Name: In vivo Dual ondergrond Bioluminescent Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Leer een methode voor dubbele bioluminescentiebeeldvorming in vivo om tumorgroei en metastase bij borstkanker te volgen. Deze techniek maakt longitudinale monitoring van genregulatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

WPS is mede ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (CA129359), de Susan G. Komen voor de Cure Foundation (BCTR0706967), het Ministerie van Defensie (BC084561), en de Seidman Cancer Center, terwijl MKW werd ondersteund door een beurs van de American Cancer Society (PF-09-120-01). Extra ondersteuning voor dit werk werd aangeleverd door het Case Center for Imaging Research, de zaak Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703), en de Cystic Fibrosis Centrum (P30 DK027651).

1. Stabiele expressie van CMV-Driven Renilla Luciferase <ol><li> Transfectie en selectie van een stabiele klonale populatie is de voorkeur voor expressie van deze Renilla luciferase reporter. Deze benadering levert een meer consistente en uniforme Renilla luciferase expressie na de latere invoering van additionele secundaire reporter constructen (bijvoorbeeld vuurvlieg luciferase of fluorescerende eiwitten). </li><li> Transfecteren kwaadaardige cellen plaats met de expressievector codeert Renilla luciferase, zoals pcDNA3.1-Hygro of een ander plasmide een selecteerbare marker. </li><li> Na transfectie, plaatst de transfectanten onder een geoptimaliseerde antibioticumconcentratie enkele dagen te weken isolatie van afzonderlijke kolonies, die vervolgens afzonderlijk geïsoleerd en overgeënt vergemakkelijken. </li><li> Selecteer ≥ 10 individuele Renilla luciferase-expressie kolonies zover van Renilla expressie controleren. </li><li kolonies die hoge hoeveelheden renilla luciferase wordt vervolgens onderworpen aan functionele analyse dat de>(i) pathofysiologische eigenschappen van de ouderlijke tegenpartijen blijven, en (ii) Renilla expressiewaarden niet afwijken of veranderen. Deze stappen zijn absoluut noodzakelijk om te voorkomen dat het isoleren en het bestuderen van klonale varianten / devianten, en voor een goede integratie van de Renilla constructie te valideren in het genoom. </li><li> Zodra een stabiele transfectant is geïsoleerd en gecontroleerd kan men verwijderen selectieve druk en worden verzekerd dat de expressie van Renilla luciferase constant blijft gedurende langere tijdsperioden zowel in vitro als in vivo. </li></ol> 2. Expression-, selectie-, en functionele controle van induceerbare promoter-Driven Firefly Luciferase <ol><li> Subkloon de promoter van belang in een pGL4-luciferase reporter plasmide een selecteerbare merker (bijvoorbeeld puromycin) die verschilt van die van het selecteren op stabiele expressie Renilla (bijv. hygromycine). </li><li> Transfecteren kwaadaardige cellen in stap I en vervolgens selecteren voor een stabiele polyklonale populatie van vuurvlieg luciferase tot expressie brengende cellen. Omdat de locatie waar een rapport gen integreert in het genoom kan uitlokken foutieve effecten op de expressie en regulatie, is het sterk aan te raden om te kiezen voor polyklonale populaties van vuurvlieg luciferase-expressie brengen, in tegenstelling tot klonale populaties om dat (i) reportergen meningsuiting veel nauwkeuriger dat van het endogene gen in oudercellen en (ii) integratie effecten op genexpressie worden gemiddeld en verminderd in de heterogene celpopulatie. </li><li> Kwaadaardige cellen ontwikkeld om stabiel tot expressie zowel Renilla en vuurvlieg luciferasen worden gezamenlijk aangeduid als dual bioluminescent reporter cellen, of DBR cellen. </li><li> Het gebruik van traditionele &lt;em&gt; in vitro cel-gebaseerde assays luciferase reportergen te controleren of het DBR cellen vuurvlieg luciferase expressie reguleren, positief of negatief, op een wijze overeenstemmend met die waargenomen in ouderlijke cellen tijdelijk getransfecteerd met deze vectoren. Ook controleert u of CMV-driven uitdrukking van Renilla niet wordt geregeld door verschillende cel stimulaties of behandeling. </li><li> Hiervoor cultuur DBR en ouderlijke cellen in 24-well platen en vervolgens tijdelijk co-transfecteren parentale cellen met de originele CMV-promoter