Name: RNAi Mediated Gene Knockdown en Transgenese door micro-injectie in de Necromenic Nematode Pristionchus pacificus /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Leer RNAi-geïnduceerde genknockdown en transgenese via micro-injectie in de necromene nematode Pristionchus pacificus. Deze methode maakt genetische manipulatie mogelijk voor evolutionaire en gedragsbiologische studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs zijn zeer dankbaar voor RJ Sommer en X Wang voor hulp bij micro-injectie, maar ook inzicht opmerkingen van de anonieme recensenten. Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidie ​​SC2GM089602.

1. Transgenese: DNA voorbereiding <ol><li> Dominante co-injectie marker: pRL3 [PPA-PRL-1 (tu92)] De pRL3 plasmide is een dominant co-injectie marker voor visueel identificeren van succesvolle transformatie evenementen. Dit plasmide codeert voor een dominant mutant allel (tu92) van de PPA-PRL-1-gen nauw verwant aan de SQT-1 collageen gen in C. elegans en transformeert het wildtype sinusoïdale beweging in de klok mee te draaien bewegingen langs het lichaam van de worm-as van 1,5. De getransformeerde dier is zeer vergelijkbaar met de populaire dominante selectiemerker rol-6 (su1006) gebruikt in C. elegans voor de afgelopen 20 jaar. </li><li> Doel verslaggever transgen: PPA-EGL-4p:: GFP Een gen van belang kan transcriptioneel of translationeel worden gekoppeld aan een GFP coderende sequentie 9. In deze studie, de PPA-EGL-4promoter:: GFP (EGL-4, cGMP afhankelijk proteïne kinase) is gebruikd om te bepalen of een 2 kb fragment stroomopwaarts van de start van de vertaling kan GFP expressie verlenen in P. pacificus PS312. Dit GFP vector bevat een GFP coderende gebied met gemodificeerde introns en de multifunctionele PPA-EVC-23 3 'UTR terminator 5 ter beschikking gesteld door Xiaoyue Wang en Ralf J. Sommer (Max-Planck Instituut, Tübingen, Duitsland, EU). </li><li> Genomic DNA: PS312 De toevoeging van wildtype P. pacificus PS312 genomisch DNA nodig is om stabiele transgene erfenis te krijgen, met name uit transgene F 1 dieren naar de F 2 nakomelingen 5. Het is nog niet zeker of het genomische DNA vormen complex extra chromosomale arrays met de twee transgenen (de co-injectie marker PRL-3 en de PPA-EGL-4p:: GFP reporter), vergelijkbaar met die waargenomen in stabiele F 2 transgene lijnen in C. elegans 3. Echter, om de eis hebben de genomische DNA en transgenen om identieke cohesi te delenve overhangen suggereert sterk de vorming van complexe extra-chromosomale arrays de gastheercellen kan herkennen voor de juiste DNA-transmissie (gDNA bereid met behulp van Sigma G1N10 kit). </li><li> DNA spijsvertering Restrictie-enzymen worden gebruikt om de PPA-EGL-4p lineariseren:: GFP vector DNA en kleverige overhangen compatibel is met de co-injectie marker pRL3 en PS312 gDNA te produceren. Meng door te tikken, niet vortexen. Incubeer gedurende een uur bij 37 ° C. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> pRL3 </td><td> 4 ug </td></tr><tr><td> 10xbuffer </td><td> 10 pi </td></tr><tr><td> PstI (10 U / pl) </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Totaal: </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> PPA-EGL-4p:: GFP </td><td> 4 ug </td></tr><tr><td> 10x buffer </td><td> 10 pi </td></tr><tr><td> Sali (10 U / pl) </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Totaal: </td><td> 100 pi </td></tr><tr><td> gDNA PS312 </td><td> 10 pg </td></tr><tr><td> 10x buffer </td><td> 10 pi </td></tr><tr><td> Pst I en Sal I (10 U / pl) </td><td> 8 ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Totaal: </td><td> 100 pi </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Mengsel voor het restrictie-enzym Digest. <ol start="5"><li> DNA neerslag en voorbereiding <ol><li> Voeg 01:10 natriumacetaat (3 M NaCOOCH 3 pH 5,2) en 2,5 maal het volume van 100% ethanol om de te verteren product, voeg 20 ng / ul van glycogeen om te zien pellet gemakkelijker te maken. </li><li> Centrifugeer bij 14.000 rpm