Ontwikkeling van een eenzijdig-gelaedeerde 6-OHDA muismodel van de ziekte van Parkinson

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van een muismodel voor Parkinsonisme. Dit wordt bereikt door eerst de geneesmiddelen voor de operatie voor te bereiden. De volgende stap is het inrichten van de chirurgische apparatuur, waarna een unilaterale zes-hydroxy-dopamine-laesie-operatie wordt uitgevoerd, gevolgd door een passende postoperatieve zorg.

De zes met 6-hydroxydopamine gelesioneerde dieren kunnen worden gebruikt voor gedragsexperimenten. Uiteindelijk tonen de resultaten een dopamine-uitputting van meer dan 95% in de mediale voorherstenbundel aan één zijde. De twee belangrijkste aspecten van deze procedure waar men op moet letten, zijn ten eerste de juiste postoperatieve zorg om het overleven van de dieren te garanderen.

Ten tweede, bereid de apparatuur voor de infusie van zes-hydroxy-dopamine zorgvuldig voor om een volledige toediening van het neurotoxine te garanderen. Steriliseer als eerste stap de chirurgische instrumenten in een autoclaaf. Reinig vervolgens alle oppervlakken en apparatuur met isopropylalcohol.

Bereid vervolgens de post-operatieve fase voor door een herstelkooi voor muizen in te richten met keukenpapier op de bodem. Plaats de kooi onder een warmtelamp of op een warmtepad om de anesthesiewagen klaar te zetten. Controleer of de zuurstofstroom is aangesloten en open staat, en of het isofluraanreservoir volledig gevuld is.

Stel daarna de zuurstofstroom in op 1% en het isofluraan op 2 tot 4%. De volgende stap is het assembleren van het infusieapparaat. Draai één RN-metalen moer op één zijde van de Peak-slang, gevolgd door de Peak-cup-ferrule. Plaats vervolgens de canonische PFA-ferrule; richt de ferrules zodanig dat de kegel op de canonische PFA-ferrule in het aansluitende deel van de Peak-cup-ferrule schuift.

Plaats vervolgens de gekoppelde peak cup en de canonieke PFA-ferrule in elk uiteinde van de dual small hub RN-koppelaar en draai de RN-metalen moer aan het andere uiteinde van de dual small hub RN-koppelaar vast. Voeg een injectienaald van 33 gauge toe. Rijg de naald door een van de RN-metalen moeren en draai deze vast.

Zorg ervoor dat de naald van 33 gauge in een hoek van 180 graden ten opzichte van de dual small hub RN-koppeling staat. Schroef vervolgens aan het andere uiteinde van de Peak-slang een van de RN-metalen moeren en daarna een Peak-cup ferrule. Plaats vervolgens de canonieke PFA-ferrule in de diepere groef van de tweede dual small hub RN-koppeling en draai de RN-metalen moer vast om de verbinding te zekeren.

Plaats vervolgens aan het andere uiteinde van de tweede kleine dubbele RN-hubkoppeling de lure in de kleine RN-hubadapter en draai de metalen RN-moer van de lure vast om de verbinding te zekeren. De opstelling van het infusieapparaat is nu voltooid. Een volgende voorbereidende stap is het primen van het infusieapparaat.

Vul eerst de 250 µL en 1 µL Hamilton-spuiten met steriel water. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Bevestig vervolgens de 250 µL spuit aan de lure-adapter en druk de zuiger van de 250 µL spuit in, zodat er water vrijkomt via de 33 gauge injectienaald aan het andere uiteinde van de slang.

Blijf water door het systeem persen terwijl u de 250 µL spuit uit de luer-adapter trekt. Laat een kleine waterdruppel op het uiteinde van de luer-adapter achter en druk de zuiger van de 1 µL spuit in tot er een kleine waterdruppel wordt uitgestoten. Plaats vervolgens voorzichtig de 1 µL spuit in de luer-adapter.

Zorg ervoor dat de waterdruppel op de spuit van 1 µL aansluit op de waterdruppel op de lure-adapter. Voeg vervolgens de spuit van 1 µL volledig in de lure-adapter in en controleer of er geen luchtbellen aanwezig zijn in de kleine dual RN hub koppelaar. Bevestig nu het perfusieapparaat aan het stereotaxische frame en klem de infusiepomp de kleine dual RN hub koppelaar met de injectienaald van gauge 33 aan de manipulatorarm van het stereotaxische frame.

Klem vervolgens de spuit van één microliter aan de perfusiepomp. Programmeer daarna de infusiepomp op een infusiesnelheid van 0,1 microliter per minuut, 30 minuten vóór de operatie. Weeg het dier en noteer het gewicht.

Dien een mengsel van 2,5 mg/mL dopaminehydrochloride en 0,5 mg/mL parlinehydrochloride toe aan de muis via een intraperitoneale injectie in een volume van 10 mL/kg. Plaats vervolgens een warme warmteschijf onder de oorstangen en de snijtandsstang om de temperatuur van het dier tijdens de operatie te handhaven en houd het dier op een ideale hoogte zodat de oor- en snijtandsstangen van het stereotaxische frame passen. Wacht 15 minuten na de injectie van het mengsel van dopaminehydrochloride en parlinehydrochloride.

