Name: Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Leer hoe schuifspanning bacteriële hechting aan endotheelcellen beïnvloedt met behulp van doorstroomkamers en fluorescente microscopie. Deze methode helpt onderzoekers de pathogenese van infecties beter te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Emilie Mairey en Emmanuel Donnadieu bedanken voor de eerste instelling van de procedure.

1. Menselijke gastheer cel en bacteriecultuur <ol><li> Cultuur HUVEC tussen passage 1 en 9 bij 37 ° in een bevochtigde incubator met 5% (v / v) CO 2. Passage van de cellen als ze 80% confluentie aanpak met trypsine / EDTA onderhoud culturen leveren op 75 cm 2 cultuur flessen en experimentele culturen in wegwerp stromingskamers (μ-Slides VI). </li><li> Terug te trekken medium van de kolven te worden gepasseerd, was de cellen met 10 ml PBS, te trekken en te vervangen door 1,5 ml trypsine / EDTA. Laat de cellen in een celkweek incubator los gedurende 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Het verzamelen van de cellen met 10 ml celkweekmedium in een 15 ml collectie buis. Pellet de cellen met een 5 minuten centrifugeren (bij 200 g), bij kamertemperatuur. Hang de cellen in 4 ml van de Endo-SFM aangevuld met 10% (v / v) FBS en ze op een Malassez kamer tellen, volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Introduceer 30 pi van een 1x10 6 HUVEC cellen per ml suspensie in het kanaal (3x10 4 in totaal) en laat de cellen gedurende 3 uur bij 37 ° zich in een vochtige incubator met een atmosfeer van 5% (v / v) CO 2. Voeg een extra volume van 120 ul van de Endo-SFM om de putten te vullen. De cellen moeten vormen een subconfluent monolaag (figuur 2). </li><li> Grow N. meningitidis uiten van GFP (in dit geval stam 8013 tot uitdrukking GFP onder de controle van een IPTG-induceerbare promotor), op GCB agarplaten die Kellogg's supplementen en 5 ug / ml chlooramfenicol bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer met 5% (v / v) CO 2 voor 16 uur. </li></ol> 2. De eerste hechting van individuele bacteriën aan gastheercellen <ol><li> Stel de concentratie van bacteriën gekweekt op GCB agar platen om een ​​OD600 van 0,05 met voorverwarmd Endo-SFM met 10% (v / v) FBS en incubeer gedurende 120 minuten bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer met 5% (v / v) CO 2, onder zacht schudden (130 rpm). Induceren GFP expressie door toevoeging van 1 mM IPTG in het kweekmedium voor de hele incubatietijd. </li><li> Plaats de wegwerp μ-Slide op het podium van een omgekeerde microscoop uitgerust met een verwarmd platform om het monster temperatuur op 37 ° C. </li><li> Giet voorverwarmde Endo-SFM aangevuld met 2% (v / v) FBS in een steriele glazen beker en vul een steriele 50 ml spuit met dit medium. Bevestig de "intrede" slang aan de spuit en vul door de invoering van medium. </li><li> Sluit de "intrede" slang aan op de μ-Slide, met zorg, om te voorkomen dat er lucht in de kamer. Vervolgens brengt de "exit" tube naar de andere kant en zorgvuldig vullen het kanaal met medium tot ongeveer 1 cm afstand van de kamer "exit". </li><li> Meet de bacteriële OD600 en aan te passen aan 0,15 in de Endo-SFM met 2% (v / v) FBS. Om te kijken naar de individuele bacteriën, moet elke aggregaten worden verstoord door krachtige vortexen van de bacteriële monster. </li><li> Plaats 100 pi van Endo-SFM aangevuld met 2% (v / v) FBS medium in het reservoir en voeg 100 ul van de bacteriële oplossing genomen vanaf de top van de gevortexed oplossing om te voorkomen dat sampling de resterende bacteriële aggregaten. </li><li> Voorzichtig introduceren van de 200 ul volume in de μ-Slide door te draaien aan de kraan om de bacteriën te injecteren in de kamer. </li><li> Introduceer Endo-SFM met 2% (v / v) FBS, gehandhaafd op 37 ° C met de verwarmde platform, in de kamer met een injectiespuit pomp met een schuifspanning compatibel is met de hechting van 0.044 dyne / cm 2 gedurende 15 minuten. </li></ol> Zie bijvoorbeeld video 1 of figuur 3. Na deze stap, ofwel te verplaatsen naar secties 3, 4 of 6. 3. Kwantificering van de initiële hechting van individuele bacteriën aan gastheercellen <ol><li> Na de eerste hechting gedurende 15 minuten, willekeurig te verwerven beelden van tien velden, terwijl vloeistof is nog steeds in omloop. </li><li> Analyseren van de verkregen beelden met behulp van de software ImageJ 8, om het gemiddelde aantal adherant bacteriën per veld te gaan. Dit gebeurt als volgt: in de eerste plaats, elk beeld is thresholded met de "Threshold" venster te vinden in de "Image" menu aan de individuele naleven fluorescerende bacteriën te markeren, terwijl het minimaliseren van de achtergrond van de cellen. Vervolgens wordt elke bacterie geteld, met behulp van de Plug-In "Cell Counter" ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> ). De gegevens voor elk beeld worden gerapporteerd in een Excel-spreadsheet en zijn gemiddeld bij het gemiddelde aantal van het aanklevende bacteriën per veld te kwantificeren. </li></ol> 4. Het meten van de weerstand tegen stroom van individuele bacteriën aanhanger van gastheercellen <ol><li> Programmeer de injectiepomp set-up op shear stress, variërend 3-100 dynes / cm 2 gedurende 5 minuten te genereren. </li><li> Aan het eind van de 5 minuten, te verwerven tien velden willekeurig gekozen zoals beschreven in stap 3.1, maar met de stroom mee gestopt prIOR aan de overname. </li><li> Analyseren