gedurende 15 minuten bij 4 ° C. </li><li> Schenk de bovenstaande vloeistof door Tipping langzaam de centrifugebuis kop tikken en vervolgens op het op een tissue papier, zorg ervoor dat de pellet veilig is in de onderste hoek van de buis en vrij van ethanol. </li><li> Voeg 1 ml 75% ethanol. </li><li> Direct draaien op 14.000 rpm gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Schenk de bovenstaande vloeistof door langzaam kantelen van de centrifugebuis kop tikken en vervolgens op het op een tissue en zorg ervoor dat de pellet dat veilig in de onderste hoek van de buis en vrij van ethanol. </li><li> Droge pellet in vacuum centrifuge bij 14.000 rpm gedurende 5 minuten bij 25-30 ° C, tot het droog is en volledig vrij van ethanol. </li><li> Voeg 30 pi van TE of steriele dH 2 O en laat het een nacht bij 4 ° C voor het mengen van kort met een vortex. </li><li> In tabel 2 wordt beschreven hoe u de injectie mengsel te maken van elke gezuiverde DNA voor injectie. </li><li> Bewaren bij -20 ° C. Na het ontdooien het mengsel voor injectie, spin down de buis bij 14.000 rpm gedurende 5 minuten om vuil deeltjes die kunnen bevrijdenverstoppen de injectienaald. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Genetisch materiaal </td><td> Concentratie </td></tr><tr><td> PPA-EGL-4p:: GFP (Sali) </td><td> &gt; 5 ng / ul (0.1-10ng/μl) </td></tr><tr><td> pRL3 (PstI) </td><td> &gt; 1 ng / ul </td></tr><tr><td> gDNA PS312 (Pstl + Sali) </td><td> &gt; 60 ng / ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Totaal: </td><td> 30 pl </td></tr></tbody></table> Tabel 2. PPA-PRL-injectie een mengsel 2. RNA-interferentie: In vitro dubbelstrengs RNA-synthese <ol><li> Gebruik PCR voor het gen van belang te versterken. RHL091 5'-agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3 '(BamHI site) en RHL092 5'-tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3' (Pstl site) werden gebruikt om een ​​464 bp genomische frag versterkenment (stand 3-466) van de pRL3 vector die de PPA-PRL-1 (tu92) allel. </li><li> Digest het PCR-product met BamHI en Pstl. </li><li> Ligeren het fragment tot BamHI / Pstl verteerd pL4440 RNAi voeden vector 2. </li><li> Transformeren van de ingebrachte vector in competente cellen en groeien ze op Ampicilline LB media platen (50 ug / ml). </li><li> Selecteer het succes de ingebrachte vector door middel van PCR met behulp van de T7-primers. </li><li> Gebruik maken van de T7 geflankeerd PCR-product bevat de PRL-1-gen tot double-stranded RNA dsRNA te maken) met behulp van de BLOCK-IT RNAi synthese kit (Invitrogen). </li><li> De dsRNA concentratie is het beste als&gt; 200 ng / ul, tot 1 ug / ul voor injectie. </li><li> Bewaren bij -20 ° C. Na het ontdooien het mengsel voor injectie, spin down de buis bij 14.000 rpm gedurende 5 minuten om zich te ontdoen van vuil deeltjes die de injectienaald kunnen verstoppen. </li></ol> 3. Micro-injectie: Protocol voor injectie van transgenen en / of dsRNA <ol><li> Injectienaalden <ol><li> Stel de Narishige naald trekker (model #: PC-10) temperatuur: <ol><li> Draai onderste knop naar "No.2 Heater." </li><li> Draai de "nr. 2 Heater Adj." knop tot panel leest 55,0-60,0 ° C voor conische naald van verschillende lengtes. </li></ol></li><li> Draai de onderste knop naar "Stap 1" (Trekt naald in een stap). </li><li> Laad naald in de kamer en zorg ervoor dat het veilig is. </li><li> Druk op de "Start"-knop (rode knop) en laat de naald te worden getrokken met alle gewichten (dit moet twee identieke naalden in tegengestelde richting). </li><li> Verwijder de naald uit de kamer en op te slaan in een plastic cultuur plaat vastgezet op zijn plaats door Play-Doh te voorkomen dat stof zich ophoopt op de naalden. </li></ol></li><li> Montage Pads <ol><li> In een 1,5 ml centrifugebuis, maak een 2% Noble Agar-oplossing door het toevoegen van 0,02 g van Noble Agar aan 1 ml H 2 O. De agar kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal een jaar. </li><li> Meng goed ensmelten agar in een warmte-blok is ingesteld op&gt; 