en Renilla-firefly constructen gebruikt voor DBR cellen te genereren. </li><li> Daarna behandelen DBR en getransfecteerde cellen met ouderlijke factoren of farmacologische middelen waarover de promoter van belang te reguleren en vervolgens kwantificeren vuurvlieg en Renilla luminescentie met de Promega Dual Luciferase Assay Kit. </li></ol> 3. Tot oprichting van 4T1 Primaire mammatumoren <ol><li> Gemetastaseerd mammacarcinoom 4T1 cellen die weopnieuw blijkt gebrek adventitia knaagdier pathogenen werden om een ​​stabiel tot expressie CMV aangedreven Renilla luciferase (pcDNA3.1-CMV-Renilla luciferase-hygro) en SBE-driven firefly luciferase (pGL4.2-SBE-firefly luciferase-puro) als hierboven beschreven. Orthotopische implantatie van deze borstkankercellen resulteert in de vorming van spontane metastasen hoofdzakelijk in de longen. </li><li> 4T1 cellen mag niet tot confluentie bereiken tijdens hun voortplanting in de traditionele 2-dimensionale weefselkweek systemen, en ze moeten worden gepasseerd op de dag voor hun in vivo inenting. </li><li> 4T1 cellen moeten worden losgemaakt door trypsinisatie, grondig gewassen in groeimedia, en verdund in PBS tot een concentratie van 2x10 5 cellen / ml en direct op ijs bewaard. </li><li> Vrouwelijke Balb / C muizen (4-6 weken oud) moet verdoofd met een inductie dosis van 3% isofluraan en gehandhaafd onder anesthesie met een dosis van 1% isofluraan. Bereid de injectieplaats door zwabberen met70% isopropylalcohol. Met behulp van een tang voorzichtig grijpen en tillen de 4e lies borst pad. Voorzichtig, plaats een 27,5 gauge naald schuine kant naar boven en injecteer in het uiervet pad direct onder de tepel, waarbij speciale zorg niet duw de naald in de buikholte. Laat de klier en langzaam 50 pi van de celsuspensie (1x10 4 cellen) te injecteren in de uiervet pad. </li></ol> 4. De eerste Dual Luminescent Imaging <ol><li> Onmiddellijk na enting 4T1 cellen op de uiervet pad en terwijl de muizen nog verdoofd, 100 ul RediJect Coelenterazine injecteren in de laterale staartader. Dit is de optimale substraatconcentratie aanbevolen door de fabrikant en de beste verdragen door het dier. </li><li> Onmiddellijk Plaats de muis in de isofluraan neuskegel binnen de IVIS-200 imaging systeem en het verwerven van een 0,5-1 minuten luminescent beeld. Efficiency tussen injectie en beeldacquisitie is zeer belangrijk, omdat het signaalvoor Renilla luciferase verlaagt precipitously ~ 30 seconden na injectie. Plaats de muis in zijn kooi en laten herstellen gedurende ≥ 1 uur, die ervoor zorgt dat het resterende Renilla luciferase-signaal is verdwenen en dat de muis is volledig hersteld van de narcose. </li><li> Dien 150 mg / kg van D-luciferine kaliumzout via IP injectie en wacht 5 minuten. Dit is de optimale concentratie van D-luciferine, die een stabiele luminescerende signaal 5-15 minuten na de injectie in proefdieren bepaald. Verdoof de muis met behulp van isoflourane en vervangen in de IVIS-200, en zorg ervoor dat het dier te positioneren in een zeer vergelijkbare positie ten opzichte van de oorspronkelijke Renilla overname. De totale intensiteit van de vuurvlieg signaal is afhankelijk van de activiteit van de promoter van belang, en als zodanig visualiseren vuurvlieg luciferase activiteit vereisen langere Zoektijden. </li><li> Met behulp van de IVIS Living Image software ingesteld op "fotonen"-modus, tot stand waardevollees voor zowel de Renilla en vuurvlieg overnames als een middel om de uitgangswaarde relatieve luminescentie verhoudingen (RLR) vast te stellen. </li></ol> 5. Longitudinale Luminescent Imaging <ol><li> 4T1 cellen zijn zeer agressief, zodat inoculatie van 1x10 4 cellen leidt vaak tot vorming palpabele tumor binnen 1 week, en de letaliteit van de dieren binnen 4-5 weken. 