van de verkregen beelden zoals beschreven in stap 3.2 en kwantificeren van het gemiddelde aantal van de resterende bacteriën per veld. </li></ol> 5. Het meten van de groei van een geïsoleerde bacterie aanhanger naar een microcolony <ol><li> Introduceer Endo-SFM met 10% (v / v) FBS, gehandhaafd op 37 ° C met de verwarmde platform, in de kamer met behulp van een spuitpomp met de gekozen schuifspanning voor meerdere uren. Beelden opnemen voor real-time video microscopie op een frame om de 5 minuten. </li><li> Volgende video microscopie, de shear stress te stoppen door het uitschakelen van de injectiepomp, verwerven max. 2-3 beelden en stop vervolgens de afbeelding overname volgorde op de software. Een voorbeeld van bacteriële proliferatie is te zien op video 2. </li></ol> 6. Het meten van de weerstand tegen doorstroming van het aanklevende bacteriële microkolonies <ol><li> Na de vorming van grote microkolonies op het celoppervlak (step5.2) te verwerven 2-3 beelden van beide cellen (door de fase-contrast) en bacteriën (door GFP-fluorescentie) voordat stroom applicatie. Voor de rest van het experiment, zal de overname protocol te controleren alleen de fluorescentie. </li><li> Het toepassen van een hoge schuifspanning gedurende 5 minuten (300-100 dynes / cm 2) en de opnamen op een frame om de 5 seconden. </li><li> Stop de schuifspanning door het uitschakelen van de injectiepomp, verwerven max. 2-3 beelden en stop vervolgens de afbeelding overname volgorde op de software. </li><li> Vervolgens verwijdert u eerst de "exit" slangen en zorgvuldig om te voorkomen dat het legen van het kanaal en voeg vervolgens voorverwarmde vers medium om de putten te vullen voordat u de "entry" slang. </li><li> Kwantitatief te bepalen van het effect van shear stress op de bacteriële resistentie, kan een plating test worden uitgevoerd als volgt: het verzamelen van de resterende medium en twee keer was de μ-Slide met 120 pi PBS, die de resterende medium verwijderd is van het kanaal (beide wast zijn ook verzameld). </li><li> Maak de geïnfecteerde cellen met de toevoeging van 50 ul van trypsine / EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° en meng deze vrijstaande monster met de ophanging verzameld in de vorige stap. </li><li> Voer seriële verdunningen in PBS en de plaat een 10 ul fractie op GCB agar platen, in drievoud, in om het aantal kolonievormende eenheden (CFU) vast te stellen op de volgende dag, na incubatie van de platen bij 37 ° C in een incubator met 5% (v / v) CO 2. </li></ol> Video's 3 en 4 vergelijken met de wild-type stam met de pilV mutant. 7. Bacteriële onthechting van microkolonies <ol><li> Cellen infecteren in de stroom kamer door het herhalen van de stappen 2,1 tot 2,8 en laat de infectie door te gaan gedurende 30 minuten. </li><li> Verwijder de niet-gebonden bacteriën door toenemende stroom tot 10 dynes / cm 2 gedurende een periode van 2 minuten en laat infectie te blijven voor 2u. </li><li> Verminder stroom naar 0,15 dynes / cm 2. </li><li> Elk uur, verzamelen een druppel medium coming out van de flow kamer. </li><li> Voer seriële verdunningen van de monsters en de plaat ze op GCB agar platen. </li><li> Bepaal het aantal kolonievormende eenheden (CFU) op de volgende dag, na incubatie van de platen bij 37 ° C in een incubator met 5% (v / v) CO 2. </li></ol> 8. Representatieve resultaten <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1: Verschillende stappen van een cellulaire monolaag die kan worden waargenomen en gemeten in de aanwezigheid van stroming in de procedure. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2: endotheelcellen monolayer in de stroom kamer aan het begin van een experiment (afwezigheid van shear stress). Ongeveer 50 endotheelcellen zijn georganiseerd in een sub-samenvloeiend monolaag. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3: Grafische weergave van de initiële hechting van bacteriën op het celoppervlak. De waarden voor drie velden zijn aangeduid om een idee van het veld-to-veld variatie die wordt verwacht (0044 dynes / cm 2) te geven. Video 1. Visualisatie van de initiële hechting van bacteriën op de cellulaire monolaag als een functie van de tijd (0044 dynes / cm 2). GFP expressie bacteriën zijn in de richting van het stromende medium. De film wordt versneld 60-voudig, de werkelijke duur van de video is 10 minuten. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">Klik hier om de video te bekijken.</a> Video 2. Na de initiële hechting bacteriën mochten prolifereren op het celoppervlak voor een periode van 7 uur (versnelde 1000-voudig). <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">Klik hier om de video te bekijken.</a> Video 3. Na proliferatie op het celoppervlak van de monteural weerstand van microkolonies werd getest door het verhogen van de shear stress niveau om 10 dynes / cm 2 gedurende 5 minuten, maar wild-type microkolonies zijn resistent versneld 60-voudig. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">Klik hier om de video te bekijken.</a> Video 4. Microkolonies gevormd door de pilV mutant worden verstoord door flow te verhogen (10 dynes / cm 2). Deze mutant niet aanzet tot de verbouwing van het plasmamembraan onder microkolonies en is dus meer zeer gevoelig voor hogere shear stress (video is 60-voudig versnelde) 5. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">Klik hier om de video te bekijken.</a>

