 25S en 18S rRNA, evenals tRNA's en andere soorten RNA worden aangegeven. Allerijstroken werden geladen met 2 ug van RNA.

<ol><li>Palade, G. E., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+microsomes%3B+an+integrated+morphological+and+biochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).</li>
<li>Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interactions+of+Escherichia+coli+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).</li>
<li>Jelenc, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+highly+active+ribosomes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli.</a> Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).</li>
<li>Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+bacterial+ribosomes+using+chloramphenicol+and+erythromycin+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns.</a> Biochimie. 62, 69-77 (1980).</li>
<li>Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+important+amino+acids+of+ribosomal+protein+L3+by+saturation+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis.</a> Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).</li>
<li>Algire, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+reconstituted+yeast+translation+initiation+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system.</a> RNA. 8, 382-397 (2002).</li>
<li>Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+chromatography+system+to+isolate+active+ribosomes+from+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria.</a> RNA. 14, 188-195 (2008).</li>
<li>Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purity%2C+activity+and+structural+integrity+of+yeast+ribosomes+purified+using+a+general+chromatographic+method%5BTitle%5D)+AND+%22RNA.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method.</a> RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).</li>
<li>Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNA+binding+to+80S+ribosomes+from+yeast%3A+evidence+for+three+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).</li>
<li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+puromycin+action%3A+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).</li>
<li>Nathans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromuycin+inhibition+of+protein+synthesis%3A+incorporation+of+puromycin+into+peptide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).</li>
<li>Rabinovitz, M., Fisher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dissociative+effect+of+puromycin+on+the+pathway+of+protein+synthesis+by+Ehrlich+ascites+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).</li>
<li>Allen, D. W., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+puromycin+on+rabbit+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).</li>
<li>Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+by+puromycin+of+amino+acid+incorporation+into+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).</li>
<li>Becker-Ursic, D., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+of+ribosomal+proteins+by+protein+kinases+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Ribosoom zuivering protocollen in principe te betrekken lyseren cellen, het oogsten een cytosolische fractie van een lage snelheid draaien, en dan pelletering ribosomen door de hoge snelheid centrifugeren 1. Terwijl een paar nieuwe methoden zijn gebruikt voor het zuiveren van bacteriële ribosomen, had hetzelfde niet geldt voor eukaryoten 2-4. Hoewel de extra stappen zijn toegevoegd aan de jaren, zoals het zout wast, en glycerol kussens (bijv. zie 5), hebben biochemische en structurele st...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> Sulfolink Koppeling hars </td><td> Doorboren </td><td> 20402 </td></tr><tr><td> Mini bead-beater 16 </td><td> Biospec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> Optima Max E ultracentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td></td></tr><tr><td> Legende RT </td><td> Sorvall </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 mm Glas kralen </td><td> Biospec </td><td> 11079105 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 252859 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54459 </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td></tr><tr><td> Mg (OAc) 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5661 </td></tr><tr><td> KOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 221473 </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5516 </td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7255 </td></tr><tr><td> GTP </td><td> Fermentas </td><td> R0461 </td></tr></tbody></table>

chromatografische zuivering van sterk actieve gist ribosomen

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotische ribosomen zijn veel meer labiel in vergelijking met hun eubacteriële en archael tegenhangers, waardoor die een belangrijke uitdaging voor onderzoekers. Bijzonder lastig is het feit dat lysis van de cellen een groot aantal proteasen en nucleasen die kunnen afbreken ribosomen releases. Zo is het belangrijk om ribosomen te scheiden van deze enzymen zo snel mogelijk. Helaas, conventionele differentieel ultracentrifugatie methoden laat ribosomen blootgesteld aan deze enzymen voor onaanvaardbaar lange tijd, invloed zijn op hun structurele integriteit en functionaliteit. Om dit probleem, wij maken gebruik van een chromatografische methode met behulp van een cysteïne gebracht Sulfolink hars. Deze eenvoudige en snelle toepassing vermindert co-zuiverende proteolytische en nucleolytische activiteiten, het produceren van hoge opbrengsten van een intact, zeer biochemisch actieve gist ribosomen. Wij stellen voor dat deze methode ook moeten gelden voor zoogdieren ribosomen. De eenvoud vande methode, en de verbeterde zuiverheid en activiteit van chromatografisch gezuiverd ribosoom is een belangrijke technische vooruitgang voor de studie van eukaryotische ribosomen.