Plaats de muis in een gesloten convulsiekamer. Anestheseer het dier door inhalatie van isofluraan. Het dier is voldoende geanestheseerd wanneer het geen reactie vertoont op een knijpreflex van de achterpoot en geen knipperreflex vertoont.

Scheer vervolgens de bovenkant van de kop van de muis. Plaats de muis op dit punt in het stereotaxisch frame. Plaats de snijtandhouder in de bek en een anesthesiemasker over het gezicht.

Stel vervolgens de stroomsnelheid van isofluraan in. Breng het lokale anesthetische middel lidocaïne direct op de huid aan met behulp van watten. Pas de snijtandstang en de oorschelpen aan om de bovenkant van de schedel waterpas te maken.

Steriliseer vervolgens de huid met een Betadine-oplossing. Plaats daarna de oorschelpen. De oorschelpen zijn correct geplaatst wanneer de kop volledig vlak ligt en niet meer in 어느 richting kan worden bewogen.

Snijd daarna langs de middellijn van de kop met een scalpelmesje en trek de huid opzij. Droog het oppervlak van de schedel af met een gaasje. Druk de zuiger van de spuit van 1 µL in en plaats de injectienaald van 33 gauge in de buis van 1 mL met 15 mg/mL.

Zes-hydroxydopamine-oplossing afgedekt met aluminiumfolie. Trek de zuiger langzaam naar achteren terwijl de injectienaald van 33 gauge ondergedompeld blijft in de zes-hydroxydopamine-oplossing. Beweeg vervolgens de punt van de injectienaald naar B bgma en doseer een kleine hoeveelheid zes-hydroxydopamine-oplossing om een kleine druppel te vormen.

Laat vervolgens de tip van de injectienaald langzaam zakken tot aan de torema. Zodra de naald de bgma raakt, stopt u met het verder voeren van de naald en noteert u deze coördinaten. Trek de injectienaald twee millimeter terug in dorsale richting en beweeg langs de sagittale sutuur in rostrale richting naar Lambda.

Wanneer de naald zich boven Lambda bevindt, brengt u een kleine hoeveelheid six hydroxy dopamine-oplossing uit de injectienaald over om een kleine druppel te vormen. Laat de naaldpunt vervolgens langzaam zakken naar Lambda. Zodra de druppel Lambda raakt, stopt u met het verder bewegen van de naald en noteert u deze coördinaten.

De mediaal-laterale en dorso-ventrale coördinaten moeten identiek zijn voor BMA en Lambda. Indien dit niet het geval is, pas dan de incisiebalk dienovereenkomstig aan. Voor de anterieur-posterieure coördinaten en de oorstangen voor de mediaal-laterale coördinaten, verplaats de naald naar de injectiecoördinaten.

AP minus 1,2 mm, ML minus 1,1 mm ten opzichte van bregma. Dispenseer een kleine hoeveelheid vloeistof uit de injectienaald om een kleine druppel te vormen. Plaats de kleine druppel op de schedel om de locatie te markeren waar het gat geboord zal worden. Trek vervolgens de naald terug en boor een gat in de schedel met behulp van een naald van 25 gauge.

Breng de injectienaald terug naar de injectiecoördinaten en voer de naald vijf millimeter in in dorsoventrale richting. Infuseer vervolgens unilateraal 0,2 µL 6-hydroxydopamine of vehikel in de mediane forebrain bundle met een snelheid van 0,1 µL per minuut. Laat de naald na voltooiing van de toediening van 6-hydroxydopamine of vehikel nog vijf minuten op zijn plaats staan om diffusie vanuit de injectieplaats mogelijk te maken.

Trek vervolgens de naald langzaam terug, sluit de incisie in de hoofdhuid met drie hechtingen en dien daarna één milliliter gelactateerde Ringer-oplossing subcutaan toe. Verwijder tot slot het dier uit het stereotaxische frame en plaats het in de herstelkooi totdat het bewustzijn is teruggekeerd. 15 tot 21 dagen na de chirurgische ingreep voor de six-hydroxydopamine-laesie.

Wanneer de hoeveelheid celdood veroorzaakt door het neurotoxine voltooid is, kunnen spontane rotaties van 360 graden worden gemeten om het succes van de six hydroxy dopamine laesie te beoordelen. Bij deze gedragsbeoordeling vertonen muizen met een door six hydroxy dopamine geïnduceerde dopaminetekort van meer dan 95% significant meer IP-subversieve rotaties dan muizen met een partiële six hydroxy dopamine laesie of sham-geopereerde muizen. Door de SAL-dopamineniveaus te correleren met het percentage spontane IP-subversieve rotaties in elk dier, is vastgesteld dat muizen die 70% of meer IP-subversieve rotaties vertoonden na een six hydroxy dopamine laesie, meer dan 95% Sal-dopamine verloren waren.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u effectief een stereotaxische en perfusiegecontroleerde 6-hydroxydopamine-laesie bij muizen kunt uitvoeren. Dit zal leiden tot een dopamine-depletieniveau van meer dan 95%. Daarnaast zou u moeten begrijpen hoe u de gedragsmatige beoordeling van parkinsonisme bij muizen kunt uitvoeren.