<ol><li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+Principles+of+Vascular+Beds%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Design Principles of Vascular Beds.</a> Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).</li>
<li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16, 31-42 (2009).</li>
<li>Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+cells+sedimenting+on+a+solid+surface+in+a+laminar+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow.</a> Biophys J. 61, 204-215 (1992).</li>
<li>Mikaty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).</li>
<li>Chamot-Rooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modification+of+pili+upon+cell+contact+triggers+N.+meningitidis+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination.</a> Science. 331, 778-782 (2011).</li>
<li>Soyer, M., Dumínil, G. Bacterial adhesion under shear stress. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSoyer%2C+M+%22Neisseria+meningitidis%3A+Methods+and+Protocols+%28Methods+in+Molecular+Biology%29%22">Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)</a>. Christodoulides, M. , Humana Press Inc. New York. (2011).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li>
<li>Tchesnokova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-enhanced+binding+of+intestinal+colonization+factor+antigen+I+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).</li>
<li>Konto-Ghiorghi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+pilus+in+adherence+to+epithelial+cells+and+biofilm+formation+in+Streptococcus+agalactiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae.</a> PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Het belang van shear stress en in het algemeen van de mechanische aspecten in de biologie wordt steeds meer onderkend. Bijvoorbeeld de zeer aangepast klevende eigenschappen van de selectine familie van eiwitten in het proces van lymfocyten hechting en rollen op de vaatwand is erkend door de invoering van shear stress in het proces. De hierboven beschreven procedure werd toegepast om de Gram-negatieve bacteriën Neisseria meningitidis, maar moet ook gelden voor een breed scala van ziekteverwekkers. Het belang van shear stress werd ook aangetoond voor andere ziekteverwekkers en andere infectie sites. Bacteriële hechting geconditioneerd door shear stress is beschreven door de studie van de FimH adhesine gevonden op uropathogene Escherichia coli (UPEC) 9. Net als bij selectines, de interactie tussen FimH en zijn gastheercel receptor bleek te worden versterkt door shear-geïnduceerde mechanische krachten 9 en de CFAE adhesine van enterotoxigene E.coli werd ook gemeld om de hechting te bemiddelen darmepitheelcellen via een afschuif-afhankelijke mechanisme 10. We gemeld, met behulp van de laminaire flow kamer assay protocol beschreven in dit hoofdstuk dat Streptococcus agalactiae pili essentieel waren voor de naleving van deze ziekteverwekker aan epitheliale cellen onder stromingscondities 11. Dergelijke studies bevestigen dat onze stroom kamer assay is een nuttig instrument voor het onderzoeken van de gastheercel-pathogeen interacties onder omstandigheden van shear stress.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> μ-Slide VI 0.4 stroom-kit </td><td> IBIDI </td><td> 80606 </td></tr><tr><td> Spuit Plastipak 50 ml Luer-Lock </td><td> Becton Dickinson </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Tygon slang R3603 3,2 x 4,8 mm </td><td> Fisher Scientific- </td><td> R3603 </td></tr><tr><td> 3-weg kraan, twee vrouwelijke luer tot mannelijke luer </td><td> Bio-Rad </td><td> 7328103 </td></tr><tr><td> Injectiepomp </td><td> Harvard Apparatuur </td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td> Omgekeerde microscoop, Nikon </td><td> Nikon </td><td> Eclipse T i </td></tr><tr><td> CCD-camera </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA 285 CCD of ORCA 3-CCD </td></tr><tr><td> ImageJ software </td><td> NIH </td><td> Freeware ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) </td></tr></tbody></table>