Verontreiniging van de voorbereidingen van eukaryotische ribosomen gezuiverd door middel van traditionele methoden door co-zuiveren nucleasen en proteasen negatief effect op de downstream-biochemische en structurele analyses. Een snelle en eenvoudige chromatografische zuivering methode wordt gebruikt om dit probleem op met behulp van gist ribosomen als een modelsysteem op te lossen.

Chromatografische zuivering van sterk actieve gist Ribosomen

Eukaryote ribosomen zijn veel labieler dan hun eubacteriële en archaeale tegenhangers, wat een aanzienlijke uitdaging vormt voor onderzoekers.

Het algemene doel van deze procedure is het zuiveren van intacte, zeer actieve gistribosomen. Dit wordt bereikt door eerst de cellen te lyseren en het lysaat te klaren middels hogesnelheidscentrifugatie. Om de S 30-defractie te verkrijgen, wordt vervolgens een cysteïne-geladen SFO-link-kolom gebruikt om de ribosomen te zuiveren.Vervolgens worden contaminerende tRNA's verwijderd met purmycine-behandeling als laatste zuiveringsstap. De ribosomen worden onderworpen aan ultrasnelcentrifugatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals zuivering via ultracentrifugatie, is dat het gebruik van de sulfa-linkkolom ribosomen snel scheidt van contaminerende exonucleasen en proteasen.Verder scheidt de stap met puromycine-behandeling de ribosomen van contaminerende RNA-soorten zoals tRNA's. Deze stappen waarborgen de productie van grote hoeveelheden zeer actieve, intacte gezuiverde ribosomen voor gebruik in biochemische en structurele studies. De procedure zal worden gedemonstreerd door Jonathan Leschen, een postdoctoral research associate uit mijn laboratorium.Begin dit protocol door een 50% slurry van sulfa link coupling gel, zoals geleverd door de fabrikant, in twee plastic flacons van 10 milliliter te pipetteren, waarbij vijf milliliter in elke flacon wordt verdeeld. Centrifugeer de flacons kort bij 850 ×g. Verwijder voorzichtig de supernatant. Was de gel drie keer in coupling buffer door de beads opnieuw te suspenderen in vijf milliliter en vervolgens kort te centrifugeren bij 850 ×g. Verwijder de supernatant met een pipet. Voeg na het wassen van de hars vijf milliliter van een 50 millimolaire oplossing van L-cysteïne in coupling buffer toe aan elke buis.Meng de slurry gedurende één uur bij 25 °C. Verwijder vervolgens het resterende L-cysteïne door de hars drie keer te wassen met enkel koppelingsbuffer. Resuspendeer de gel daarna in 10 milliliters bindingsbuffer en equilibreer de hars door deze drie keer te wassen.Giet tot slot de hars over in een centrifugekolom van 10 milliliter en sluit deze af. De hars kan worden bewaard bij vier graden Celsius en heeft een harscapaciteit van ongeveer 20 tot 60 eenheden per milliliter tijdens de chromatografische zuivering van ribosomen. Maak hierbij gebruik van een cystine-geladen sulfa-link-hars.Houd alle componenten op ijs en bereid alle oplossingen met RNAse-vrij water en via steriele filtratie. Kweek gistcellen gedurende de nacht tot de mid-logfase in het geschikte medium. Nadat de cellen door centrifugatie zijn afgevolkt, wordt één gram cellen gewassen in bindingsbuffer en opnieuw gecentrifugeerd; resuspendeer de cellen vervolgens in één milliliter bindingsbuffer tot een totaal volume van ongeveer twee milliliter.Disrumpeer de cellen met behulp van een gelijk volume 0,5 millimeter glasparels gekoeld tot vier graden Celsius, en een mini bead beader. Verwijder ongebroken cellen, organellen en cellulair debris door centrifugatie bij 30.000 ×g gedurende 30 minuten in een ultracentrifuge. Pellet ondertussen de hars gedurende één minuut bij 1000 ×g. Verwijder de bewaaroplossing onmiddellijk voor gebruik.Er worden twee milliliters hars gebruikt voor elke gram cellen. Na ultracentrifugatie van de monsters worden de supernatanten van het cellysaat verwijderd uit de centrifugatieronde van 30 000 ×g, aangeduid als S 30. Zorg ervoor dat contaminatie door zowel de lipidfractie aan de bovenkant als het celdebris aan de onderkant van de buisjes tot een minimum wordt beperkt.Breng de supernatanten direct over naar de geladen SFO link slurry. Incubeer het S 30 SFO link mengsel 15 minuten op ijs. Plaats de kolommen in conische buizen van 50 milliliter en centrifugeer een minuut bij 1000 ×g, breng de flow-through fracties terug in de