High-throughput versuikering test voor Lignocellulose Materialen
3 juli 2011
Een eenvoudige, snelle methode voor het bepalen van de versuikering potentieel van grote aantallen van plantaardige biomassa monsters is beschreven. De geautomatiseerde platform voor deze analyse heeft betrekking op de voorbereiding van de plantaardige biomassa voor analyse in platen met 96 putjes en de daaropvolgende prestaties van de voorbehandeling, hydrolyse en kwantificering van de vrijgekomen suikers.
Hi, ik ben Kara Ted, ik ben Leo. Ga mij maar. En ik ben Simon McQueen Mason.
De verteerbaarheid van plantaardige biomassa is momenteel een onderwerp van groot belang. Dit komt omdat er veel suikers vastzitten in de polysacchariden van de plantencellen die deze biomassa vormen, en als we die suikers in bruikbare vorm kunnen krijgen, kunnen we ze fermenteren om allerlei producten zoals brandstoffen en chemicaliën te produceren. Helaas zijn deze materialen buitengewoon moeilijk te verteren en is het begrijpen van wat die verteerbaarheid bepaalt een zaak van enige urgentie.
Om plantaardig materiaal te kunnen gebruiken voor de productie van hernieuwbare groepen, moeten we in staat zijn om het ificatiepotentieel in deze planten te meten. Dus hier aan de Universiteit van York screenen we grote populaties van plantaardig materiaal om hun ificatiepotentieel te bepalen. Ficaties is het proces van het breken van complexe koolhydraten in zijn monosaccharidecomponenten om waardevolle chemicaliën te produceren via verschillende industriële processen.
Om het ificatiepotentieel te meten, reproduceren we industriële processen op microschaalniveau, waarbij we biomassa onderwerpen aan een voorbehandeling en enzymhydrolyse om de vrijkomende suikers te bepalen. Dit identificeert interessante variëteiten in genotypen. Het high-throughput systeem werkt in een IG zes-well plate formaat.
Milde omstandigheden van hydrolyse worden gebruikt om subtiele verschillen tussen genotypen bloot te leggen, en het is ook flexibel genoeg om verschillende substraatmaterialen te ondersteunen en om verschillende enzymen te evalueren. De methode die we gebruiken omvat het formatteren van plantaardig materiaal als poeder, dat vervolgens wordt voorbehandeld met een verdunde zuur of alkali bij 90 graden gedurende 20 minuten. Vervolgens wordt een enzymdigestie uitgevoerd met een commercieel cellulasemengsel bij 50 graden gedurende acht uur.
Ten slotte wordt een MBTH-methode gebruikt om de afgifte van reducerende suikers te bepalen. Het plantaardige materiaal wordt geoogst als droge stengels, die worden gesneden als vier millimeter segmenten. Deze worden samen met drie vijf millimeter metalen ballen in twee milliliter vials geplaatst.
De vials worden individueel gelabeld met streepjescodes, die worden gescand om de traceerbaarheid van de monsters te garanderen. De monsters worden in de robots in de robots geladen. De monsters worden automatisch gemalen en gemengd om het uitdelen van de biomassa in een 96-well plate mogelijk te maken.
De vials worden doorboord, waarna de vial opnieuw wordt gepositioneerd in de robotarm zodat deze binnen een trechter zit die trilt om het poeder uit te delen. De trillingen van de trechter worden geregeld door een balans om de doelhoeveelheid biomassa per put te bereiken. De biomassa wordt in 10 kolommen van de platen uitgedeeld, waarbij twee kolommen voor standaarden worden overgelaten.
Door vier herhalingen per monster uit te voeren, laden we 20 monsters per plaat. Het hydrolysaat van deze plaat wordt verdrievoudigd in PCR-platen, wat resulteert in drie optische platen. Op deze manier hebben we drie bepalingen van reducerende suikers per put biomassa.
Eenmaal geformatteerd, worden de platen verzegeld met een siliconenmat om verdamping te voorkomen. Als ze klaar zijn, worden ze naar de robot voor vloeistofbehandeling verplaatst. Bij de vloeistofbehandeling worden robotvoorbehandeling, enzymhydrolyse en bepaling van de vrijkomende suikers automatisch uitgevoerd.