introductie van shear stress in de studie van bacteriële hechting

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Tijdens bacteriële infecties een reeks van interacties optreden tussen de ziekteverwekker en zijn gastheer. Bacteriële hechting aan de gastheercel oppervlak is vaak de eerste stap en het bepalen van de pathogenese. Hoewel experimenteel hechting wordt meestal bestudeerd in statische omstandigheden hechting vindt eigenlijk plaats in aanwezigheid van de stromende vloeistof. Eerste ontmoetingen tussen bacteriën en hun gastheer vaak voorkomen bij het mucosale niveau, mond, longen, darmen, ogen, enz. waar slijm stroomt langs het oppervlak van epitheelcellen. Later in infectie, ziekteverwekkers zo nu en dan toegang tot de bloedcirculatie waardoor levensbedreigende ziekten zoals bloedvergiftiging, sepsis en meningitis. Een kenmerkende eigenschap van deze infecties is het vermogen van deze pathogenen met endotheliale cellen interageren in aanwezigheid van circulerende bloed. De aanwezigheid van stromende vloeistof, slijm of bloed bijvoorbeeld, bepaalt hechting want het genereert een mechanische kracht op de ziekteverwekker. Te bepalen wat de werking van een stromende vloeistof meestal verwijst naar het begrip van shear stress, dat is de tangentiële kracht die wordt uitgeoefend per oppervlakte-eenheid door een vloeistof in beweging de buurt van een stilstaande muur, uitgedrukt in dynes / cm 2. Intensiteiten van shear stress verschillen sterk naar gelang de verschillende schepen type, de grootte, orgel, locatie etc. (0-100 dynes / cm 2). Circulatie in de haarvaten kunnen bereiken zeer lage shear stress waarden en zelfs tijdelijk te stoppen gedurende periodes variërend van enkele seconden tot enkele minuten een. Aan de andere kant van het spectrum schuifspanning in arteriolen kan oplopen tot 100 dynes / cm 2 2. De impact van shear stress op verschillende biologische processen is duidelijk aangetoond, zoals bijvoorbeeld tijdens de interactie van leukocyten met het endotheel 3. Om rekening te houden met deze mechanische parameter in het proces van bacteriële hechting hebben we geprofiteerd van een experimentele procedure gebaseerd op het gebruik van een wegwerp stroom kamer 4. Gastheer cellen worden gekweekt in de stroming kamer en fluorescerende bacteriën worden geïntroduceerd in de stroming gecontroleerd door een injectiepomp. We in eerste instantie ons onderzoek gericht op de bacteriële pathogenen Neisseria meningitidis, een Gram-negatieve bacterie die verantwoordelijk is voor bloedvergiftiging en hersenvliesontsteking. De procedure die hier beschreven liet ons toe om de impact van de shear stress studie over het vermogen van de bacteriën om: zich te houden aan cellen 1, te prolifereren op het celoppervlak 5 en los naar nieuwe locaties 6 (figuur 1) te koloniseren. Aanvullende technische informatie is te vinden in referentie 7. Schuifspanning waarden hier gepresenteerde werden gekozen op basis van onze eerdere ervaringen 1 en de waarden gevonden in de literatuur te vertegenwoordigen. Het protocol moet worden toegepast op een breed scala van ziekteverwekkers met specifieke aanpassingen afhankelijk van de doelstellingen van de studie.