88 ° C. </li><li> Met behulp van een 1 ml micropipet, plaats een druppel vloeistof 2% Noble Agar-agar in het midden van de glazen dia (Fisher, 12-544-F). </li><li> Platter door het plaatsen van een ander glasplaatje op de top van de drop. </li><li> Herhaal "Drop Step" tot er een laag van vijf-glasplaatje. </li><li> Verwijder elk glaasje door met de glazen dia's van elkaar af. </li><li> Droge plat agar pad op glasplaatjes in een vacuüm oven op 70 ° C gedurende 4 uur tot 's nachts (of op kamertemperatuur' s nachts). </li><li> Maak meerdere Injectie pads en op te slaan voor toekomstig gebruik. </li></ol></li><li> Micro-injectie in de hermafrodiete geslachtsklieren </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Een schematische tekening van de P. pacificus anatomie. De heldere kern cellen zijn vrouwelijke geslachtscellen (eicellen) en de grijze gearceerde deel is de darm. Slechts een distale voorste gonade wordt getoondMaar let op de twee distale geslachtsklieren kruisen dorsaal elkaar in de buurt van midden van de body. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Beelden van micro-injectie. (A) De injectienaald tip in focus is met de uiterst rechtse lijn van de getrokken capillaire stuk. Door licht aanraken van de punt van de naald om die rand, moet de naald breken met behoud van een scherpe punt. (B) De naald voegt in de top gonaden net boven de darm kromming voor de eerste injectie. (C) De naald inserts in de bodem gonaden net onder de darm kromming voor de tweede injectie. <ol start="3"><li><ol><li> Zorg ervoor dat het contrast en de DIC afschuiving instelling is ideaal voor het bekijken van de hermafrodiet geslachtsklieren. </li><li> Belasting 1.0-2.0 pi injectie mengsel in de capillaire naald getrokken. </li><li> Plaats de naald in de micro-injectie manipulator, drukmeters van de stikstof tank moet worden ingesteld op ideale omstandigheden (10-20 psivoor 0,5 tot 1 sec). </li><li> Breek de naald door het aanraken van het iets aan de rand van een dun getrokken capillair geplaatst op een dia (figuur 2A). <ol><li> Naald breaker slide: het dunste deel van een getrokken capillair geplaatst op een glasplaatje in een druppel olie </li></ol></li><li> Zodra de naald is gebroken kan plaatsen bij een stationaire stand, terwijl je je worm kiezen om het pad (P. pacificus hebben een vijf minuten venster voor injectie voordat ze droog-out en sterven). </li><li> Behulp van een plaat vol met J4-jonge volwassen wormen, giet er genoeg paraffine-olie (zware) tot net onder de wormen in OP50 bacteriële gazon. </li><li> Kies een worm en plaats deze op de injectie pad. </li><li> Plaats de glazen dia met de worm op de microscoop, de positie van de worm gonaden in de richting van de naald en de vulva uit de buurt van de naald (afbeelding 2B, 2C). </li><li> Laat de naald in de positie van de microscoop te bekijken. </li><li> Plaats de top gonaden en de naald in hetzelfde focal plane (figuur 2B).</li><li> Voorzichtig porren de worm en de pomp in de injectie mengsel; ooctyes scheiden van de richting van de distale tip duiden op een succesvolle injectie (om transgene of dsRNA levering optimaliseren, ziet u na de injectie een golf van expansie in de gonaden, dat gaat door totdat het is dicht bij de distale tip). </li><li> Plaats de naald te injecteren om de lagere gonaden en herhaal de injectie, maar aangezien dit gonaden onder de darm van de verspreiding van de eicellen niet zal worden gezien en is dus moeilijker te bereiken (figuur 2C). </li><li> Normaal uitziende worm wijst op een succesvolle injectie na de injectie, er mag niet worden beschadigde geslachtsklieren (steekt uit de vulva of dook in het lichaam holte). </li><li> Plaats de naald terug in de ruststand staat. </li><li> Bereid u voor om de worm te redden. </li><li> Voeg een druppel (0,5 pi) van de M9 buffer op het pad waar het ingespoten worm wordt geplaatst. </li><li> Met behulp van enkele OP50 bacteriën op uw keuze, raakt u de worm met de OP50, en het moet plakken. We geen gebruik maken