kolommen, sluit de kolommen af en keer ze om om te mengen.Incubeer de monsters nog 15 minuten op ijs. Plaats de kolommen vervolgens in conische buizen van 50 milliliter en centrifugeer een minuut lang bij 1000 ×g; gooi de doorstroom weg. Voeg vijf milliliter bindingsbuffer toe, sluit de kolommen af en keer ze om om te mengen tot de monsters zijn geresuspendeerd.Verwijder de dopjes en centrifugeer de kolommen 1 minuut lang bij 1000 ×g. Herhaal dit wasprotocol nog twee keer. Voeg vervolgens 1,5 ml elutiebuffer toe aan elke kolom.Meng de suspensies handmatig en incubeer twee minuten op ijs. Als laatste stap worden de kolommen in nieuwe conische buisjes van 50 milliliter geplaatst en gecentrifugeerd bij 1000 ×g. Verzamel gedurende één minuut het eluaat en herhaal de elutiestap nogmaals, zodat de uiteindelijke gecombineerde monster-volumes ongeveer drie milliliters bedragen. Om de ribosomen van endogeen tRNA te strippen, wordt een behandeling met puromycine uitgevoerd.Neutraliseer eerst een 100 millimolaire purmycine-oplossing tot pH 7,5 door druppelsgewijs één molaire kaliumhydroxide toe te voegen. Voeg dit bij kamertemperatuur toe. Voeg de geneutraliseerde purmycine-oplossing toe tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer één millimolair in het eluaat.Voeg vervolgens 100 millimolaire GTP toe tot een eindconcentratie van 1 millimolair. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 30 °C. Plaats na de incubatie 1 milliliter kussenbuffer in een polycarbonaat ultracentrifugebuis met een volume van 4 milliliter.Laag de met puromycine behandelde elutiefracties voorzichtig op het kussen en centrifugeer de monsters gedurende de nacht bij 100.000 ×g. Nadat de supernatanten zijn afgezogen, worden de pellets met de gezuiverde ribosomen gewassen met één milliliter kussenbuffer. Herhaal deze wasstap met een tweede milliliter kussenbuffer.Vervolgens resuspendeerde Reza de ribosomen in 100 µL kussenbuffer door voorzichtig te homogeniseren met een glazen roerstok. Dek daarna de buisjes af met Parafilm en schud deze op matige snelheid in een vortex in een koelruimte. Na een uur schudden wordt de inhoud overgebracht naar een microcentrifugebuis en vijf minuten gecentrifugeerd op maximale snelheid bij 4 °C.Breng de supernatten over naar nieuwe buisjes. Laag de supernatten bovenop twee milliliters kussenbuffer in een ultracentrifugebuis, gevolgd door centrifugatie bij 100 000 ×g gedurende de nacht. Verwijder de volgende dag de buisjes uit de centrifuge-rotor en aspireer de supernatten.Gebruik de zojuist beschreven methode. Was de pellets en resuspendeer de ribosomen met bewaarbuffer. Kwantificeer tot slot de gezuiverde ribosomen spectrofotometrisch voordat ze bij -80 °C worden bewaard.Hier wordt een voorbeeld getoond van RNA-soorten geëxtraheerd uit elk van de drie belangrijkste stappen van het protocol, inclusief de totale cellysaten, de sufu-link, gezuiverde ribosomen, en de sufu-link gezuiverde ribosomen die vervolgens zijn behandeld met purmycine en zijn gesedimenteerd door een glycerolkussen. RNA-groottemarkers worden ook getoond, terwijl onze RNA's de belangrijkste aanwezige soorten zijn in totale cellysaten. Deze bevatten ook een groot aantal andere RNA-soorten.Ribosomen die zijn gezuiverd met de sulfa link-kolom bevatten een grote hoeveelheid tRNA's vanwege de hoge affiniteit van het kolombed voor deze soorten. Behandeling van deze fractie met puromycin resulteert in hydrolyse van peptiden van peptidyl-tRNA's en bevordert de dissociatie van deze soorten van de ribosomen. De met puromycin behandelde monsters bevatten geen co-gezuiverde tRNA-soorten en vertegenwoordigen derhalve volledig zuivere ribosomen.Zoals eerder gerapporteerd, zijn deze ribosomen zeer intact en biochemisch actief, waardoor ze ideale substraten zijn voor gedetailleerde functionele en structurele analyses. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals assays om de binding van liganden aan ribosomen te monitoren en structurele analyses, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de biochemische en biofysische eigenschappen van eukaryote ribosomen zijn.

chromatographic-purification-of-highly-active-yeast-ribosomes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Beschrijven we een snelle en effectieve methode voor de zuivering van mitochondriën van de...