4T1 tumoren hebben een inherente neiging zweren in week 4. De groei en het onderhoud van zwerende tumoren kan aparte IACUC goedkeuring. De 4T1 tumor studies hierin weergegeven zijn goedgekeurd door de IACUC aan de Case Western Reserve University. </li><li> Zoals hierboven beschreven, moet muizen worden geïnjecteerd wekelijks RediJect Coelenterazine algemene tumorgroei en metastase te controleren, en met D-luciferine aan route-specifieke signalering bewaken tijdens verschillende stadia van tumoren. Let erop elke keer om ervoor te zorgen de Renilla luciferase signaal voorafgaand volledig verdwenen de verwervingvan de vuurvlieg luciferase signaal. </li><li> Zoals 4T1 tumoren en voortgang dient Renilla luciferase acquisities worden genormaliseerd naar de oorspronkelijke Renilla gemeten bij de tumorcel inoculatie als middel te normaliseren en volgen primaire tumorgroei. Nog belangrijker is dat de berekening RLR waarden in de tijd stelt de temporele regulering van individuele signaleringssystemen opzichte van tumorgroei en progressie. </li><li> Openlijke pulmonale metastase blijkt binnen 3-4 weken na 4T1 cellen aanslaan op het uiervet pad. Vergelijking pulmonale RLR waarden tegen die zijn berekend voor de primaire tumor wordt de ruimtelijke regulering van individuele signaleringssystemen opzichte van tumorgroei en metastase. </li></ol> 6. Dubbele Bioluminescent Imaging van twee unieke celtypes in een enkel dier <ol><li> Engineer een borstkanker cellijn stabiel expressie CMV aangedreven Renilla luciferase zoals hierboven beschreven. Herhaal dezeontwikkelingsproces met CMV aangedreven vuurvlieg luciferase op een tweede afzonderlijke borstkankercellijn. </li><li> Hierin we gemengde Renilla luciferase-expressie 4T1 cellen met hun isogene gemetastaseerde en vuurvlieg luciferase-expressie 4T07 tegenhangers 10, 11. Variërende verhoudingen van deze gemengde borstkanker celpopulaties worden vervolgens geïnjecteerd in de uiervet pad zoals hierboven beschreven. </li><li> Onmiddellijk verwerven zowel vuurvlieg en Renilla luciferase afbeeldingen om de eerste RLRs vertegenwoordiger van een bepaalde geënt celmengsel vast te stellen. </li><li> Longitudinale dual bioluminescent beeldvorming visualiseren en opsporen van wijzigingen in de cellulaire samenstelling in de primaire tumor alsook de tijdruimtelijke metastase van elk borstkanker afgeleide opzichte van tumorgroei en progressie. </li><li> Alternatief kunnen individuele borstkanker celpopulaties worden geënt in verschillende locaties in de muis (de rechter en linker buik uiervet pads)de systemische invloeden beoordelen deze twee populaties vertonen over elkaar tijdens verschillende stadia van tumorgroei en metastase. </li></ol> 7. Representatieve resultaten: De kracht van dual bioluminescent imaging ligt in het feit dat elk beeld is intern consistent en gecontroleerd, zodat de verdere signalen afgeleid uit de primaire tumor functie als een belangrijke maatstaf voor het succes of falen van elk Renilla en vuurvlieg acquisitie meten. Dit aspect van de imaging procedure is bijzonder belangrijk tijdens verwerving van de activiteit van Renilla luciferase, waarvan Coelenterazine substraat zeer gevoelig voor oxidatie die resulteert in het vermogen om auto-luminescentie. Figuur 1A toont een voorbeeld van deze bijwerking, die onmiddellijk manifesteert als aspecifieke luminescerende signalen afgeleid uit het darmkanaal, niet de gevestigde primaire tumor. Kenmerkend voor deze niet-specifieke Coelenterazine signaleert transpire na gefaalde intraveneuze injecties met deze Renilla luciferase substraat. Echter, zodra robuuste primaire tumor afkomstig Renilla signalen verkregen (fig. 1B, linker afbeelding), is het veilig om verder in vastleggen route-specifieke signalering metingen uit imaging vuurvlieg luciferase (fig. 1B, rechter paneel), waarvan de D-luciferine substraat is zeer stabiel op IP-injectie en produceert verwaarloosbare niveaus van de achtergrond auto-luminescentie. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3245/3245fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Verwerven Renilla en vuurvlieg-afgeleide bioluminescent beelden te berekenen in vivo RLRs. (A) Een voorbeeld van een mislukte IV injectie van Coelenterazine resulteert in niet-specifieke signaal uit het darmkanaal. Cirkel en PT geven de geschatte locatie van de primaire tumor. (B) Een succesvolle Renilla aankoop van een muis een 4T1 primaire tumor en p dragenulmonary metastasen (linker paneel; 4wk na vetkussentje implantatie). De overeenkomstige firefly overname stelt voor de berekening van RLRs binnen de primaire tumor en de longmetastasen. (C) Grafische weergave van de primaire tumor en longmetastasen RLRs berekend uit muizen getoond in paneel B (n = 4).

