Name: Een PCR-gebaseerde genotyperingsmethode onderscheid te maken tussen wild-type en Sier Rassen van Imperata cylindrica /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Leer een snelle PCR-gebaseerde genotyperingsmethode om wild-type en siergrassen van Imperata cylindrica te onderscheiden. Dit protocol helpt onderzoekers bij het identificeren van invasieve soorten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Alan Tasker (USDA-APHIS, Riverdale, MD), Stephen Compton (Clemson), Sherry Aultman (Clemson), Craig Ramsey (USDA-APHIS, Fort Collins, CO), en Betty Marose (UMD) voor hulp bij het verkrijgen van monsters . Wij danken studenten Andrew Adrian (UA-Huntsville) en Derek Thacker (UA-Huntsville) voor hun hulp bij het testen van dit protocol, en Jozef Herdy voor zijn werk in het filmen van de video. Dit werk werd gefinancierd door National Fish and Wildlife Foundation.

1. Specimen verzamelen en bewaren Deze methode is ontwikkeld en getest met behulp van vers, bevroren, en sinds kort gedroogd blad weefsels. <ol><li> Identificeer cogongrass en / of JBG weefsels met behulp van een taxonoom dat gespecialiseerd is in grassoorten identificatie. De helderrode bladeren sier JBG gemakkelijk visueel te onderscheiden terug van wild-type en cogongrass JBG, maar cogongrass en JBG weer bijna niet van elkaar. Cogongrass en de JBG teruggekeerd fenotype hebben groene, langere bladeren, aanzienlijk groter en langer wortelstokken, en meer bladoppervlakte dan JBG 12 (figuur 1). </li><li> Fresh bladweefsel biedt de meest voorkomende en hoogste kwaliteit DNA en kunnen worden verzameld van het veld of in de kas geteeld I. kokervormig planten. Als sel wordt gebruikt, extract DNA binnen 3 uur verzameling om afbraak te voorkomen. Anders, voor te bereiden weefsel voor opslag, keeping het weefsel koel en niet in direct zonlicht. </li><li> Om weefsels voor DNA-extractie op te slaan op een later tijdstip, de meest optimale methode is te bevriezen en het weefsel op te slaan bij -80 ° C onmiddellijk. Zorg ervoor dat de bevroren weefsel te ontdooien voor DNA-extractie. Breng de bevroren weefsel om vloeibare stikstof voorafgaand aan het slijpen stappen van DNA-extractie om te voorkomen dat het ontdooien. </li><li> Als een -80 ° C vriezer niet beschikbaar is, droog het weefsel onmiddellijk. Voor droge opslag plaats het weefsel in een papier enveloppe en slaan de enveloppe in gedehydrateerde silica gel of andere actieve droogmiddelen bij kamertemperatuur. Een kleine hoeveelheid silica indicator gemengd met niet-aangegeven silica zorgt ervoor dat silica volledig gedehydrateerd en voor drooginstallatie weefsel. </li><li> Gebruik van ten minste 10 keer silicagel dan verse bladweefsel gew. Plantenweefsel, drogen binnen 24 uur. De kwaliteit en kwantiteit van DNA wordt verminderd door droog opslag gedurende tijd (bij herbarium monsters). </li></ol> 2. DNA-extractie Om DNA te extraheren uit plantenweefsel, volg dan de DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA; Cat # 69104 of 69106) instructies van de fabrikant met een kleine wijziging. In plaats van de voorgestelde minder dan 100 mg sel of minder dan 20 mg droog weefsel voor elke kolom malen groter dan 100 mg en 100 mg overbrengen van verse of bevroren weefsel (of&gt; 20 mg van droog weefsel) passende buizen voor extractie. Nuclear en plastide DNA gelijktijdig geëxtraheerd. <ol><li> Voordat u deze procedures, controleert u of ethanol is toegevoegd aan buffers AP3 / E en AW. </li><li> Gemalen&gt; 100 mg van verse of bevroren bladweefsel (of&gt; 20 mg droog bladweefsel) tot een fijn poeder met drie rondes van vloeibare stikstof malen in een gekoelde vijzel. Onvoldoende verstoring van het uitgangsmateriaal of onvoldoende lysis kan ook leiden tot lagere opbrengsten van het DNA. Voorzichtig maal de Tissue en niet te veel de kolommen met te veel weefsel. </li><li> Breng 100 mg bevroren poeder uit vers bevroren of weefsel (of 20 mg van poeder uit droog weefsel) met een 1,5 ml microcentrifugebuisje met 400 ul Buffer AP1 en 4 pi RNase A. Elk buis in een rek geplaatst worden op een evenwicht op het juiste gewicht van het weefsel per buis te controleren. </li><li> Vortex of schud monster (s) te mengen en incuberen gedurende 10 min bij 65 ° C, het buisje (s) 2-3 maal gedurende incubatie. </li><li> Voeg 130 ul buffer AP2 aan elk monster. Meng door het buisje (s) meerdere keren, en incubeer gedurende 5 minuten op ijs. </li><li> Pipet elk lysaat in een aparte QIAshredder Mini spin-kolom, en leg elke kolom in een 2 ml verzamelbuis (voorzien van de kit). Centrifuge kolom (men) gedurende 2 min bij 20.000 xg (~ 14.000 rpm), en breng elke flow-through fractie in een nieuwe buis (niet meegeleverd met de kit) zonder verstoring van eventueel gevormde pellet. </li><li> Voeg 1,5 volumes buffer AP3 /E, en mengen door pipetteren. </li><li> Breng 650 pi van het mengsel in een DNeasy Mini draai kolom in een 2 ml verzamelbuis. Centrifuge kolom (s) 1 min bij 6000 x g (~ 8000 rpm) en gooi de doorstroming. Herhaal stap met het resterende mengsel van elk monster. </li><li> Plaats de spin kolom (s) in een nieuwe 2 ml verzamelbuis (s) en voeg 500 ul Buffer van AW naar de top van elke kolom. Centrifuge kolom (s) 1 min bij 6000 x g (~ 8000 rpm) en gooi doorstroming. </li><li> Voeg nog een 500 pi van buffer AW naar de top van elke kolom. Centrifugeer 2 min bij 20.000 xg (~ 14.000 rpm). Deze stap droogt de kolom, waardoor elke resterende ethanol in de buffers die remmen PCR. </li><li> Overdracht elke spin kolom naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis monsterbuis. Voeg 100 ul Buffer AE naar de top van elke kolom voor elutie en incuberen kolom (s) 5 min bij kamertemperatuur. Centrifuge kolom (s) 1 min bij 6000 x g (~ 8000 rpm) het DNA te verzamelen. </li><li> Herhalen elutie stappen een keer, elueren de DNA in dezelfde 1,5 ml microcentrifugebuisje tot 200 ul van het monster te verkrijgen. Winkel DNA bij -20 ° C tot gebruik. DNA-concentraties afhankelijk