Een PCR-gebaseerde genotyperingsmethode onderscheid te maken tussen wild-type en Sier Rassen van Imperata cylindrica

Het hoofddoel van deze procedure is om een kosteneffectief en snel moleculair genotyperingsprotocol te bieden dat kan onderscheid maken tussen variëteiten van Retta cylindrica, meestal gon-gras genoemd, die niet alleen op basis van morfologie kunnen worden onderscheiden. Dit wordt bereikt door eerst weefsel van een geïnteresseerde gon-grasvariëteit te identificeren en isoleren. De volgende stap is het extraheren van nucleair en geplakt DNA uit het verzamelde weefsel.

Vervolgens wordt polymerasekettingreactie uitgevoerd op het geëxtraheerde DNA met behulp van variëteitspecifieke primers die doelgericht zijn op sequentieverhogingen in de PLAs-turn LF-regio, evenals geschikte positieve en negatieve controles. De laatste stap is het uitvoeren van gelelektroforese op elk van de vier PCR-reacties om de geamplificeerde PCR-producten te visualiseren. Uiteindelijk wordt de variëteit van het verzamelde gon-gras bepaald door analyse van de resulterende variëteitspecifieke PCR-productbanden op de gel Invasieve planten kosten de Verenigde Staten ongeveer 3,4 miljard per jaar en veroorzaken aanzienlijke schade aan zowel landbouw- als natuurlijke hulpbronnen.

Wild type imparato Electrica, ook bekend als Cogan-gras, is een van de top 10 slechtste invasieve onkruiden ter wereld. Cogan-gras vormt snel verspreidende mono-standjes die inheemse vegetatie verdringen en op hun beurt de dieren die van die inheemse vegetatie afhankelijk zijn. GaN-gras beslaat momenteel 490 miljoen hectare wereldwijd en ongeveer 500.000 hectare in de Verenigde Staten en de siervariëteit van ti van tus centrica wordt veel verhandeld onder de namen tus Centrica, Arbra, red Baren en Japanese blood crass, zoals we het JBG zullen noemen. Deze variëteit is vermoedelijk steriel en niet-invasief en wordt beschouwd als wenselijk vanwege zijn rood gekleurde bladeren.

Onder bepaalde omstandigheden kan Japans bloedgras levensvatbare zaden produceren en terugkeren naar een volledig groene vorm die onderscheidbaar is van wild type cogan-gras. Zoals je kunt zien, hebben ze allebei groene bladeren en zijn ze groter dan de traditionele siervariëteit met grotere bladeren. Bovendien hebben de teruggekeerde en wilde type planten grotere wortelstokken en verhoogt de siervariëteit zijn aseksuele reproductiepotentieel.

De terugkeer maakt identificatie door middel van alleen morfologie een uitdagende taak. Moleculaire methoden bieden een manier om invasieve planten en plantmaterialen nauwkeurig te onderscheiden die niet kunnen worden geïdentificeerd door normale visuele middelen.

Moleculaire methoden zijn van cruciaal belang om de verspreiding en introductie van invasieve planten te beschermen. Toepassing van dit moleculaire protocol biedt een manier om Japans bloedgrasreverts nauwkeurig te onderscheiden van Kogan-gras. Dit protocol kan helpen voorkomen dat er een co-optreden is met Kogan-gras en de mogelijke vorming van levensvatbare hybriden.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken zoals geamplificeerde fragmentlengtepolymorfisme, of AFLP-analyse en zaken als DNA-sequencing, is dat het een zeer kosteneffectieve en snelle moleculaire genotyperingstechniek biedt die gemakkelijk het verschil kan onderscheiden tussen wild type kogan-gras en variëteiten van Japans bloedgras. Het demonstreren van de techniek zal Joseph Hery zijn, een student uit ons laboratorium. Identificeer eerst een exemplaar van een site waar gon-gras of Japans bloedgras groeit en moet worden onderscheiden van elkaar.

Japans bloedgras kan gemakkelijk worden onderscheiden van wild type gon-gras door zijn felrode bladeren. De Japanse bloedgrasrevert is echter bijna niet te onderscheiden van Kogan-gras omdat ze beide langere groene bladeren, meer bladoppervlak en grotere wortelstokken hebben dan het sierlijke Japanse bloedgras. Deze methode kan worden gebruikt op vers, bevroren en recent gedroogd bladweefsel.

Als u weefsels wilt opslaan voor DNA-extractie op een later tijdstip, is de beste methode om het weefsel onmiddellijk in te vriezen en op te slaan bij min 80 graden Celsius. Als droge opslag noodzakelijk is, plaats het weefsel in een papieren envelop en bewaar de envelop in gedehydreerd silicagel of andere actieve droogmiddelen bij kamertemperatuur. Als vers weefsel moet worden gebruikt, zorg ervoor dat DNA binnen drie uur na verzameling wordt geëxtraheerd om degradatie te voorkomen.

Deze procedure gebruikt de DNEZ-planten mini-kit van Kyogen volgens de instructies van de fabrikant met één kleine wijziging. Hier. De procedure is aangepast zodat meer dan 100 milligram vers of bevroren weefsel of meer dan 20 milligram gedroogd weefsel wordt gebruikt. Maal eerst meer dan 100 milligram vers of bevroren bladweefsel, of meer dan 20 milligram droog bladweefsel, tot een fijn poeder met behulp van drie rondes vloeibaar stikstof met malen in een gekoelde vijzel en stamper.

Weeg het bevroren poeder van vers of bevroren weefsel in 100 milligram aliquots. Als u droog bladweefsel gebruikt, weegt u het poeder dan in 20 milligram aliquots. Na deze stap gaat u verder met de DNA-extractie volgens de instructies van de fabrikant met behulp van een spectrofotometer zoals de NanoDrop-spectrofotometertest, DNA, kwaliteit en kwantiteit goede DNA-opbrengsten zouden tussen 50 en 150 nanogram per microliter moeten liggen met twee 60 over twee 80 en 2 32 80-verhoudingen dicht bij 2,0 zoals hier gezien.

Voer elektroforese uit met behulp van een standaard 1% AROS-gel. Controleer de aanwezigheid van relatief grote banden groter dan 10 KB met geen tot weinig streaking van RNA-verontreiniging als de DNA-concentratie hoog is, verdun monsters tot 70 nanogram per microliter voor volgende stappen. De PCR-primers die in dit protocol worden gebruikt, aangegeven door de rode en groene pijlen, zijn gebaseerd op sequentieverskillen tussen de geplakte turn LF-spatierregio van Cogan-gras en Japans bloedgras genotypen.

Deze verschillen komen in de vorm van enkele nucleotidepolymorfismen en inserties en deleties aangegeven door de verticale zwarte pijlen, die de ontwikkeling van variëteitspecif