De twee meter tafel heeft containers voor de verschillende benodigde reagentia, evenals opslagruimte voor de plasticwaren. Er zijn incubators voor voorbehandeling en hydrolyse, evenals thermocyclers voor de suikerbepaling. De voorbehandeling wordt uitgevoerd in de deep well plate.
Door verdunde zure of alkalische oplossingen toe te voegen aan het biomassapoeder. De platen worden overgebracht naar de verwarmingsblok en geïncubeerd bij 90 graden gedurende 20 minuten. Wanneer deze incubatie is voltooid, wordt de voorbehandeling verwijderd door vijf keer te spoelen met 500 microliters acetaatbuffer.
Eenmaal de voorbehandeling is gespoeld, wordt een enzymcocktail toegevoegd. Het is een standaardmengsel. Het bevat cellulose, een novozyme 1, 8 8 in een vier-op-een-verhouding als concentratie van zeven FPU per put.
De platen worden gedurende acht uur bij 50 graden geïncubeerd terwijl ze worden geschud. 75 microliters van het resulterende hydrolysaat wordt overgebracht naar een PCR-plaat. In kolom 11 en 12 van de PCR-platen worden de glucosestandaarden toegevoegd.
Vervolgens wordt 25 microliters van een molaar natriumhydroxide toegevoegd aan alle putten. Ten slotte wordt 50 microliters MBTH-reagens in de PCR-plaat gepipetteerd. De deep well plate wordt opgeslagen na de voltooiing van de overdracht van het hydrolysaat naar de derde PCR-plaat.
Terwijl de PCR-platen naar de thermocyclers worden verplaatst voor incubatie bij 60 graden gedurende 15 minuten. De laatste stap van het proces is de overdracht van de reactiemix naar optische platen voor de ontwikkeling van kleur. Na incubatie worden de PCR-platen uit de thermocycler verwijderd.
Honderd microliters oxidatiereagens wordt toegevoegd aan de overgedragen reactiemix. Om kleurontwikkeling te vergemakkelijken, wordt het vloeistofbehandelingsproces vier keer in 24 uur uitgevoerd, waarbij het voorbehandelingsspoelen, het toevoegen van enzym ongeveer twee uur duurt. De enzymhydrolyse duurt acht uur en de suikerbepaling duurt nog eens twee uur.
Terwijl de eerste plaat gedurende acht uur incubeert, begint de volgende plaat met het proces. Met deze toewijzing van robotbronnen wordt een output van 80 monsters per dag bereikt om de hoeveelheid vrijkomende reducerende suikers te bepalen. De optische platen worden beoordeeld op 620 nanometer.
De verkregen resultaten worden geanalyseerd om de vrijkomende suikers te kwantificeren als nanomolen per milligram per uur reactie. Dus bedankt voor het bekijken, en ik hoop dat dit je onderzoek naar biobrandstoffen inspireert.
Overzicht
Dit artikel presenteert een snelle methode voor het beoordelen van het versuikringspotentieel van diverse plantbiomassamonsters met behulp van een geautomatiseerd platform. Het proces omvat voorbehandeling, hydrolyse en kwantificering van de vrijgekomen suikers in een high-throughput formaat.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Plantbiologie
- Biomassaconversie
- Hernieuwbare Energie
Achtergrond
- Plantbiomassa bevat suikers in polysachariden die moeilijk te verteren zijn.
- Inzicht in de verteerbaarheid is cruciaal voor het benutten van plantmateriaal bij de productie van hernieuwbare brandstoffen.
- De studie richt zich op het bepalen van het saccharificatiepotentieel van verschillende plantgenotypes.
- High-throughput screening kan veelbelovende variëteiten voor industriële toepassingen identificeren.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode om het verzacharingspotentieel van plantbiomassa te meten.
- Het faciliteren van de extractie van suikers voor fermentatie tot brandstoffen en chemicaliën.
- Het verbeteren van het begrip van factoren die de verteerbaarheid van biomassa beïnvloeden.
Gebruikte methoden
- Plantenbiomassa wordt voorbehandeld met zure of alkalische oplossingen.
- Enzymatische hydrolyse wordt uitgevoerd met behulp van een commercieel cellulase-mengsel.
- High-throughput screening wordt uitgevoerd in een 96-wells plaatformaat.