weefseltype en opslag. Optimale opbrengsten worden verkregen wanneer geëlueerd DNA met een totaal van 200 pi buffer AE, maar concentraties kan worden verhoogd als elutievolume gereduceerd tot slechts 50 pi. </li></ol> 3. Verificatie van de DNA-Kwaliteit en kwantiteit <ol><li> Test de kwaliteit en kwantiteit van geëxtraheerd DNA voorafgaand aan PCR setup met behulp van een spectrofotometer of fluorometer en gel elektroforese. Dit zal helpen waarborgen het succes van de volgende stappen. </li><li> Met behulp van een spectrofotometer, test-DNA-kwaliteit en kwantiteit. Goede opbrengsten DNA moet tussen 50 en 150 ng / pl met 260/280 230/280 verhoudingen nabij 2,0. Als voorbeeld figuur 2 goede resultaten met de NanoDrop spectrofotometer (ThermoScientific, Wilmington, DE). </li><li> Voer elektroforese met een standaard 1% agarose gel. Controleer de aanwezigheid van relatief grote banden (&gt; 10 Kb) zonder weinig strepen van RNA verontreiniging (figuur 3). </li><li> Als de DNA-concentratie hoog is, verdund DNA monsters 70 ng / pl voor latere stappen. </li></ol> 4. PCR primers De PCR-primers die in dit protocol zijn gebaseerd op de volgorde verschillen tussen de plastide trnL-F spacer regio cogongrass en JBG genotypen. Deze verschillen komen in de vorm van SNPs (single nucleotide polymorphisms) en indels (Invoegen en verwijderen) dat de ontwikkeling van verschillende-specifieke primers door het lokaliseren van de primers op de sites van unieke sequenties (figuur 4) toegestaan. <ol><li> De kwaliteit van de primers kan een aanzienlijke invloed op de PCR resultaten. Bestel primers van een gerenommeerd bedrijf. We bestellen onze primers van Oblique Bio, Inc (:/ / Www.obliquebio.com/web/ "target =" _blank "&gt; http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL), met het verzoek alleen standaard ontzouting procedures. </li><li> trnL-F positieve controle primers: Deze primer set versterkt de plastide trnL-F spacer regio van de meeste gras taxa 11-13 en dient als een goede positieve controle (wat resulteert in een 890 bp band). <table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Volgorde </td></tr><tr><td> trnF (GAA)-F </td><td> 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 ' </td></tr><tr><td> trnL (5 'exon)-C </td><td> 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 ' </td></tr></tbody></table></li><li> Wild-type cogongrass primers: Deze primer set specifiek cogongrass en niet versterkt de trnL-F regio JBG genotypes. De set resulteert in een band die 595 bp. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Seqnvloeden </td></tr><tr><td> trnLF-C-F1 </td><td> 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 ' </td></tr><tr><td> trnLF-C-R1 </td><td> 5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 ' </td></tr></tbody></table></li><li> JBG en JBG Terugkeren primers: Deze primer set is specifiek voor JBG genotype en niet versterken de trnL-F regio cogongrass. De set resulteert in een band die 594 bp. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Volgorde </td></tr><tr><td> trnLF-R-F2 </td><td> 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 ' </td></tr><tr><td> trnLF-R-R2 </td><td> 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 ' </td></tr></tbody></table></li><li> Resuspenderen elke primer in voldoende hoeveelheid nuclease zonder DDH 2 O een 100 mM voorraad oplossingen die worden opgeslagen bij -20 ° C, langdurige verkrijgen. </li><li> Vul telkens primer voorraad tot 12 mm voor de PCR-setup stappen. </li></ol> 5. PCR-Setup DNA extracties geamplificeerd met elk van de bovenvermelde primersets in PCR-reacties. Voeg een positieve controle om alle PCR reagentia goed functioneren en een band genereren. Voeg een negatieve controle om ervoor te zorgen dat geen van de reagentia zijn verontreinigd met ongewenste DNA. De negatieve controle bevat geen-template en moet resulteren in geen band productie. <ol><li> Bereid alle reacties in dunwandige PCR-buisjes tot een betere warmte-overdracht tussen de thermocycler blok en het monster toe te staan. Wij raden u aan in de handel verkrijgbare spuitbussen zonder pipet tips om besmetting te voorkomen. </li><li> Voor elke geïsoleerde DNA-monster, dat is opgericht 50 ul PCR-reacties gebruik van elk van de bovenstaande primer sets in 0,2 ml dunwandige PCR-buisjes door toevoeging van de volgende reagentia on Ice in de volgorde hieronder vermeld. Als er meerdere monsters worden voorbereid, maak een cocktail met alle reagentia, met uitzonderingvan de DNA-template aan uniforme voorwaarden tussen alle reacties vast te stellen. <table border="1"><tbody><tr><td> PCR Reagens </td><td> Gebruikte volume </td><td> Final Concetration </td></tr><tr><td> Nuclease-free DDH 2 O </td><td> 40,5 ul </td><td></td></tr><tr><td> 10X Voordeel 2 PCR-buffer (Clonetech, CA) </td><td> 5,0 pl </td><td> 10% (v / v) </td></tr><tr><td> Voordeel UltraPure PCR dNTP Mix (10 mM elk, Clonetech, CA) </td><td> 1,0 pl </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> Primer 1 (12μM in DDH 2 O) </td><td> 1,0 pl </td><td> 0,24 uM </td></tr><tr><td> Primer 2 (12μM in DDH 2 O) </td><td> 1,0 pl </td><td> 0,24 uM </td></tr><tr><td> Voordeel 2 Polymerase Mix (Clonetech, CA) </td><td> 0,5 ul </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> DNA-extractie(70 ng / reactie; aan te passen DDH 2 O volume als nodig) </td><td> 1,0 pl </td><td> 1.4 ng / ul </td></tr><tr><td></td><td> Totaal: 50,0 ul </td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Om ervoor te zorgen dat alle PCR-reagentia goed werken, het instellen van de positieve controle met behulp van de positieve controle primers. Deze primer set werkt even goed voor cogongrass, JBG, JBG en terugkeren andere grassen en zal resulteren in een band die is 890 bp. </li><li> Stel de negatieve controle met behulp van dezelfde controle primer te stellen als de positieve controle, met behulp van DDH 2 O in plaats van de DNA-extractie. Als alle reagentia zijn vrij van DNA vervuilt, deze