van mond pipet. </li><li> Plaats de worm op plaat bezaaid met 50 ul vlekken van OP50, kan 2-4 wormen worden gered op dergelijke platen. </li></ol></li><li> Post-injectie Storage &amp; Screening voor Transgenese <ol><li> Store geïnjecteerd wormen (P 0) bij 20 ° C ~ 4 dagen om eieren te leggen en opgroeien F 1. </li><li> Scherm wormen op de vierde dag voor geselecteerde fenotype (Om te screenen op transgenese, zoeken voor het rollen dieren de uiting van de PPA-PRL-1 dominant marker). </li><li> Kies een onafhankelijke F 1 's dieren met de waargenomen fenotype om nieuwe zaadjes plaat en bewaren bij 25 ° C; deze temperatuur bevordert de vorming van stabiele lijnen uit F 1' s. </li><li> Single F 2 van onafhankelijke F 1 lijnen. Individuele F 2 lijnen hebben soortgelijke transgen transmissie tarieven. We krijgen vaak&gt; 15 F 2 regels per getransformeerd F een dier. </li><li> Bewaar de volgende generaties bij 25 ° C. </li><li> De overdrachtssnelheid van rollen blijft gewoonlijk constant, na de F 4 generatie, dus is het noodzakelijk op dit moment om de expressie niveau van de doelgroep transgen (PPA-EGL-4p:: GFP) te bepalen voor elke individuele lijn. GFP expressie kan niet correleren met de mate van penetrantie van de dominante rol fenotype. </li></ol></li><li> Post-injectie Storage &amp; Screening voor RNAi fenotypes <ol><li> Store geïnjecteerd wormen (P 0) bij 20 ° C ~ 4 dagen vast te leggen en te groeien F 1. </li><li> Screen F 1 wormen op de vierde dag voor geselecteerde fenotype (Om te screenen op RNAi knockdown fenotype, zoeken naar penetrant fenotypes die kunnen worden geassocieerd met verlies van de target-gen-activiteit, in ons geval het verlies van de PPA-PRL-1 fenotype). </li><li> In onze ervaring, is de niet-roller knockdown fenotype verloren in&gt; 97% van de F 2. </li></ol></li></ol> 4. Representatieve resultaten: p "&gt; 1. Resultaat van Transgenese <table border="1"><tbody><tr><td> Sessie </td><td> Ingespoten P 0 </td><td> F 1 Rollers </td><td> % Transgene F 2 </td><td> Gemiddeld% transmissie na F 2 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 2 </td><td> (Lijn 1) 0% (Lijn 2) 13% </td><td> NA 13% ± 10 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 40 </td><td> 1 * </td><td> (Lijn 3) 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> (Lijn 4) 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> (Lijn 5) 26% </td><td> 22% ± 10 </td></tr></tbody></table>content "&gt; * een mannelijke rol die niet kruisen; NVT: Niet van toepassing . Tabel 3 Resultaten van de ingespoten PS312 met PPA-EGL-4p:: GFP (Sal I verteerd), pRL3 (roller) (Pst I verteerd), en gDNA PS312 (PstI en Sali verteerd). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3 (A) wildtype (B, C) ​​Een stabiele F 4 pRL3; PPA-EGL-4p:.: GFP transgene lijn met het hoofd neuron GFP expressie. 2. Resultaat van RNA-interferentie <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. RNA geïnjecteerd PRL-1 mutanten vertonen volledige knock-down van de "rollen" motoriek. (A) PRL-1 roller gain-of-function mutant tu92. (B) "knock-down" PRL-1 mutant vertonen normale wildtype houding en beweging. (C) geïnjecteerd PRL-1 (onder) heeft ook langere bODY dan PRL-1 mutant (boven). (D) De langere lichaam van ingespoten PRL-1 (onderaan) is ook langer dan de wild-type PS312 (boven). Hoe langer het lichaam fenotype werd ook waargenomen in de rol-5 (SQT-1) RNAi knock-down van C. elegans N2 (gegevens niet getoond). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> rollen </td><td> niet-roll </td></tr><tr><td> A PRL-1 dsRNA (200 ng / ul) </td><td> 13 </td><td> 21 </td></tr><tr><td> B PRL-1 dsRNA (1000 ng / ul) </td><td> 9 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> controle </td><td> 20 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tabel 4. Samenvatting van de PPA-PRL-1 dsRNA injecties. (A) [dsRNA] = 200 ng / ul; (B) [dsRNA] = 1000 ng / ul. P = 0.0019 en 0.041 door Exact Test Fisher's, tweezijdig, voor de 200 en 1000 ng / ul injecties, respectievelijk.