Zuivering van Mitochondriën uit gistcellen

Dit artikel beschrijft een protocol voor de extractie van het vertalen van ribosomen van eukaryotische cellen. Eenmaal uitgepakt, worden ribosomen gescheiden in monosomes en polyribosomes door sucrose gradiënt fractionering om verschillende ribosomale populaties te analyseren. Als zodanig is deze methode is de gouden standaard voor de behandeling van de regulering van de vertaling.

Eukaryotische Polyribosome Profiel Analyse

Source: Becker, B., et al. A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the purification of a polyhistidine-tagged recombinant protein using nickel-based affinity chromatography. It outlines key steps, including bacterial lysis by sonication, clarification and filtration of the lysate, and selective binding and elution of the target protein using imidazole.

 An Affinity Chromatography Technique for the Purification of a Recombinant Bacterial Protein

De bereiding van hoogwaardige gist celextracten is een noodzakelijke eerste stap in de analyse van afzonderlijke eiwitten of hele proteomen. Hier een snelle, efficiënte en betrouwbare homogeniseren protocol voor gist cellen die is geoptimaliseerd om proteïnefuncties, interacties, en post-translationele modificaties behouden beschrijven we.

Ontluikende Gist Protein extractie en zuivering voor de Studie van de functie, interacties, en post-translationele modificaties

Dit manuscript beschrijft de detectie van sumoylation en ubiquitinering van kinetochoor eiwitten, Ndc10 en Ndc80, in de gist Saccharomyces cerevisiae.

Eiwitzuivering Techniek dat Detectie van sumoylation en Ubiquitinering van Budding gist kinetochoor Eiwitten Ndc10 en Ndc80 Maakt

Hier presenteren we een protocol om express, solubilize en zuiveren van diverse eukaryotic boraat vervoerders met homologie aan de SLC4 transporter familie met behulp van gist. Ook beschrijven we een chemische cross-linking test om te beoordelen van de gezuiverde homomeric eiwitten voor montage van de multimeric. Deze protocollen kunnen worden aangepast voor andere uitdagende membraaneiwitten.

Meningsuiting, solubilisatie en zuivering van eukaryotische boraat Transporters

Hier presenteren we een workflow voor de expressie, zuivering en liposoom binding van SNX-BAR heterodimers in gist.

Expressie, zuivering en liposoom binding van ontluikende gist SNX-BAR Heterodimers

We presenteren een snelle en kosteneffectieve methode om het recombinante PURE celvrije TX-TL-systeem te produceren met behulp van standaard laboratoriumapparatuur.

OnePot PURE Celvrij Systeem

We presenteren een techniek om translationele (eiwitbiosynthese) complexen snel te stabiliseren met formaldehyde crosslinking in levende gist- en zoogdiercellen. De aanpak maakt het mogelijk om transiënte tussenproducten en dynamische RNA:eiwitinteracties te ontleden. De crosslinked complexen kunnen worden gebruikt in meerdere downstream-toepassingen, zoals in op diepe sequencing gebaseerde profileringsmethoden, microscopie en massaspectrometrie.

Snelle in vivo fixatie en isolatie van translationele complexen uit eukaryote cellen

Co-translationele interacties spelen een cruciale rol bij ontluikende ketenaanpassingen, targeting-, vouw- en assemblagepaden. Hier beschrijven we Selective Ribosome Profiling, een methode voor in vivo, directe analyse van deze interacties in het model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering

Dit protocol presenteert een locus-specifieke chromatine-isolatiemethode op basis van plaatsspecifieke recombinatie om een single-copy genlocus van belang in zijn natuurlijke chromatinecontext te zuiveren van ontluikende gist, Saccharomyces cerevisiae.

Single-Copy Gene Locus Chromatine Zuivering in Saccharomyces cerevisiae

Leer een snelle chromatografische zuiveringsmethode voor gistribosomen met behulp van een cysteïne-geladen SFO-link-kolom. Deze techniek scheidt ribosomen effectief van nucleases en proteasen.

Chromatografische zuivering van sterk actieve gist Ribosomen

Meer video's verkennen