Tijdens het infectieproces, een belangrijke stap is de hechting van pathogenen met gastheercellen. In de meeste gevallen deze hechting stap gebeurt in de aanwezigheid van mechanische spanning opgewekt door stromende vloeistof. Beschrijven we een techniek die schuifspanning introduceert als een belangrijke parameter in de studie van bacteriële hechting.

Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

Tijdens bacteriële infecties vindt er een reeks interacties plaats tussen het pathogeen en de gastheer. Bacteriële adhesie aan het oppervlak van de gastheercel is vaak de ...

Deze video demonstreert een procedure voor het bestuderen van de effecten van schuifspanning op bacteriële adhesie. Tijdens een ernstige infectie met een bacteriële pathogeen zoals Neisseria meningitidis bereikt de pathogeen de bloedbaan; daar hecht deze zich aan gastheercellen en koloniseert deze, terwijl er sprake is van mechanische stress door de bloedstroom. Na proliferatie maken sommige bacteriën zich los en koloniseren ze nieuwe plaatsen, waardoor de cyclus opnieuw begint. Om factoren te bestuderen die de bacteriële adhesie aan gastheercellen beïnvloeden, worden endotheelcellen in wegwerpbroomkamers geplaatst en gekweekt om de cellen confluentie te laten bereiken.Fluorescerende bacteriën worden toegevoegd en de schuifspanning wordt experimenteel gecontroleerd. Met behulp van een spuitpompsysteem worden de adhesie van de bacteriën aan de gastheercellen en de proliferatie microscopisch gevolgd. De resulterende video's worden geanalyseerd om het effect van schuifspanning op het proces van endotheelkolonisatie te bepalen.Deze procedure kan zeer nuttig zijn voor het bestuderen van de pathogenese van meningitis, maar kan ook worden toegepast op andere bacteriën die tijdens het pathogenese-proces worden blootgesteld aan schuifspanning. Deze techniek kan enigszins lastig zijn om uit te voeren, met name wat betreft het voorkomen van luchtbellen in het systeem, wat problematisch kan zijn. Daarom zal de procedure vandaag worden gedemonstreerd door Mega, een PhD-student die in mijn laboratorium werkt.De experimenten die in deze video worden beschreven, zijn uitgevoerd met cellen die zijn gekweekt in een IDI micro slide six 0.4, bestaande uit een steriele wegwerpplastic slide met zes kanalen van 17 millimeter lang, 3,8 millimeter breed en 0,4 millimeter diep. Elk kanaal heeft twee toegangspoorten met luer-adapters, één aan elk uiteinde, om uve-cellen te introduceren; pipetteer 30 µL van een cellesuspensie van 1×10⁶ in elk van de kanalen op de slide. Laat de cellen drie uur hechten bij 37 °C in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2.Voeg na de incubatie nog eens 120 microliter endo SFM toe. Om de putjes te vullen, moeten de cellen na ongeveer 20 uur een subconfluente monolaag vormen. Strijk in de tussentijd GFP-expresserende Neisseria meningitidis uit op APLs; deze bacterie is een menselijke pathogeen.Daarom moet elke manipulatie van dit micro-organisme worden uitgevoerd in een laboratoriumfaciliteit met veiligheidsniveau 2 door getraind personeel dat een jas en handschoenen draagt; vaccinatie van het personeel tegen de gebruikte serogroep wordt aanbevolen. Hier is stam 8 0 1 3. De expressie van GFP wordt gereguleerd door een IPDG-induceerbare promotor uitstrijk.Kweek de bacteriën op GC BPLs met Kellogg-supplementen en 5 µg/mL chloramphenicol in een incubator op 37 °C met 5% CO2 gedurende 16 uur. Zodra de zoogdiercelculturen zijn gevestigd, worden de bacteriën toegevoegd aan de gastcellen in het kanaal. Ter voorbereiding op de flow-assay worden de bacteriën met een inoculatielus uit de Petrischaal verzameld en overgebracht naar een conisch buisje van 50 mL met voorverwarmd, gesupplementeerd endotheelcelmedium.Medium Endo SFM. Stel de optische dichtheid in op een OD 600 van 0,05 door het monster te verdunnen in hetzelfde medium tot een eindvolume van vijf milliliter. Om GFP-expressie te induceren, voegt u IPTG toe tot een eindconcentratie van één millimolair en incubeert u de cultuur