<ol><li>Wetterwald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cancer+metastasis+to+bone+marrow%3A+a+mouse+model+of+minimal+residual+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cancer metastasis to bone marrow: a mouse model of minimal residual disease.</a> Am. J. Pathol. 160, 1143-1153 (2002).</li>
<li>Wendt, M. K., Drury, L. J., Vongsa, R. A., Dwinell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+CXCL12+Expression+Induces+Anoikis+in+Colorectal+Carcinoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Constitutive CXCL12 Expression Induces Anoikis in Colorectal Carcinoma Cells.</a> Gastroenterology. 135, 508-508 (2008).</li>
<li>Wendt, M., Schiemann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+the+focal+adhesion+complex+prevents+oncogenic+TGF-beta+signaling+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of the focal adhesion complex prevents oncogenic TGF-beta signaling and metastasis.</a> Breast Cancer Research. 11, R68-R68 (2009).</li>
<li>Korpal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+transforming+growth+factor-beta+signaling+dynamics+and+therapeutic+response+in+breast+cancer+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging transforming growth factor-beta signaling dynamics and therapeutic response in breast cancer bone metastasis.</a> Nat Med. , (2009).</li>
<li>Giampieri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+and+reversible+TGFbeta+signalling+switches+breast+cancer+cells+from+cohesive+to+single+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility.</a> Nat Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).</li>
<li>Giampieri, S., Pinner, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+illuminates+transforming+growth+factor+beta+signaling+switches+during+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging illuminates transforming growth factor beta signaling switches during metastasis.</a> Cancer Res. 70, 3435-3439 (2010).</li>
<li>DeNardo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29+T+cells+regulate+pulmonary+metastasis+of+mammary+carcinomas+by+enhancing+protumor+properties+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">CD4(+) T cells regulate pulmonary metastasis of mammary carcinomas by enhancing protumor properties of macrophages.</a> Cancer Cell. 16, 91-102 (2009).</li>
<li>Wyckoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Paracrine+Loop+between+Tumor+Cells+and+Macrophages+Is+Required+for+Tumor+Cell+Migration+in+Mammary+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A Paracrine Loop between Tumor Cells and Macrophages Is Required for Tumor Cell Migration in Mammary Tumors.</a> Cancer Res. 64, 7022-7029 (2004).</li>
<li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+self-seeding+by+circulating+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor self-seeding by circulating cancer cells.</a> Cell. 139, 1315-1326 (2009).</li>
<li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).</li>
<li>Wendt, M. K., Smith, J. A., Schiemann, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta-induced+epithelial-mesenchymal+transition+facilitates+epidermal+growth+factor-dependent+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta-induced epithelial-mesenchymal transition facilitates epidermal growth factor-dependent breast cancer progression.</a> Oncogene. 29, 6485-6498 (2010).</li>
<li>Hawkins, E., Unch, J., Murhpy, N., Vidugiriene, J., Scurria, M., Klaubert, D., Wood, K. Bright Light, No Lysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHawkins%2C+E+%22Measuring+Renilla+Luciferase+Luminescence+in+Living+Cells%22">Measuring Renilla Luciferase Luminescence in Living Cells</a>. , Promega. (2005).</li>
<li>Roncali, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+device+for+real-time+bioluminescence+imaging+in+moving+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">New device for real-time bioluminescence imaging in moving rodents.</a> J. Biomed. Opt. 13, 054035-054035 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De absolute kracht van bioluminescent beeldvormingstechnieken ligt in hun vermogen om tumorgroei en metastase in complexe longitudinale studies, die hier bij het gebruik van agressieve 4T1 borstkankercellen kwantificeren. Omdat deze procedures gebaseerd op de stabiele integratie van luciferase reporter constructen kunnen deze technieken gemakkelijk worden aangepast en vertaald naar andere kankercellijnen van verschillende tumor latencies en metastatische mogelijkheden. Vergelijkbaar met de resultaten hierin getoond, berekening van het specifieke RLRs binnen langzaam ontwikkelende primaire tumoren en hun metastasen uiteindelijke maakt het real-time spatiotemporele dat specifieke signaleringsgebeurtenissen die tot uiting komen in de metastatische progressie van tumoren ongeacht de duur van latency. Na identificatie van specifieke promoter regulerende gebeurtenissen, is het belangrijk om accijns zowel de primaire tumor en metastasen voor het uitvoeren van standaard immunohistochemische en differentiatiel genexpressie analyses vergelijkbare regulering van de endogene gen en / of eiwit verifiëren. Technisch gezien is de belangrijkste uitdaging van de dubbele bioluminescente analyses ligt in de relatief korte duur van de Renilla luciferase signalen. Als zodanig is deze beeldvormende techniek is significant optimalisatie van de staartader injectie procedure, evenals de onmiddellijke imaging individueel geïnjecteerde dieren, een proces dat is tijdrovend en inefficiënt enigszins ten opzichte imaging vuurvlieg luciferase. Onlangs geïntroduceerd Promega &quot;Viviren&quot;, die een tweede generatie luciferase substraat de sites van de oxidatie worden geblokkeerd door verestering tot deze molecule zich toegang tot cellen, waarna de molecule snel gedeësterificeerd vertegenwoordigt. Gezamenlijk deze roman substraat verlaagt effectief auto-luminescentie en niet-specifieke modificatie en / of afbraak gekoppeld aan Renilla-geïnduceerde auto-luminescentie 12. Daarbij deze nieuwe renilleen luciferase substraat produceert heldere lichtgevende signalen, maar de hoge kosten verbonden aan de verwerving en het gebruik van &quot;Viviren&quot; hebben relatief weinig onderzoek dat nodig is om de totale nut van dit substraat in dual bioluminescente analyses te evalueren. Tenslotte de gevoeligheid van elke assay bioluminescent is kritisch afhankelijk van de CCD camera operant in het verwerven van individuele lichtunits. Inderdaad, zoals deze technologieën te verbeteren, voorzien we een punt in de toekomst waar ons vermogen om complexe licht-gemedieerde bioluminescente reacties te visualiseren kan efficiënt tot uiting komen in vrij bewegende dieren 13.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogusnummer </th></tr><tr><td> pGL4.2-Puro [luc2 / Puro] Vector </td><td> Promega </td><td> E6751 </td></tr><tr><td> Glomax Mult-idection systeem </td><td> Promega </td><td></td></tr><tr><td> IVIS 200 serie </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Dual luciferase reporter testsysteem </td><td> Promega </td><td> E1960 </td></tr><tr><td> Rediject coelenterazine-h </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 760506 </td></tr><tr><td> D-luciferine K-zout </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 122796 </td></tr></tbody></table>