reactie zal resulteren in geen band. </li><li> Als de DNA-concentratie laag is, kan meer DNA worden toegevoegd aan elk reactievat, aanpassen van de hoeveelheid vrij Nuclease DDH 2 O gebruikt om het totale reactievolume van 50 pi brengen. Gebruik niet meer dan 5 ul DNA (10% het totale volume) per reaction kan mogelijk onzuiverheden in de DNA-monsters remmen PCR reacties. </li></ol> 6. PCR Fietsen <ol><li> Voer PCR amplificaties in een thermocycler uitgerust met een verwarmd deksel met behulp van de volgende PCR-fietsen parameters. We gebruiken de Mastercycle pro S thermocycler (Eppendorf, Hauppauge, NY) ingesteld om te werken met standaard temperatuur aanloop omstandigheden. Elke kwaliteit thermocycler moet goed te presteren. <table border="1"><tbody><tr><td> Cyclus </td><td> Denaturatie Gloeien </td><td> Polymerisatie </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 min bij 95 ° C </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 30 sec bij 95 ° C </td><td> 30 sec bij 61 ° C 90 sec bij 68 ° C 35 cycli </td></tr><tr><td> 3 </td><td></td><td> 5 min bij 68 ° C </td></tr><tr><td colspan="3"> Houden op 4 ° C tot het monster wordt verwijderd </td></tr></tbody></table></li><li> Optimaliseren voorwaarden voor PCR (inclusief primer hybridisatietemperatuur verlengingstijden, en het aantal cycli) nodig afhankelijk van de kwaliteit van het DNA primers Taq-polymerase of type thermocycler gebruikt. Aanbevolen om een gradiënt kan thermocycler het bepalen van de optimale gloeien temperaturen. </li><li> Indien de thermocycler gebruikte niet verwarmd deksel voeg 1 druppel minerale olie de top van elk monster om verdamping gedurende PCR fietsen. </li></ol> 7. Gelelektroforese van PCR producten Om de resultaten van de analyse visualiseren afzonderlijke PCR producten op een 1% agarosegel volgens standaardprocedures elektroforese. <ol><li> Combineer 2 pi van een standaard DNA laadbuffer (typisch 5x of 6 oplossing) met 5 pi van elk PCR-product geamplificeerd. </li><li> Plaats monster op een 1% agarose gel met EtBr (ethidiumbromide kleuring voor DNA) gemaakt either TAE of SB (natriumboraat) buffersystemen 16. We gebruiken 1 pi van een 10 mg / ml voorraadoplossing EtBr per 100 ml 1% agarose (0,1 ug / ml). </li><li> Run monsters op ~ 120V tot de kleurstof voorkant bereikt ¾ van de totale lengte van de gel. </li><li> Onder UV-licht (bijvoorbeeld een korte golf UV-licht doos), inspecteren de resulterende bands om te zien of een geschikt fragment was geamplificeerd. </li><li> Documenteer de gel en de daaruit voortvloeiende banden met behulp van een beschikbare foto-documentatie van systeem of camera. </li></ol> 8. Representatieve resultaten Bij weergave van de PCR-producten, cogongrass een uniek strepen patroon ten opzichte van JBG of teruggezet JBG (figuur 5). Voor elk DNA-monster, moet de trnL-F positieve controle primerset resulteren in een hoge intensiteit band op ~ 890 bp. Dit wordt gecontroleerd of alle PCR-reagentia goed werken. Ook moet de negatieve controle (geen template) reactie bevatten geen banden voor een primer set gebruikt. Dit bevestigt dat geen van de reagentia werden besmet. Als het DNA monster afgeleid van wild-type cogongrass een PCR reactie met de cogongrass specifieke primerset resulteert in een band ~ 595 bp wanneer de JBG-specifieke primers, waardoor er geen band. Ook indien het DNA monster uit JBG of teruggekeerd JBG, een PCR reactie met de JBG specifieke primerset resulteren in een band ~ 594 bp wanneer de cogongrass-specifieke primers, waardoor er geen band. Omdat JBG en keerde JBG identieke nucleïnezuursequentie, zullen zij derhalve een identieke bandenpatronen. Als er veel monsters worden vergeleken een gel tegelijkertijd, raden lopen alle monsters afkomstig van elke primer naast elkaar zetten, waardoor het beter de monsters positieve resultaten scannen. Morfologische verschillen tussen JBG en JBG terug zijn vrij duidelijk (bijv. rode kleur van de bladeren en kleinere gestalte van JB G ten opzichte van de groene kleur, grotere gestalte en agressieve groei van het JBG terug), dus terwijl de PCR-resultaten zal hetzelfde zijn, de JBG rassen zijn gemakkelijk te onderscheiden met behulp van planten morfologie. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Vergelijking van de kas geteelde Imperata cylindrica var. Koenigii (Japans bloed gras), Reverted I. cylindrica var. koenigii (JBG Ongedaan maken) en I. cylindrica (wild-type cogongrass). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Een voorbeeld van DNA monsters gecontroleerd met een NanoDrop spectrofotometer. Merk op dat, ongeacht de gebruikte spectrofotometer, de 260/280 verhouding moet in de buurt van 1.8 en de 260/230 verhouding moet in de buurt van 2.0. NHOUD "&gt; <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. DNA gecontroleerd met behulp van standaard gel elektroforese op een 1% agarose gel. Een commerciële DNA-merker werd gebruikt voor de grootte analyse. Lane 4 is een voorbeeld van slechte kwaliteit DNA monster met versmerings-en sommige RNA verontreiniging. <a href="/files/ftp_upload/3265/3265fig4_lg.jpg"><img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"></a> Figuur 4. Volgorde uitlijningen van de trnL-F regio's van Imperata cylindrica var. Koenigii (Japans bloed gras), Reverted I. cylindrica var. koenigii (JBG Ongedaan maken) en I. cylindrica (wild-type cogongrass). Verticale zwarte pijlen geven de verschillen in sequenties als gevolg van SNPs en indels. Horizontale groene pijlen geven de posities van de Wild-type cogongrass primers gebruikt voor cogongrass-specifieke PCR. Horizontale rode pijlen geven de positions van de JBG en JBG Terugkeren primers gebruikt voor JBG-specifieke PCR. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Representatief resultaat van gelelektroforese van PCR-producten afgeleid van cogongrass, JBG en JBG terug DNA gecombineerd met cogongrass en JBG-specifieke primers en de trnL-F positieve controle en geen template negatieve controle.