gedurende 120 minuten.In een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 met zacht schudden. Plaats de microscoopglaasplaat met eerder voorbereide gekweekte endotheelcellen op de tafel van een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een verwarmd platform om de temperatuur van het monster op 37 °C te houden. Giet voorverwarmd endo SFM aangevuld met 2% FBS in een steriele glazen beker en vul de spuit van 50 ml door aan de zuiger te trekken.De toevoerslang is verbonden met een driewegkraan. Bevestig vervolgens de toevoerslang aan de spuit en druk de zuiger in om de slang met medium te vullen. Verbind vervolgens voorzichtig het andere uiteinde van de toevoerslang met de micro-slide met behulp van de meegeleverde right-angle connectoren.Voorkom dat er lucht in de kamer terechtkomt. Plaats de spuit op de pomp en plaats vervolgens een afgeknipt spuitje van één milliliter in de beschikbare opening van de stopkraan als reservoir. Bevestig daarna de uitlaatbuis aan het andere uiteinde van het kanaal en vul het kanaal voorzichtig met medium door op de zuiger van de spuit te drukken tot een afstand van ongeveer één centimeter van de uitlaat van de kamer.Meet de bacteriële OD 600 en stel deze in op 0,15 in endo SFM met 2% FBS; vortex het monster vervolgens krachtig om bacteriële aggregaten te verbreken. Breng daarna met een wegwerpplastic Pasteurpipet 100 µL endos fm, aangevuld met 2% FBS-medium, over naar het reservoir. Aspireer vervolgens 100 µL van de bacteriële oplossing van de bovenkant van de gevortexte oplossing en voeg dit toe aan het reservoir.Draai de stopkraan voorzichtig en injecteer de bacteriën in de kamer van het micro-objectglas om de adhesie te laten plaatsvinden bij een gecontroleerd niveau van schuifspanning. Voeg endo SFM met 2%FBS toe aan de kamer met behulp van de spuitpomp met een snelheid van 3,5 milliliters per uur gedurende 15 minuten. Deze video is 60 keer versneld.De werkelijke duur is 10 minuten. Na deze stap kunnen de adhesie en detachement van bacteriën aan gastheercellen onder verschillende condities worden beoordeeld, zoals beschreven wordt in de volgende secties van de video. Om de initiële adhesie van individuele bacteriën aan gastheercellen te kwantificeren, start u met het maken van beelden na 15 minuten stroming terwijl de vloeistof nog circuleert; maak beelden van 10 willekeurige velden om het gemiddelde aantal adherente bacteriën per gefotografeerd veld te bepalen.Begin met het openen van de ImageJ-software en open de afbeelding die geanalyseerd moet worden. Klik vervolgens op het afbeeldingmenu en selecteer 'Adjust brightness contrast'.Optimaliseer de visualisatie van individuele hechtende fluorescerende bacteriën ten opzichte van de achtergrond door de intensiteitsniveaus aan te passen met de cursor. Open vervolgens in de plugin het menu 'analyze cell counter'. Open de tool 'cell counter', initialiseer het beeld, kies het objecttype en klik op elke individuele bacterie.Het totaal aantal bacteriën verschijnt in het venster. Exporteer tot slot de gegevens van elke afbeelding naar Excel en bereken het gemiddelde om het gemiddelde aantal adherente bacteriën per veld te kwantificeren, om zo de resistentie van individuele adherente bacteriën tegen de stroom te meten. Na het initiële stroomprogramma van 15 minuten is de spuitpompopstelling ingesteld om een schuifspanning te genereren variërend van 3 tot 100 dynes per vierkante centimeter gedurende vijf minuten.Stop na vijf minuten de stroming en neem, zoals voorheen, 10 willekeurige velden op en analyseer deze om het gemiddelde aantal resterende bacteriën per veld te bepalen. Pas na de eerste 15 minuten stroming de spuitpomp aan naar de geselecteerde schuifspanning. Laat dit gedurende enkele uren doorstromen, waarbij elke vijf minuten één frame wordt vastgelegd.Idealiter kunnen meerdere posities worden gevolgd als de microscoop is uitgerust met een gemotoriseerd XY-platform. Stop na de videomicroscopie de schuifspanning door de spuitenpomp uit te schakelen. Neem onmiddellijk