in vivo dual ondergrond bioluminescent imaging

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Ons begrip van hoe en wanneer kankercellen in de borst doorvoer van gevestigde primaire tumoren bij metastasen is toegenomen in een uitzonderlijk tarief sinds de komst van bioluminescentie beeldvorming technologieën 1-3. Inderdaad, de mogelijkheid te lokaliseren en kwantificeren lengterichting tumorgroei in een cohort van dieren voltooiing van de studie, in tegenstelling tot offeren afzonderlijke groepen dieren op bepaalde tijden assay heeft een revolutie hoe onderzoekers borstkanker metastase te onderzoeken. Helaas huidige methodologieën weg aan de real-time evaluatie van kritische veranderingen die tot uiting komen in cell signaling systemen borstkankercellen (i) evolueren in primaire tumoren (ii) verspreiden door het hele lichaam, en (iii) proliferatieve programma te hervatten op plaatsen van een metastatische laesie. De recente ontwikkelingen in bioluminescent imaging thans mogelijk om gelijktijdig kwantificeren specifieke spatiotemporal veranderingen in genexpressie als functie van tumoren en metastatische progressie via het gebruik van dubbele substraat luminescentie reacties. Hiertoe onderzoekers maken van twee licht-producerende enzymen die luciferase van de vuurvlieg (Photinus pyralis) en zee pansy (Renilla reniformis), die beide reageren op elkaar uitsluiten substraten die reeds hun wijdverspreide gebruik vergemakkelijkt in vitro cel gebaseerde assays reportergen 4. Hier tonen we de in vivo bruikbaarheid van deze twee enzymen zodat een luminescentie reactie specifiek de grootte en locatie van een tumor ontwikkeling markeert, terwijl de tweede luminescerende reactie dient als middel om de activeringsstatus van specifieke signalen te visualiseren tijdens verschillende fasen tumor en metastase ontwikkeling. Zo zijn de doelstellingen van dit onderzoek zijn tweeledig. Eerst beschrijven we de stappen die nodig zijn om dual lichtgevende reporter cellijn construerens, evenals die nodig gebruik ervan te vergemakkelijken in het visualiseren van de tijdruimtelijke regulatie van genexpressie tijdens specifieke stappen van de metastatische cascade. Met het 4T1 model uitzaaiing van borstkanker, laten we zien dat de in vivo activiteit van een synthetische Smad Inbind (SBE) promoter sterk was verminderd in longmetastasen in vergelijking met die gemeten in de primaire tumor 4-6. Onlangs werd borstkanker metastase wordt gereguleerd door veranderingen in de primaire tumor micro-omgeving en reactief stroma, ook die welke zich in fibroblasten en infiltrerende immuuncellen 7-9. Dus zal ons tweede doelstelling is het nut van dubbele bioluminescent technieken toezicht de groei en lokalisatie van twee unieke celpopulaties geherbergd binnen een dier tijdens borstkanker groei en metastase tonen.