<ol><li>Holm, L. G., Pancho, J. V., Herberger, J. P., Plucknett, D. L. A Geographical Atlas of World Weeds. , Krieger Publishing Company. Malabar, Florida, U.S. (1979).</li>
<li>CABI, Crop Protection Compendium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCABI%2C++%22Commonwealth+Agricultural+Bureau+International+%28CABI%29%22">Commonwealth Agricultural Bureau International (CABI)</a>. , Wallingford, UK. (2007).</li>
<li>MacDonald, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+-+Biology%2C+ecology%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cogongrass (Imperata cylindrica) - Biology, ecology, and management.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 23, 367-380 (2004).</li>
<li>Talley, S. M., Cseke, L. J. Molecular diagnostic technologies for invasive plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTalley%2C+SM+%22CPHST+Fort+Collins+Laboratory+2009+Annual+Report%22">CPHST Fort Collins Laboratory 2009 Annual Report</a>. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 27-28 (2009).</li>
<li>Dozier, H., Gaffney, J. F., McDonald, S. -K., Johnson, E. R. R. L., Shilling, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cogongrass+in+the+United+States%3A+History%2C+ecology%2C+impacts%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Technology%22%5BJournal%5D)">Cogongrass in the United States: History, ecology, impacts, and management.</a> Weed Technology. 12, 737-743 (1998).</li>
<li>Chikoye, D., Ekeleme, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weed+flora+and+soil+seedbanks+in+fields+dominated+by+Imperata+cylindrica+in+the+moist+savannah+of+West+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Research%22%5BJournal%5D)">Weed flora and soil seedbanks in fields dominated by Imperata cylindrica in the moist savannah of West Africa.</a> Weed Research. 41, 475-490 (2001).</li>
<li>Weber, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeber%2C+E+%22Invasive+Plant+Species+of+the+World%3A+A+Reference+Guide+to+Environmental+Weeds%22">Invasive Plant Species of the World: A Reference Guide to Environmental Weeds</a>. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2003).</li>
<li>Patterson, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shading+effects+on+growth+and+partitioning+of+plant+biomass+in+Cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+from+shaded+and+exposed+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">Shading effects on growth and partitioning of plant biomass in Cogongrass (Imperata cylindrica) from shaded and exposed habitats.</a> Weed Science. 28, 735-740 (1980).</li>
<li>Cole, J. T., Cole, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ornamental+grass+growth+response+to+three+shade+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Horticulture%22%5BJournal%5D)">Ornamental grass growth response to three shade intensities.</a> Journal of Environmental Horticulture. 18, 18-22 (2000).</li>
<li>Bryson, C. T., Koger, C. H., Byrd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+and+exposure+period+to+heat+on+cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature and exposure period to heat on cogongrass (Imperata cylindrica) viability.</a> Weed Technology. 21, 141-144 (2007).</li>
<li>Capo-chichi, L. J. A., Faircloth, W. H., Williamson, A. G., Patterson, M. G., Miller, J. H., van Santen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+Dynamics+and+Genotypic+Diversity+of+Cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+at+the+Point+of+Introduction+in+the+Southeastern+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Invasive+Plant+Science+and+Management%22%5BJournal%5D)">Invasion Dynamics and Genotypic Diversity of Cogongrass (Imperata cylindrica) at the Point of Introduction in the Southeastern United States.</a> Invasive Plant Science and Management. 1 (2), 133-141 (2008).</li>
<li>Talley, S. M., Ramsey, C. L. Experimentally assessing the invasive potential of plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTalley%2C+SM+%22CPHST+Laboratory+2009+Annual+Report%22">CPHST Laboratory 2009 Annual Report</a>. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 29-30 (2009).</li>
<li>Hodkinson, T. R., Chase, M. W., Lledó, M. D., Salamin, N., Renvoize, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetics+of+Miscanthus%2C+Saccharum+and+related+genera+%28Saccharinae%2C+Andropogoneae%2C+Poaceae%29+based+on+DNA+sequences+from+ITS+nuclear+ribosomal+DNA+and+plastid+trnLintron+and+trnL-F+intergenic+spacers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Res%22%5BJournal%5D)">Phylogenetics of Miscanthus, Saccharum and related genera (Saccharinae, Andropogoneae, Poaceae) based on DNA sequences from ITS nuclear ribosomal DNA and plastid trnLintron and trnL-F intergenic spacers.</a> J. Plant Res. 115, 381-392 (2002).</li>
<li>Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., Janzen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+DNA+barcodes+to+identify+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Use of DNA barcodes to identify flowering plants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23), 8369-8374 (2005).</li>
<li>Roodt-Wilding, R., Spies, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+relationships+in+southern+African+chloridoid+grasses+%28Poaceae%29+based+on+nuclear+and+chloroplast+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Systematics+and+Biodiversity%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic relationships in southern African chloridoid grasses (Poaceae) based on nuclear and chloroplast sequence data.</a> Systematics and Biodiversity. 4, 401-415 (2006).</li>
<li>Brody, J. R., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+boric+acid%3A+a+Tris-free%2C+cooler+conductive+medium+for+DNA+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis.</a> BioTechniques. 36, 214-216 (2004).</li>
<li>Chou, C. -H., Tsai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+the+intergenic+spacer+of+ribosomal+DNA+of+Imperata+cylindrica+%28L.%29+Beauv.+var.+major+%28Cogongrass%29+populations+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Bulletin+of+Academia+Sinica+%28Taipei%29%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in the intergenic spacer of ribosomal DNA of Imperata cylindrica (L.) Beauv. var. major (Cogongrass) populations in Taiwan.</a> Botanical Bulletin of Academia Sinica (Taipei). 40, 319-332 (1999).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