- Reducerende suikers worden na hydrolyse gekwantificeerd met behulp van de MBTH-methode.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een snelle beoordeling van het verzacharingspotentieel over meerdere monsters mogelijk.
- Subtiele verschillen in verteerbaarheid tussen genotypen kunnen worden gedetecteerd.
- Het geautomatiseerde proces verhoogt de doorvoer, waardoor de analyse van 80 monsters per dag mogelijk wordt.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is efficiënt voor het screenen van plantbiomassa voor industriële toepassingen.
- Het biedt inzicht in de verteerbaarheid van diverse plantmaterialen.
- Deze benadering kan helpen bij de selectie van plantvariëteiten voor de productie van biobrandstoffen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
High-throughput saccharificatie-assays maken een snelle, kwantitatieve beoordeling van de verteerbaarheid van lignocellulosische biomassa mogelijk, wat een kritiek knelpunt vormt bij de optimalisatie van grondstoffen voor bioraffinage. Dit platform ondersteunt screenings in een vroeg stadium en mechanische risicoreductie door genotype-afhankelijke variabiliteit in suiker-vrijzetting bloot te leggen. De aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen bij de selectie van grondstoffen en procesontwikkeling in industriële biotechnologische pijplijnen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt systematisch onderzoek mogelijk naar factoren van recalcitrantie en verteerbaarheid van de plantencelwand.
- Ondersteunt de identificatie van genetische varianten of kweekvarianten met verbeterde saccharificatieprofielen.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door de impact van de celwandsamenstelling op de suikervrijzetting te kwantificeren.
- Biedt datagestuurde triage voor de verdere ontwikkeling van grondstoffen in portefeuilles voor hernieuwbare chemicaliën en brandstoffen.
Screening en assayontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare saccharificatiemetingen over grote monsterreeksen.
- Automatiseert monsterbereiding, voorbehandeling en enzymatische hydrolyse in een 96-well formaat.
- Genereert kwantitatieve resultaten (reducerende suikers) die geschikt zijn voor vergelijkende analyse en downstream screening.
- Maakt schaalbare evaluatie van enzymformuleringen en substraattypen mogelijk voor procesoptimalisatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt verteerbaarheidsgegevens op laboratoriumschaal uit met industriële procesomstandigheden voor translationele relevantie.
- Ondersteunt de continuïteit van genotypscreening tot preklinische validatie van grondstoffen in de ontwikkeling van bioraffinaderijen.
- Vermindert het risico op procesfalen in een laat stadium door vroeg in de pipeline voorspellende metrics voor verteerbaarheid te bieden.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze high-throughput assay is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking naar ontwikkeling van hernieuwbare grondstoffen, waarbij vroege genotypscreening wordt verbonden met preklinische procesvalidatie.
- Discovery Biology: Kwantificeert het saccharificatiepotentieel om biologische knelpunten bij de afbraak van de celwand te verduidelijken.
- Screening: Biedt reproduceerbare high-throughput assay-resultaten voor de evaluatie van genotypen en enzymen.
- Analytics: Levert data over suikerbezetting in nanomole/mg/uur voor een robuuste statistische vergelijking tussen verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt laboratoriumprofielen van verteerbaarheid met de vereisten van industriële bioraffinaderijen.
- Bedrijfmatige herbruikbaarheid: Vestigt een schaalbaar, geautomatiseerd platform dat aanpasbaar is aan diverse plantensoorten en enzymsystemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van grondstoffen en het procesontwerp.
- Operationele waarde: Standaardiseert workflows, verbetert de reproduceerbaarheid en maakt schaalbaarheid met een hoge doorvoer mogelijk.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go beslissingen voor de verdere ontwikkeling van grondstoffen en enzymoptimalisatie.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering van genotypen en procescondities voor industriële biotechnologische pipelines.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de biologie van plantencelwanden en analytische enzymatische hydrolyse.
- Is afhankelijk van de infrastructuur voor geautomatiseerde vloeistofbehandeling, malen en analytische instrumentatie.
- Vereist strikte standaardisatie tussen teams voor monstervoorbereiding en data-analyse.
- Aanpasbaar aan diverse plantensoorten en enzymmengsels via protocolaanpassingen.
- Doorvoersnelheid en reproduceerbaarheid zijn afhankelijk van de toewijzing van robotische middelen en het onderhoud daarvan.