Hierin beschrijven we de methoden om te bouwen, visualiseren en kwantificeren van de bioluminescente reacties van zowel vuurvlieg en Renilla luciferase enzymen uitgedrukt in gemetastaseerde borstkanker cellen tijdens hun groei en metastase<em&gt; In vivo</em&gt;.

In vivo Dual ondergrond Bioluminescent Imaging

Ons begrip van hoe en wanneer borstkankercellen overgaan van gevestigde primaire tumoren naar metastatische locaties is in een uitzonderlijk tempo toegenomen ...

Deze procedure visualiseert en kwantificeert ran- en vuurvlieg-luciferase. Begin bij de ontwikkeling van in vivo orthotope tumoren met het construeren van stabiele cellijnen die ran vanilla, vuurvlieg-luciferase of beide tot expressie brengen. Verifieer vervolgens functioneel de in vitro regulatie van het stabiel tot expressie gebrachte reporterconstruct.De volgende stap is het enten van cellen in het vetweefsel van de melkklier en het verkrijgen en kwantificeren van zowel ran- als vuurvlieg-luciferase-metingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals immunohistochemie, is dat het een longitudinale en dynamische weergave mogelijk maakt van in vivo genregulatie tijdens tumorprogressie en metastasering. Begin met het transfecteren van vier T one mammacarcinoomcelculturen met een expressievector die vanilla-luciferase codeert.Transfecteer gedurende enkele dagen onder een geoptimaliseerde antibioticaconcentratie. Selecteer vervolgens ongeveer 10 individuele kolonies die ran vanilla luciferase tot expressie brengen om de graad van expressie te monitoren. Ga verder met het amplifieren van de kolonies die hoge hoeveelheden ran vanilla luciferase tot expressie brengen voor functionele analyses.Subcloneer de promoterregio van belang in een PGL4-luciferase-reporterplasmid met een selectiemarker die verschilt van de marker die wordt gebruikt voor stabiele expressie in vanilla-cellen; transfecteer de maligne cellen en selecteer op een stabiele polyklonale populatie van vuurvlieg-luciferase met behulp van traditionele in vitro celgebaseerde luciferase-reportergen-assays in 96-wells platen. Verifieer dat de DBR-cellen de expressie van vuurvlieg-luciferase reguleren op een wijze die overeenkomt met wat is waargenomen in transiently getransfecteerde oudercellen. Plaats de cellen met deze vectoren 15 minuten op een orbitale schudker om de cellen te lyseren.Verifieer daarnaast of de CMV-gestuurde expressie van vanilla niet wordt gereguleerd door diverse celstimulaties of behandelcondities. Kweek de DBR metastatische four one memory carcinoomcellen met een lage co-fluorescentie de dag voor de geplande procedure. Voor de in vivo inoculatiepassage worden de cellen voor inoculatie gedissocieerd door de four one cellen met trypsine te behandelen.Was grondig in groeimedium en verdun de cellen onmiddellijk in PBS. Bewaar op ijs. Anestheseer vrouwelijke bowel C-muizen van vier tot zes weken oud met isofluoraan.Gebruik een pincet. Pak het vierde inguinale geheugenkussen voorzichtig vast en til het op. Plaats zorgvuldig een naald van 27,5 gauge met de schuine zijde naar boven en injecteer in het geheugenvetkussen direct onder de tepel.Zorg ervoor dat de naald niet in de buikholte wordt geduwd. Laat de klier los en injecteer langzaam 50 µL van de celsuspensie in het vetkussentje van het geheugen terwijl de muizen nog onder narcose zijn. Injecteer 100 µL red eject cine in de laterale staartvene.Plaats de muis onmiddellijk in het IVUS 200-beeldvormingssysteem en neem gedurende één minuut een luminicent beeld op. Plaats de muis ongeveer een uur terug in de kooi, om ervoor te zorgen dat elk resterend ran vanilla