<html> De Amerikaanse kleuter-en het landschap industrie baseert zich op het kweken en verkopen van exotische en nieuwe plantensoorten. Dit, in combinatie met de toenemende globalisering van de handel, verhoogt de kans dat een invasieve plantensoorten zullen voeren, vast te stellen en te verspreiden in de VS De mogelijkheid om de federale regels voor dergelijke planten is gebaseerd op informatie die vaak niet beschikbaar is, inclusief de mogelijkheid om invasief te worden , de juiste taxonomie, en genetische eigenheid uit autochtone en genaturaliseerde taxa. Door onze kennis van invasieve planten is vaak beperkt, zijn geïmporteerde planten met verborgen invasieve eigenschappen zijn vrijwillig opgenomen om later te leren dat ze onze landbouw en natuurlijke hulpbronnen binnen te vallen. Dit protocol is gericht aan te pakken die problemen in verband met I. cylindrica rassen door het verstrekken van de eerste vereenvoudigde moleculaire methode die nauwkeurig kan onderscheid maken tussen wild-type cogongrass en keerde vorm van zijn decoratieve JBG tegenhanger. jove_content &quot;&gt; Voor de ontwikkeling van dit protocol, werd wild-type cogongrass verzameld uit genaturaliseerde populaties op het Pond Creek Bosbouw-eenheid in Santa Rosa County in de buurt van Jay, FL in juni van 2008. JBG werd aangekocht bij een commerciële kwekerij (Bluebird Nursery, Inc ..) in juni 2008 en van een huis de collectie in Columbia JBG terug werden verkregen van de binnenplaats van de Campbell Geologisch Museum in Clemson University, SC in juni 2008, van University Park in Riverdale, MA in juni 2009, en uit de voortuin van een huis in Columbia in 2009 (geïdentificeerd door Leland Cseke). Alle planten werden aangehouden in een kas gelegen aan de Universiteit van Alabama in Huntsville (Huntsville, AL). Genetische sequentie van DNA afkomstig van deze planten onder de diepte vergelijkingen 9 onafhankelijke DNA&#39;s die worden gebruikt om barcode planten 2. In alle gevallen de volgorde van JBG was 100% overeenkomst met die van de JBG terug en daardoor aanverifiëren dat JBG inderdaad terug te keren naar een groene, invasieve vorm. Alleen de nucleaire ITS en de chloroplast trnL-F&#39;s hebben verschillen die kunnen worden gebruikt om genetisch onderscheid te maken tussen cogongrass en JBG. De ITS-regio heeft in totaal 3 SNPs (single nucleotide polymorfismen) tussen cogongrass en JBG, terwijl de trnL-F regio heeft 2 SNP&#39;s en 2 indels (inserties en deleties). Deze genetische verschillen toegestaan ​​verscheidenheid-specifieke PCR-primers te ontwikkelen die onderscheid kan maken tussen wild-type cogongrass en JBG terug. De meest betrouwbare resultaten uit primers afgeleid van de plastide trnL-F gebied. Aldus wordt dit protocol gebaseerd op de sequentie verschillen tussen de trnL-F gebieden van de chloroplastgenoom van cogongrass, JBG en teruggekeerd JBG (figuur 4). Om u te helpen het genereren van primers die meer specifiek zijn voor de rassen in kwestie en om te helpen voorkomen dat valse meldingen van nauw verwante soorten, all bekende trnL-F sequenties I. cylindrica rassen werden vergeleken met trnL-F sequenties uit verwante grassoort (43 onafhankelijke sequenties uit 29 soorten, bijvoorbeeld Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix Lacryma-Jobi, Miscanthus sinensis, Saccharum officinarum, Sorghum halepense). Hoewel we verschillende-specifieke primer sequenties onderzocht in 29 soorten gras, de specificiteit van het ras-specifieke primers is niet uitgebreid onderzocht op zijn vermogen om DNA te amplificeren van de meeste andere grassoorten. Bijgevolg moeten weefsel gebruikt voor DNA-extractie zorgvuldig worden geïdentificeerd I. cylindrica vóór het begin van dit protocol. Als het gras niet kan worden onderkend dat zij cogongrass of JBG, dan raden wij sequencing van het PCR-product om ervoor te zorgen dat de sequenties zijn een exacte overeenkomst aan cogongrass of JBG. Momenteel is de nauwkeurige methode om de identiteit van een bepaald monster gras te controleren is PCR op zowel de tRNL-F en ITS-gebieden, gevolgd door sequentie controle van PCR producten en vergelijking van de sequenties bekende sequenties niet nauwkeurig vastgestelde taxa. DNA kan worden versterkt met behulp van controle primers beschreven in dit protocol (voor de trnL-F regio) of andere primers die beschikbaar zijn in andere publicaties 13-15. Sequencing is veel meer arbeid en kosten intensief dan het gebruik van onze vereenvoudigde procedure. De kwaliteit van de primers gebruikt voor PCR is voor het succes van de behandeling. We hebben de primers voor deze procedure beschikbaar zijn vanaf Oblique Bio, Inc ( <a href="http://www.obliquebio.com/web/" target="_blank">http://www.obliquebio.com/web/</a> , Huntsville, AL). Het voordeel bestelling van de primers uit schuine Bio is dat grote aantallen monsters van elke primer van de identieke monsters productieseries de primers we voor optimalisatie in ons laboratorium slaan. Derhalve primers niet alleen dezelfde volgorde, maar they komen uit exact dezelfde productie veel dat werd gebruikt in dit protocol. Met behulp van primers van dezelfde partij, kan helpen voorkomen dat externe variabelen in de procedure die kan voortvloeien uit verschillen in de kwaliteit van de PCR-primers. Evenzo zal terwijl andere Taq polymerase moeten werken voor PCR werd de kwaliteit van de gebruikte Taq polymerase van invloed op de kwaliteit van PCR resultaten. Om ervoor te zorgen voor een betere consistentie in PCR-reagentia, hebben we het protocol geoptimaliseerd met behulp van reagentia van Clontech. De Voordeel 2 Polymerase (Clontech, Mountain View, CA, Cat # 639201 of 639202) is een mengsel van een robuuste, hot-start Taq-polymerase en een proof-lezen enzym dat helpt om een ​​hoge specificiteit en nauwkeuriger amplificaties. Omdat dit protocol is gebaseerd op chloroplast DNA, dat de moeder wordt geërfd in grassen, kan hybridisatie tussen cogongrass en JBG genotypes niet te vangen met onze moleculaire identificatie procedure. In gevallen waarin hypridization is suspected, raden we u aan nucleaire regio&#39;s die zijn overgenomen van beide ouders. De meest gebruikte niet-plastide variabele gebied om te overwegen in plantaardige genotypering is de nucleaire ribosomale ITS gebied 13-15,17. Op dit moment maken we vooruitgang in de richting multiplexing de versterking van de chloroplast trnL-F regio met die van de nucleaire ITS regio in dezelfde PCR-buis. Multiplexing plastide met nucleaire DNA-regio&#39;s zou mogelijk omzeilen van de beperkingen van het gebruik, hetzij alleen, maar dergelijke methoden vereisen optimalisatie en bijkomende evaluatie om de haalbaarheid te bepalen van geval tot geval. Het gebruik van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) en nieuwere technologieën, zoals moleculaire beacons (fluorescerende probes primer), worden ook beoordeeld als fail-safe en nauwkeurige plant genotypering methoden. Het protocol hier gepresenteerde biedt een snelle en betrouwbare aanpak te onderscheiden van de JBG terug van dat van wild-type cogongrass. Wij moedigen het gebruikrs van dit protocol om ons te contacteren om de resultaten verkregen uit het gebruik van dit protocol te melden. Die gedeelde informatie zal helpen informatie te verstrekken over de verdeling van JBG terug. Dit zal ook helpen regelgevers op het USDA weloverwogen beslissingen nemen over de maatregelen die kunnen worden nodig om de verspreiding en de mogelijke hybridisatie van de zeer invasieve soorten cogongrass te omzeilen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> DNeasy Plant Mini Kit </td><td> Qiagen, Valencia, CA </td><td> 69104 of 69106 </td><td> Elke gerenommeerde genomische plant DNA kit die goede kwaliteit levert DNA zou moeten werken voor deze procedures. </td></tr><tr><td> trnF (GAA)-F </td><td> Oblique Bio, Inc </td><td> 3-0578 </td><td> Forward positieve controle primer </td></tr><tr><td> trnL (5 &#39;exon)-C </td><td> Oblique Bio, Inc </td><td> 3-0579 </td><td> Reverse positieve controle primer </td></tr><tr><td> trnLF-C-F1 </td><td> Oblique Bio, Inc </td><td> 3-0864 </td><td> Forward wild-type cogongrass primer </td></tr><tr><td> trnLF-C-R1 </td><td> Oblique Bio, Inc </td><td> 3-0865 </td><td> Omkerenwild-type cogongrass primer </td></tr><tr><td> trnLF-R-F2 </td><td> Oblique Bio, Inc </td><td> 3-0866 </td><td> Forward JBG en JBG terug primer </td></tr><tr><td> trnLF-R-R2 </td><td> Oblique Bio, Inc </td><td> 3-0867 </td><td> Reverse JBG en JBG terug primer </td></tr><tr><td> Voordeel UltraPure PCR dNTP Mix </td><td> Clontech, Mountain View, CA </td><td> 639125 </td><td></td></tr><tr><td> Voordeel 2 Polymerase </td><td> Clontech, Mountain View, CA </td><td> 639201 of 639202 </td><td> Een goede proeflezen, hot-start Taq-polymerase </td></tr></tbody></table>