<ol><li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhringer%2C+J+%22Wormbook%22">Wormbook</a>. , (2006).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strongyloides+stercoralis%3A+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3%27+UTR%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li>
<li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li>
<li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pristionchus+pacificus%3A+a+well-rounded+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li>
<li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li>
<li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution%3A+development%2C+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Worm+Lab%3A+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li>
<li>Evans, T. C. Transformation and Microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvans%2C+TC+%22Wormbook%22">Wormbook</a>. , (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

P. pacificus populaties zijn te vinden in nauwe samenwerking met verschillende scarabee soorten wereldwijd en is een model nematode intermediair tussen de vrij levende en parasitaire nematoden. De kracht van de P. pacificus als een opkomende modelorganisme lag in de integratie van de genetische en fysische kaarten die positionele in kaart brengen van mutanten geïsoleerd van onpartijdige vooruit genetische screens te bevorderen (dus niet alleen voor de kandidaat-genen die eerder gekenmerkt in <...

<table border="1"><tbody><tr><th> Product: </th><th> Catalog #: </th><th> Leverancier: </th></tr><tr><td> DMI3000 Injectie microscoop </td><td> DMI3000 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Microinjector manipulator (directe aandrijving) </td><td> Narashige BC-3 Ball joint </td><td> TriTech Onderzoek </td></tr><tr><td> Naald Puller </td><td> Narashige PC-10 </td><td> TriTech Onderzoek </td></tr><tr><td> MicroInjector ™ All-Digital Multi-druk-systeem </td><td> Narashige MINJ-D </td><td> TriTech Onderzoek </td></tr><tr><td> GeneElute ™ zoogdieren Genomic DNA Miniprep Kit </td><td> G1N70 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> pJet Klonen Jet kit </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET plasmide Miniprep kit </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> DNA Clean &amp; Concentrator ™ </td><td> D4005 </td><td> ZYMO Onderzoek </td></tr><tr><td> BLOCK-IT ™ RNAi TOPO ® transcriptie kit </td><td> K3500-01 &amp; K3650-01 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Difco ™ Agar Noble </td><td> DF0142-15-2 </td><td> Fisher wetenschappe </td></tr><tr><td> Microscoop dekking van glas (1,5 - 0,16 tot 0.19mm dik, formaat: 50 x 45mm) </td><td> 12 tot 554-F </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Glazen capillairen (filament) </td><td> 615000 </td><td> AM-systemen </td></tr><tr><td> Paraffine-olie (Zwaar) </td><td> O122-1 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> AC20651-5000 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> M80-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr></tbody></table>

rnai mediated gene knockdown en transgenese door micro-injectie in de necromenic nematode pristionchus pacificus</em

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Hoewel het meer en meer betaalbaar voor de opkomende modelorganismen volledig gesequenced genoom te verkrijgen, verdere diepgaande genfunctie en expressie analyses van RNA-interferentie en stabiele transgenese blijven beperkt in vele soorten te wijten aan de bijzondere anatomie en moleculaire cellulaire biologie van het organisme. Zo hebben buiten de kroon groep Caenorhabditis Caenorhabditis elegans, dat 3, stabiel overgedragen transgene lijnen in niet-Caenorhabditis soort omvat niet gemeld in dit misleidende phylum (Nematoda), met uitzondering van de Strongyloides stercoralis 4 en Pristionchus pacificus 5. Ter vergemakkelijking van de groeiende rol van P. pacificus in de studie van de ontwikkeling, evolutie en gedrag 6-7, beschrijven we hier de huidige methoden om micro-injectie te gebruiken voor het maken van transgene dieren en gen die door RNAi kloppen. Net als de geslachtsklieren van <em&gt; C. elegans en de meeste andere nematoden, de gonaden van P. pacificus is syncitial en in staat van het opnemen van DNA en RNA in de eicellen bij aflevering door directe micro-injectie. In tegenstelling tot C. elegans echter, stabiele transgene erfenis en somatische uitdrukking in P. pacificus vereist de toevoeging van zelf genomisch DNA gedigereerd met endonucleasen complementair zijn aan de uiteinden van target transgenen en coinjection markers 5. De toevoeging van drager genomisch DNA is gelijk aan de eis voor transgenexpressie in Strongyloides stercoralis 4 en in de geslachtscellen van C. elegans. Het is echter niet duidelijk of de specifieke vereisten van de dieren &#39;eigen genoom DNA is, omdat P. pacificus soma is zeer efficiënt bij zwijgen niet-complexe multi-copy genen of die extrachromosomaal arrays in P. pacificus nodig genomische sequenties voor de goede kinetochoor de montage tijdens de mitose. De ventrale migratie van de twee-armige (didelphic) gonaden in hermafrodieten bemoeilijkt verder de mogelijkheid om zowel gonaden injecteren in de individuele wormen 8. We tonen ook aan het gebruik van micro-injectie om knockdown een dominante mutant (roller, tu92), door het injecteren van double-stranded RNA (dsRNA) in de geslachtsklieren om niet-rolling F 1 nakomelingen te verkrijgen. In tegenstelling tot C. elegans, maar zoals de meeste andere nematoden, P. pacificus PS312 is niet ontvankelijk voor systemische RNAi via voeding en het weken en daarom dsRNA moet worden toegediend door micro-injectie in de syncitial geslachtsklieren. In deze huidige studie, hopen we de micro-injectie proces nodig is om een PPA-EGL-4 promotor te transformeren beschrijven:: GFP fusie verslaggever en knockdown een dominante rol PRL-1 (tu92) mutant in een visueel informatieve protocol.