Lucifer-signaal is verdwenen. Dien nu D Lucifer-kaliumzout toe via een IP-injectie en anesthetiseer de muis na vijf minuten met isof fluorine.De overdracht naar de IVUS 200 in een vergelijkbare positie vindt plaats in de oorspronkelijke RAN vanilla beeldacquisitie. Gebruik de IVUS living image-software ingesteld op de fotonmodus. Stel waarden vast voor zowel de acquisities als de firefly-acquisities.De zeer agressieve 41-cellen vormen binnen een week tastbare tumoren. Injecteer de muizen daarom elke week met red eject cine om de algemene tumorgroei en metastasering te monitoren. Injecteer vervolgens d Lucifer om pad-specifieke signalering tijdens verschillende stadia van de tumorontwikkeling te monitoren.Volg de groei van de primaire tumor door de RAN-luciferase-metingen te normaliseren ten opzichte van de eerste metingen bij de inoculatie van de tumorcellen. Belangrijker is dat de RLR-waarden in de loop van de tijd worden berekend om de temporele regulatie van individuele signaleringssystemen vast te stellen in relatie tot de tumorgroei en -progressie. Vergelijk nu de pulmonale RLR-waarden met die welke voor de primaire tumor zijn berekend om de ruimtelijke regulatie van individuele signaleringssystemen vast te stellen in relatie tot tumorgroei en metastase.Dual bioluminescent beelden worden gebruikt om veranderingen in de cellulaire samenstelling binnen de primaire tumor te visualiseren en te volgen. Meng eerst 4T1-cellen die vanilla luciferase tot expressie brengen met hun niet-metastatische en isogene 4T07-tegenhangers die firefly luciferase tot expressie brengen, en injecteer vervolgens variërende ratio's van deze gemengde borstkankercelpopulaties in het vetweefsel van de melkklier, zoals eerder beschreven. Leg onmiddellijk zowel firefly- als vanilla luciferase-beelden vast om de initiële RS vast te stellen die representatief is voor een bepaald geïnoculeerd celmengsel.Ga door met het verkrijgen van longitudinale dubbele bioluminescente beelden om de cellulaire samenstelling binnen de primaire tumor weer te geven. Evalueer daarnaast de spatiotemporele metastase van elk borstkankerderivaat in relatie tot de tumorgroei en -progressie. Aangezien elk beeld intern consistent en gecontroleerd is, vormt het aanhoudende signaal van de primaire tumor een belangrijke maatstaf om het algehele falen van elke vanilla- en firefly-data-acquisitie te peilen.Het linine-substraat is zeer gevoelig voor oxidatie, wat resulteert in autoluminescentie. Hier produceert een mislukte IV-injectie van lanine een aspecifiek signaal vanuit het maag-darmkanaal, en niet vanuit de gevestigde primaire tumor. Bij deze succesvolle renale acquisitie van een muis met een 41 primaire tumor en longmetastasen kunnen padspecifieke signaalmetingen worden afgeleid uit de beeldvorming van firefly luciferase.Deze gegevens maken het mogelijk om de RS te berekenen voor zowel de primaire tumor als de longmetastasen. Na voltooiing van dit experiment kunnen andere technieken, zoals immunohistochemie en in situ hybridisatie, worden gebruikt om te verifiëren dat het resultaat in mRNA en proteïne op een vergelijkbare wijze wordt gereguleerd als uw gerapporteerde construct.

in-vivo-dual-substrate-bioluminescent-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een in vivo beeldvormingssysteem wordt gebruikt om kwantitatieve metingen te genereren van muisinfecties met de Trypanosomatide protozoa Leishmania. Dit is een niet-invasieve en niet-lethale methode voor het detecteren van parasieten die luciferase tot expressie brengen in diverse weefsels gedurende het verloop van een chronische Leishmania spp. infectie.