een pcr-gebaseerde genotyperingsmethode onderscheid te maken tussen wild-type en sier rassen van imperata cylindrica</em

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is een van de top tien van slechtste invasieve planten in de wereld, een negatieve invloed op de landbouw en de natuurlijke hulpbronnen in 73 verschillende landen in Afrika, Azië, Europa, Nieuw-Zeeland, Oceanië en Zuid-Amerika 1-2. Cogongrass vormt snel verspreiden, monodominant staat dat een grote verscheidenheid aan inheemse plantensoorten verdringen en op zijn beurt een bedreiging voor de inheemse dieren die afhankelijk zijn van de verdreven inheemse plantensoorten voor voer en onderdak. Toe te voegen aan het probleem, een siertuin variëteit [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] wordt op grote schaal de markt gebracht onder de namen van Imperata cylindrica &#39;Rubra&#39;, Red Baron, en Japans bloed gras (JBG). Deze variëteit is vermeende steriel en niet-invasieve en wordt beschouwd als een wenselijke sier voor de rood-gekleurde bladeren. Echter, onder de juiste omstandigheden kan JBG levensvatbare zaden (Carol Holko, 2009 persoonlijke communicatie) en kan terugkeren naar een groene invasive vorm die vaak niet te onderscheiden van cogongrass als het nodig is op de onderscheidende kenmerken van de wild-type invasieve variëteit 4 (figuur 1). Dit maakt identificatie met behulp van de morfologie een moeilijke taak, zelfs voor goed getrainde plant taxonomen. Terugkeer van JBG een agressieve groene fenotype is ook geen zeldzaamheid. Met behulp van sequentie vergelijkingen van codering-en variabele regio&#39;s in zowel de kern-en chloroplast DNA, hebben we bevestigd dat JBG is teruggekeerd naar het groene invasieve binnen de staten Maryland, South Carolina, en Missouri. JBG is verkocht en geplant in bijna elke staat in de continentale VS, waar er geen actief cogongrass besmetting. De omvang van het probleem in weer niet goed begrepen, want planten zijn teruggekeerd zonder papieren en vaak vernietigd. De toepassing van deze moleculaire protocol voorziet in een methode om te identificeren JBG terug en kan helpen om deze rassen van co-optreden eenND mogelijk hybridiseren. Cogongrass is een obligate outcrosser en, indien gekruist met een ander genotype, kan produceren levensvatbare wind-verspreide zaden die cogongrass verspreid over grote afstanden 5-7. JBG heeft een iets ander genotype dan cogongrass en kan in staat zijn om levensvatbare hybriden te vormen met cogongrass. Toe te voegen aan het probleem, JBG is koud en donker tolerant dan cogongrass 8-10, en de gene flow tussen deze twee soorten is waarschijnlijk hybriden die agressiever te genereren, schaduw tolerant en winterharde dan wild-type cogongrass. Terwijl de wild-type cogongrass momenteel teistert meer dan 490 miljoen hectare wereldwijd, in het zuidoosten VS het teistert meer dan 500.000 hectare en is in staat bezetten het grootste deel van de VS als het zich snel verspreidt naar het noorden vanwege de brede niche en geografische mogelijkheden 3,7,11. Het potentieel van een genetische kruising is een ernstig probleem voor de USDA-APHIS federale schadelijke weekprogramma. Momenteel is de USDA-APHIS verbiedt JBG in staten whvoordat er grote cogongrass parasitaire aandoeningen (bijv., Florida, Alabama, Mississippi). Kan echter voorkomen dat de twee varianten van een combinatie van moeilijker als cogongrass en JBG breiden hun distributies. Bovendien is de verdeling van de JBG weer is onbekend en zonder het vermogen om deze soorten te identificeren door morfologie sommige cogongrass parasitaire kan het gevolg zijn van JBG terug. Helaas huidige moleculaire identificatiemethoden gewoonlijk afhankelijk AFLP (geamplificeerde fragment lengte polymorfismen) en DNA sequentie, die beide zijn tijdrovend en kostbaar. Hier presenteren we de eerste kosten-effectieve en betrouwbare PCR-gebaseerde moleculaire genotypering methode om nauwkeurig onderscheid te maken tussen cogongrass en JBG terug.

Wij bieden een kosteneffectieve en snelle moleculaire genotypering protocol dat ras-specifieke PCR-primers werken die zich richten op DNA-sequentie verschillen binnen de chloroplast trnL-F spacer regio onderscheid te maken tussen soorten<em&gt; Imperata cylindrica</em&gt; (Cogongrass) die niet kan worden onderscheiden door de morfologie alleen. Deze rassen zijn onder andere de federaal vermeld schadelijke onkruid, cogongrass en de nauw verwante, wijdverbreide decoratieve variëteit, ik<em&gt;. cylindrica</em&gt; Var.<em&gt; Koenigii</em&gt; (Japans bloed gras).

Een PCR-gebaseerde genotyperingsmethode onderscheid te maken tussen wild-type en Sier Rassen van Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is een van de tien ergste invasieve planten ter wereld die een negatieve impact hebben op landbouw- en natuurlijke hulpbronnen in ...