twee tot drie extra beelden op en stop vervolgens de beeldacquisitiereeks in de software.Een voorbeeld van bacteriële proliferatie is hier te zien. Gebruik ten slotte, om de beelden te analyseren, het menu 'image adjust threshold' van ImageJ om de beelden om te zetten naar binair. Selecteer vervolgens in het analysemenu onder 'set measurement' de oppervlaktemeting.Gebruik vervolgens de tool 'analyze particle' om de grootte van de koloniën automatisch te bepalen. Na vijf tot zeven uur vormen zich grote microkoloniën op het celoppervlak, ongeacht of er op dat moment een stroming wordt gehandhaafd. Om de resistentie van microkoloniën tegen stroming te meten, worden eerst twee tot drie beelden van zowel de cellen via fasecontrast als van de bacteriën via GFP-fluorescentie opgenomen.Pas gedurende vijf minuten een hoge schuifspanning toe en neem fluorescentiebeelden op met een frequentie van één frame per vijf seconden. Stop de schuifspanning door de spuitpomp uit te schakelen. Leg nog twee tot drie aanvullende beelden vast en stop vervolgens de acquisitiesequentie in de software om het medium te verzamelen voor een plating-assay.Verwijder eerst de uitgangsslang, waarbij u er zorg voor draagt dat het kanaal niet leegloopt. Voeg voorverwarmd vers medium toe om de putjes te vullen. Verwijder vervolgens de ingangsslang, verzamel het resterende medium met een micropipet en breng dit over naar een microcentrifugebuis. Om eventueel resterend medium uit het kanaal te verwijderen, spoelt u de microdia twee keer door 120 µL PBS aan het kanaal toe te voegen.Kantel de slide twee keer en verwijder het medium. Voeg om de geïnfecteerde cellen te verzamelen 50 µL tripsin-EDTA toe aan de micro slide en incubeer dit vijf minuten bij 37 °C om ze los te maken van het kanaal; meng dit losgekoppelde monster vervolgens met de suspensie die in de vorige stap is verzameld. Voer na seriële verdunning in PBS een uitplating uit van fracties van 10 µL op GCB-agarplaten en incubeer deze in drievoud bij 37 °C en 5% CO2 gedurende de nacht.Bepaal de volgende dag het aantal colony forming units om de bacteriële loskoppeling van microkolonies te beoordelen. Infecteer de cellen in de flowkamer zoals voorheen bij een lage stroomsnelheid van 3,5 milliliters per uur; verwijder na 30 minuten de niet-gebonden bacteriën door de stroomsnelheid gedurende twee minuten te verhogen naar vijf milliliters per minuut, en keer daarna terug naar de lage stroomsnelheid van 3,5 milliliters per uur om de infectie gedurende twee uur te laten voortduren. Verzamel vervolgens gedurende vier uur elk uur een druppel medium dat uit de flowkamer komt in een microcentrifugebuis.Zodra alle monsters zijn verzameld, wordt het aantal colony forming units bepaald zoals voorheen. Dit is een grafische weergave van de initiële adhesie van bacteriën op het cellulaire oppervlak. Elke lijn in de grafiek vertegenwoordigt het cumulatieve aantal gebonden bacteriën in een bepaald veld als functie van de tijd.Waarden voor drie velden zijn aangegeven om een beeld te geven van de variatie tussen velden die wordt verwacht na proliferatie op het celluuroppervlak. De mechanische resistentie van microkolonies werd getest door het niveau van de schuifspanning te verhogen naar 10 dines per vierkante centimeter; terwijl wild-type microkolonies resistent zijn, worden microkolonies gevormd door de pill v mutant verstoord door de toename van de stroom. Deze mutant slaagt er niet in om de remodellering van het plasmamembraan onder microkolonies te induceren en is daardoor gevoeliger voor een toename van de schuifspanning na de ontwikkeling.Deze techniek maakte de weg vrij voor andere onderzoekers in het veld van infectieziekten om de impact van schuifspanning op de interactie van diverse pathogenen met verschillende celtypen te onderzoeken. Houd er rekening mee dat het werken met humane pathogenen uiterst gevaarlijk kan zijn; daarom moeten er bij het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals maatregelen voor bioveiligheidsniveau twee of drie.