In vivo imaging van transgene Leishmania parasieten in een Live Host

Luciferase-gemodificeerd menselijk brein tumor xenotransplantaten kan intracranially worden vastgesteld athymische muizen, met de daaropvolgende controle van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie beeldvorming. In combinatie met survival analyse, bioluminescentie monitoring is een essentieel onderzoeksinstrument voor pre-klinisch testen van therapieën worden overwogen voor de behandeling van hersentumoren.

Tot vaststelling van Intracraniële hersentumor xenotransplantaten Met verdere analyse van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie Imaging

Methoden voor bioluminescentie beeldvorming van bacteriële infecties bij levende dieren beschreven. Ziekteverwekkers worden aangepast om luciferase te drukken waardoor optisch het gehele lichaam van infecties in levende dieren. Diermodellen kunnen besmet zijn met luciferase uitdrukken pathogenen en de daaruit voortvloeiende beloop van de ziekte gevisualiseerd in real-time door bioluminescentie imaging.

Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen

Intracraniële implantatie van GL261 cellen in C57BL / 6 muizen produceert kwaadaardige gliomen dat veel van de kenmerken van de menselijke glioblastoma multiforme samenvatten. We gebruikten GL261 cellen die stabiel uitdrukken luciferase om ons in staat om te...

Intracraniële Implantatie met Latere 3D In Vivo Bioluminescent Imaging van Murine Gliomen

Bioluminescent Bacteriële Imaging<em&gt; In Vivo</em

Source: de Vries, C. R., et al., A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates a bioluminescent imaging technique to monitor bacterial infection progression in a live mouse model. Pathogenic bacteria engineered with the luxABCDE reporter system emit light at the infection site, allowing visualization of metabolically active bacteria. By imaging the mouse over time, researchers can non-invasively track infection...

Bioluminescence Imaging of Bacterial Infections in Mice

Source: Valentine, M. E., et al., Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the use of a bioluminescence-based imaging approach to monitor bacterial infection in a live mouse model. Sequential bioluminescent and X-ray imaging enables real-time visualization and anatomical localization of infection spread throughout the host.

Real-Time Imaging of Bacterial Infection in a Mouse Model Using Bioluminescence

Source: Weber, R. Z., et al., Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the method for in vivo bioluminescence imaging of genetically modified human neural progenitor cells injected in a mouse brain. The process involves luciferin injection, imaging preparation, and detection of bioluminescent signals from the transplanted cells at the injection site.

In Vivo Bioluminescence Imaging of Human Neural Progenitor Cells in a Mouse Brain

Gecombineerde optische en μCT beeldvorming in een muismodel van orthopedische implantaten infectie, gebruik van een bioluminescent gemanipuleerde stam van Staphylococcus aureus, die het vermogen om de dynamiek van de bacteriële infectie, evenals de overeenkomstige ontstekingsreactie en anatomische veranderingen in de noninvasively longitudinaal bewaken bone.

Gecombineerd<em&gt; In vivo</em&gt; Optisch en μCT Imaging aan Infectie, Ontsteking, en Bone Anatomie Monitor in een orthopedisch implantaat Infectie in Muizen

Dit protocol beschrijft de oprichting van een tumor-lager muismodel om te controleren van de progressie van de tumor en angiogenese in real-time door dubbele bioluminescentie beeldvorming.

Dubbele bioluminescentie beeldvorming van tumor progressie en angiogenese

Het hier verstrekte protocol beschrijft de gedetailleerde stappen om onderzoeken naar de werkzaamheid van geneesmiddelen uit te voeren in een bioluminescent model van Trypanosoma cruzi-infectie , met een focus op gegevensverzameling, -analyse en -interpretatie. Er zijn ook procedures voor probleemoplossing en kwaliteitscontrole om technische problemen tot een minimum te beperken.

Demystificerende in vivo bioluminescentiebeeldvorming van een muismodel van de ziekte van Chagas voor onderzoeken naar de werkzaamheid van geneesmiddelen

Leer een methode voor dubbele bioluminescentiebeeldvorming in vivo om tumorgroei en metastase bij borstkanker te volgen. Deze techniek maakt longitudinale monitoring van genregulatie mogelijk.

In vivo Dual ondergrond Bioluminescent Imaging

Meer video's verkennen