Het hoofddoel van deze procedure is het bieden van een kosteneffectief en snel moleculair genotyperingsprotocol waarmee onderscheid kan worden gemaakt tussen variëteiten van Retta cylindrica, gewoonlijk gongras genoemd, die op basis van morfologie alleen niet van elkaar te onderscheiden zijn. Dit wordt bereikt door eerst weefsel van een relevante variëteit gongras te identificeren en te isoleren. De volgende stap is het extraheren van nucleair en plastide DNA uit het verzamelde weefsel.Vervolgens wordt een polymerasekettenreactie uitgevoerd op het geëxtraheerde DNA met variëteitsspecifieke primers die gericht zijn op sequentieverschillen in de PLAs turn LF-regio, samen met passende positieve en negatieve controles. De laatste stap is het uitvoeren van gelelektroforese op elk van de vier PCR-reacties om de geamplificeerde PCR-producten te visualiseren. Uiteindelijk wordt de variëteit van het verzamelde gon-gras bepaald door analyse van de resulterende variëteitsspecifieke PCR-productbanden op de gel. Invasieve planten kosten de Verenigde Staten jaarlijks ongeveer 3,4 miljard, wat aanzienlijke schade toebrengt aan zowel landbouwkundige als natuurlijke hulpbronnen.Het wilde type Imperata cylindrica, ook wel bekend als Cogan grass, is een van de 10 ergste invasieve onkruiden ter wereld. Cogan grass verspreidt zich snel in monocultures die inheemse vegetatie verdringen en daarmee ook de dieren die van die inheemse vegetatie afhankelijk zijn. Cogan grass besmet momenteel 490 miljoen hectare wereldwijd en ongeveer 500.000 hectare in de Verenigde Staten. Een sierrasvariant van Imperata cylindrica wordt op grote schaal vermarkt onder de namen Imperata cylindrica, Arbra, Red Baron en Japanese blood grass, wat we hierna JBG zullen noemen. Deze variëteit is vermoedelijk steriel en niet-invasief, en wordt gewaardeerd om zijn rood gekleurde bladeren.Onder bepaalde omstandigheden kan Japans bloedgras levensvatbare zaden produceren en terugkeren naar een geheel groene vorm die niet te onderscheiden is van het wilde type cogongrass. Zoals u kunt zien, hebben ze beide groene bladeren en zijn ze groter dan de traditionele sierteeltvariant, met grotere bladeren. Daarnaast hebben de teruggekeerde en het wilde type planten grotere rhizomen, wat het aseksuele reproductiepotentieel van de sierteeltvariant vergroot.De terugval maakt identificatie op basis van morfologie alleen tot een moeizame taak. Moleculaire methoden bieden een manier om invasieve planten en plantmateriaal dat niet via normale visuele middelen kan worden geïdentificeerd, nauwkeurig te onderscheiden.Moleculaire methoden zijn essentieel om de verspreiding en introductie van invasieve planten tegen te gaan. Toepassing van dit moleculaire protocol biedt een manier om Japanese blood grass-terugslagen nauwkeurig te onderscheiden van Kogan grass. Dit protocol kan helpen om co-occurence met Kogan grass en de mogelijke vorming van levensvatbare hybriden te voorkomen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken, zoals amplified fragment length polymorphism (AFLP-analyse) en DNA-sequencing, is dat het een zeer kosteneffectieve en snelle moleculaire genotyperingsmethode biedt waarmee het verschil tussen wild-type kogan grass en variëteiten van Japanse bloedgras eenvoudig kan worden onderscheiden. De techniek zal worden gedemonstreerd door Joseph Hery, een student uit ons laboratorium. Identificeer eerst een specimen van een locatie waar kogan grass of Japans bloedgras groeien en waarbij onderscheid moet worden gemaakt tussen de twee.Japanse bloedgras is gemakkelijk te onderscheiden van wildtype Kogan-gras door de helderrode bladeren. Echter, de revert van Japanse bloedgras is bijna niet te onderscheiden van Kogan-gras, aangezien ze beide langere groene bladeren, een groter bladoppervlak en grotere rhizomen hebben dan het siergras van de Japanse bloedgras. Deze methode kan worden toegepast op verse, bevroren en recent gedroogde bladweefsels.Indien weefsels worden bewaard voor DNA-extractie op een latere datum, is de beste methode om het weefsel onmiddellijk bij minus 80 °C te bevriezen en te bewaren. Als droge bewaring noodzakelijk is, plaats het weefsel dan in een papieren envelop en bewaar de envelop bij kamertemperatuur in gedehydrateerde silicagel of andere actieve droogmiddelen. Indien vers weefsel wordt gebruikt, dient men ervoor te zorgen dat het DNA binnen drie uur na afname wordt geëxtraheerd om degradatie te voorkomen.Deze procedure maakt gebruik van de DNEZ plants mini kit van Kyogen volgens de instructies van de fabrikant met één kleine aanpassing. De procedure is aangepast zodat er meer dan 100 milligram vers of bevroren weefsel, of meer dan 20 milligram gedroogd weefsel wordt gebruikt. Maal eerst meer dan 100 milligram vers of bevroren bladweefsel, of meer dan 20 milligram droog bladweefsel, tot een fijn poeder met drie rondes vloeibare stikstof en vermaling in een gekoelde vijzel en stamper.Weeg het bevroren poeder van vers of bevroren weefsel af in aliquots van 100 milligram. Indien er droog bladweefsel wordt gebruikt, weeg het poeder dan af in aliquots van 20 milligram. Voer na deze stap de DNA-extractie uit volgens de instructies van de fabrikant met behulp van een spectrophotometer, zoals de NanoDrop spectrophotometer test; voor een goede DNA-kwaliteit en -kwantiteit moeten de DNA-opbrengsten tussen de 50 en 150 nanograms per microliter liggen, met 260/280 en 230/280 ratios dicht bij 2,0, zoals hier wordt getoond.Voer elektroforese uit met een standaard 1%AROS-gel. Verifieer de aanwezigheid van relatief grote banden groter dan 10 KB met weinig tot geen uitstretching door RNA-contaminatie; indien de DNA-concentratie hoog is, verdun de monsters tot 70 nanogram per microliter voor de volgende stappen. De PCR-primers die in dit protocol worden gebruikt, aangegeven door de rode en groene pijlen, zijn gebaseerd op sequentieverschillen tussen de plastered turn LF-spacerregio van Cogan-gras en Japanse bloedgrasgenotypen.Deze verschillen zijn aanwezig in de vorm van enkelnucleotide-polymorfismen en inserties en deleties, aangegeven door de verticale zwarte pijlen, waardoor de ontwikkeling van varieteitspecifieke primers mogelijk is. Door de primers te positioneren op de locaties van unieke sequenties, worden de primersequenties opgenomen in het geschreven gedeelte van het protocol voor elk geïsoleerd DNA-monster. Zet twee PCR-reacties van 50 µL op in 0,2 mL dunwandige PCR-buisjes op ijs, waarbij elke primer-set wordt gebruikt volgens het geschreven protocol. Als de DNA-concentratie laag is, kan er meer DNA aan elke reactie worden toegevoegd, waarbij de hoeveelheid nucleasevrij dubbel gedestilleerd water wordt aangepast zodat het totale reactievolume 50 µL blijft.Gebruik niet meer dan 5 µL DNA of 10% van het totale volume per reactie, aangezien onzuiverheden in de DNA-monsters de PCR-reacties kunnen remmen. Om er zeker van te zijn dat alle PCR-reagentia correct werken, dient een positieve controle te worden ingericht. Gebruik voor de negatieve controle dezelfde set controleprimers als voor de positieve controle, maar gebruik dubbel gedestilleerd water in plaats van het geëxtraheerde DNA; op dit punt zijn er in totaal vier PCR-reacties per te testen monster. Voer vervolgens de PCR-amplificaties uit in een thermocycler met een verwarmde klep, gebruikmakend van de PCR-cyclusparameters in het geschreven protocol. Afhankelijk van de kwaliteit van het DNA, de primers, de Taq-polymerase of het type gebruikte thermocycler, kan optimalisatie van de annealingtemperatuur, de extensietijden en het aantal cycli noodzakelijk zijn.Zodra de PCR-reacties zijn voltooid, worden de PCR-producten gescheiden op een 1% gel met behulp van standaard elektroforese. Laat de monsters lopen bij ongeveer 120 volt totdat het DNA-front drie kwart van de totale lengte van de gel heeft bereikt. Visualiseer de gel onder UV-licht en inspecteer de resulterende banden om te controleren of een passend DNA-fragment is geamplificeerd.Deze representatieve gel toont de resultaten van elektforese van PCR-producten afgeleid van DNA-monsters van Kogan-gras, Japans bloedgras en Japans bloedgras-revert in combinatie met Kogan-gras- en JBG-specifieke primers, evenals de turn LF positieve controle en een negatieve controle zonder template. De primer-set van de turn LF positieve controle werkt even goed voor Kogan-gras, Japans bloedgras, Japans bloedgras-revert en andere grassen, en zal resulteren in een band van 890 basenparen. Als alle PCR-reagentia vrij zijn van DNA-contaminanten, zal de negatieve controle-reactie niet resulteren in een PCR-product.Indien het DNA-monster is afkomstig van wildtype kogan grass, zal een PCR-reactie met de primerset specifiek voor kogan grass resulteren in één enkele band van ongeveer 595 baseparen, terwijl de JBG-specifieke primers geen band zullen opleveren. Op dezelfde wijze zal, indien het DNA-monster is afkomstig van JBG of een gereverteerde J-B-G-A-P-C-R-reactie, het gebruik van de JBG-specifieke primerset resulteren in één enkele band van ongeveer 594 baseparen, terwijl de primerset specifiek voor kogan grass geen band zal opleveren.Omdat JBG en teruggevallen JBG een identieke nucleïnezuursequentie hebben, zullen zij derhalve identieke bandpatronen vertonen. De morfologische verschillen tussen JBG en JBG-revertenten zijn echter vrij duidelijk, waardoor de JBG-variëteiten op plantniveau gemakkelijk van elkaar te onderscheiden zijn, hoewel de PCR-resultaten hetzelfde zullen zijn. DNA-sequencing van de PCR-producten kan mogelijke veranderingen in de DNA-sequenties voor verschillende ecotypen van cogongrass identificeren.De ontwikkeling van deze techniek biedt de eerste vereenvoudigde moleculaire methode die accuraat onderscheid kan maken tussen het wildtype K-gras en de teruggevallen vorm van de sierteeltvariant Japans bloedgras. We moedigen gebruikers van dit protocol aan om contact met ons op te nemen om de resultaten te rapporteren die voortvloeien uit het gebruik van dit protocol. Dergelijke gedeelde informatie zal helpen bij het verschaffen van gegevens over de verspreiding van Japans bloedgras.Dit zal toezichthouders bij het USDA ook helpen om geïnformeerde beslissingen te nemen over maatregelen die mogelijk nodig zijn om de verspreiding en potentiële hybridisatie van de zeer invasieve variëteiten van Cogan-gras te voorkomen.