introducing-shear-stress-in-the-study-of-bacterial-adhesion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Ditkowski, B., et al. An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the method of using a parallel-plate flow chamber to perfuse fluorescently labeled bacteria over vascular graft tissues, enabling controlled analysis of bacterial adhesion and early pathogenesis under shear flow conditions.

In Vitro Parallel-Plate Flow Model to Study Bacterial Adhesion on a Tissue Biopsy

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Om de interactie van bacteriën met de bloedvaten onder afschuifspanning te bestuderen, worden een stromingskamer en een in vivo mesenteriale intravitale microscopiemodel beschreven die het mogelijk maken om de bacteriële en gastheerfactoren die bijdragen aan vasculaire adhesie te ontleden.

In vitro en in vivo model voor Bacteriële hechting aan de vaatwand Onder Flow omstandigheden te bestuderen

Bacterieel hechting aan gasthercelten is een sleutelstap tijdens gastheerkolonisatie en infectie. Dit protocol beschrijft de generatie van polymeer-gekoppelde recombinante adhesines als biomimetische materialen die analyse van de bijdrage van individuele adhesines aan deze processen mogelijk maken, onafhankelijk van andere bacteriële factoren.

Biomimetische materialen Bacteria-gastheer interacties karakteriseren

Deze stroom adhesietest een eenvoudige, high impact model van T-cel-epitheliale cel interacties. Een spuitpomp gebruikt om afschuifspanning te genereren en confocale microscopie neemt beelden voor kwantificering. Het doel van deze studies is om effectief te kwantificeren T-cel adhesie met behulp van stroom omstandigheden.

Assay van Adhesie Under Shear Stress voor de Studie van T-lymfocyten-Adhesie Molecule Interacties

Celoppervlak verklevingen staan ​​centraal in mechanotransductie, omdat ze mechanische spanning verzenden en inleiding van de signaalwegen die betrokken zijn in het weefsel homeostase en ontwikkeling. Hier presenteren we een protocol voor het ontleden van de biochemische routes die worden geactiveerd in reactie op de spanning, onder toepassing van ligand beklede magnetische microkralen en krachtuitoefening adhesie receptoren.

Het analyseren van de celoppervlakadhesie remodeling in reactie op mechanische spanning met behulp van Magnetic Beads

We hebben een multi goed formaat polyacrylamide gebaseerde assay voor het effect van extracellulaire matrix stijfheid op bacteriële infectie van Adherente cellen indringende ontwikkeld. Deze test is compatibel met stroom cytometry immunokleuring en tractie kracht microscopie, waardoor voor kwantitatieve metingen van de biomechanische interacties tussen cellen, hun extracellulaire matrix en pathogene bacteriën.

Een multi goed formaat Polyacrylamide gebaseerde Assay voor het bestuderen van het Effect van extracellulaire Matrix stijfheid op de bacteriële infectie van Adherente cellen

Hier beschrijven we het gebruik van een hogere gegevensdoorvoer microfluidic bioreactor in combinatie met een fluorescente microscoop voor de analyse van shear stress effecten op Pseudomonas aeruginosa biofilms uiting van groen fluorescent eiwitten, met inbegrip van instrument instellen, de bepaling van biofilm dekking, groei en morfologische eigenschappen.

Cel analyse van Shear Stress voortleven Pseudomonas aeruginosa met behulp van een geautomatiseerde hoger-Throughput Microfluidic systeem

Deze methode is nuttig voor het kwantificeren van de vroege dynamiek van cellulaire adhesie en het verspreiden van verankerings afhankelijke cellen op het fibronectin. Bovendien kan deze test worden gebruikt om de effecten van veranderde redox homeostase op celspreiding en/of celadhesie-gerelateerde intracellulaire signalering trajecten te onderzoeken.

Onderzoek van de dynamiek van cellulaire hechting en verspreiding van epitheliale cellen op fibronectine tijdens oxidatieve stress

Dit protocol presenteert de experimentele procedures om de adhesievoetafdruktest uit te voeren om de adhesiegebeurtenissen tijdens snelle celrollende adhesie in beeld te brengen.

Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest

Leer hoe schuifspanning bacteriële hechting aan endotheelcellen beïnvloedt met behulp van doorstroomkamers en fluorescente microscopie. Deze methode helpt onderzoekers de pathogenese van infecties beter te begrijpen.

Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

Meer video's verkennen