a-pcr-based-genotyping-method-to-distinguish-between-wild-type

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) is een doeltreffend instrument om mRNA niveaus te diagnosticeren in verschillende insecten weefsels en ontwikkelingsstadia. In dit rapport tonen we het gebruik van de qRT-PCR na te gaan mRNA niveaus in de verschillende weefsels en larvale ontwikkelingsstadia van de invasieve soorten insecten, smaragd as boor.

Analyse van genexpressie in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Met behulp van kwantitatieve Real Time-PCR

Beschrijven we een multiplex-PCR voor de snelle detectie van Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, en Typhimurium. Specifieke Salmonella serovars kunnen worden geïdentificeerd door zich te richten een multiplex PCR om genen en sequenties die uniek zijn voor het O-antigen biosynthese cluster en flagelline van een bepaalde serovar. Serovar wordt vervolgens toegewezen aan een Salmonella isoleren op basis van het optreden van de specifieke, grootte amplicons (PCR-product) die...

Een Allelotyping PCR voor het vaststellen van Salmonella enterica Serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, en Typhimurium

De Direct PCR hier gepresenteerde benadering vergemakkelijkt PCR-amplificatie rechtstreeks van kleine hoeveelheden ongezuiverd planten-en dierlijk weefsel.

Genotypering van plantaardige en dierlijke monsters zonder voorafgaande DNA-zuivering

Hier presenteren we een protocol voor het traceren van genomic DNA (gDNA) verontreiniging in RNA monsters. De onderhavige methode maakt gebruik van primers specifiek voor de interne getranscribeerde spacer regio (ITS) van ribosomal DNA (rDNA) genen. De methode is geschikt voor betrouwbare en gevoelige detectie van DNA besmetting in meeste prokaryoten en de eukaryoten.

Beoordeling van DNA besmetting in RNA Samples gebaseerd op Ribosomal DNA

In dit artikel presenteren we het protocol dat wordt beschreven als High-Resolution smelt analyse (HRM) gebaseerde doel geïnduceerde lokale laesies in Genomes (TILLING). Deze methode maakt gebruik van fluorescentie veranderingen tijdens het smelten van de DNA-duplex en is geschikt voor screening met hoge doorvoer van zowel inbrengen/deletie (Indel) als single base substition (SBS).

Identificeren van mutaties door een hoge resolutie smelting in een TILLING populatie van rijst

We presenteren een methodologie om de bestuivingsvereisten van abrikoos(Prunus armeniëca L.) cultivars vast te stellen die de bepaling van zelf-(in)compatibiliteit door fluorescentiemicroscopie combineren met de identificatie van het S-genotype door PCR-analyse.

Bepaling van zelf- en inter-(in)compatibiliteitsrelaties in abrikoos die handbestuiving, microscopie en genetische analyses combineren

Hier gepresenteerd is een protocol voor veldidentificatie van Matricaria chamomilla met behulp van een draagbaar qPCR-systeem. Dit eenvoudig uit te voeren protocol is ideaal als methode om de identiteit van een botanische soort te bevestigen op locaties waar de toegang tot laboratoriumapparatuur en expertise beperkt is, zoals boerderijen en magazijnen.

Veldidentificatie van Matricaria chamomilla met behulp van een draagbaar qPCR-systeem

Een methodologie voor de bepaling van bestuivingsvereisten in Japanse pruimentype hybriden wordt beschreven, die veld- en laboratoriumbestuivingen en waarnemingen van pollenbuizen onder de fluorescentiemicroscopie combineert met de identificatie van S-genotypen door PCR en de monitoring van de bloei voor de selectie van bestuiver.

Het vaststellen van bestuivingsvereisten in Japanse pruim door fenologische monitoring, handbestuivingen, fluorescentiemicroscopie en moleculaire genotypering

Dit protocol kan worden gebruikt om grootschalige ecologische onderzoeken uit te voeren van zelfrijdende Caenorhabditis-nematoden . Het belangrijkste voordeel van deze methode is de efficiënte organisatie en analyse van ecologische en moleculaire gegevens die verband houden met de nematoden die uit de natuur zijn verzameld.

Een zeer schaalbare aanpak om ecologische onderzoeken van zelfrijdende Caenorhabditis-nematoden uit te voeren

Dit protocol biedt een snelle methode voor het bepalen van stuifmeelcompatibiliteit en incompatibiliteit in citruscultivars.

Bepaling van zelf-(in)compatibiliteit en inter-(in)compatibiliteitsrelaties in citrusvruchten met behulp van handmatige bestuiving, microscopie en S-genotype-analyses

Leer een snelle PCR-gebaseerde genotyperingsmethode om wild-type en siergrassen van Imperata cylindrica te onderscheiden. Dit protocol helpt onderzoekers bij het identificeren van invasieve soorten.

Een PCR-gebaseerde genotyperingsmethode onderscheid te maken tussen wild-type en Sier Rassen van Imperata cylindrica

Meer video's verkennen