In model organismen, kan transgenese manipuleren genfuncties terwijl RNAi kan knockdown specifieke mRNA-transcripten 1-2. Dit protocol heeft tot doel illustratie van de technieken die nodig zijn om stabiel overgedragen DNA en van voorbijgaande aard dubbelstrengs RNA te brengen in de necromenic nematode<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt; Voor studies in de evolutionaire, ontwikkelings-en gedragsbiologie.

RNAi Mediated Gene Knockdown en Transgenese door micro-injectie in de Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em

Hoewel het voor opkomende modelorganismen steeds betaalbaarder wordt om volledig gesequenced genomen te verkrijgen, zijn verdere diepgaande studies naar genfunctie en -expressie ...

Het algemene doel van deze procedure is om succesvol vreemd DNA te transformeren en de genfunctie in Priyanka Pacificus-nematoden te onderdrukken. Voor transgenese: begin met het prepareren van het juiste genomische DNA met compatibele cohesieve uiteinden.Voor RNA-interferentie wordt het gen van belang gesynthetiseerd met behulp van een kit voor transcriptie van dubbelstrengs RNA. Micro-injecteer vervolgens de PRIs van DIANCA pacificus met het DNA of het dubbelstrengs RNA. Screen de F1-populatie op het geselecteerde markerfenotype bij transgenese en selecteer op het knockdown-fenotype bij RNA-interferentie voor transgenese.Blijf de resultaten van de F2 transgene wormen monitoren om resultaten te verkrijgen die specifieke genexpressies laten zien met behulp van een GFP-reporter via fluorescentiemicroscopie. Hallo, ik ben Ray Hong van de California State University of Northridge, en in deze demonstratie worden de stappen voor genetische manipulatie in specifieke nematoden beschreven. In een opkomend modelorganisme kunnen RNAi en transgenesis cruciale vragen in de ontwikkelingsbiologie en het gedrag beantwoorden door genfuncties en -expressies te karakteriseren.Personen die nieuw zijn

rnai-mediated-gene-knockdown-transgenesis-microinjection-necromenic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video beschrijft micro-injection, een veelgebruikte methode om transgene C. elegans stammen te creëren.  In het voorbeeld zien we micro-injection gebruikt om een ribonucleoproteïne (RNP) complex voor CRISPR-bases genbewerking te introduceren.

Gonad Microinjection: Een methode van samengestelde levering direct in de kiembaan van C. elegans

De mediterrane fruitvlieg (Ceratitis capitata) (Diptera: Tephritidae) is een wereldwijde plaag in de landbouw. Een dieper begrip van zijn biologie is cruciaal voor het beheersen van fruitvliegpopulaties en daarmee het verminderen van de economische impact. Micro-injectie van embryo's is een fundamenteel hulpmiddel dat zowel transformatie van de kiemlijn als reverse genetica studies in deze soort mogelijk maakt.

Levering van nucleïnezuren door middel van Embryo micro-injectie in de Worldwide Landbouw Pest Insect,<em&gt; Middellandse-Zeevlieg</em

Hier presenteren we protocollen voor het kweken van een intermediair-kiem kever, Dermestes maculatus (D. maculatus) in het lab. We hebben ook protocollen voor de embryonale en ouderlijke RNAi en methodes te delen voor het analyseren van embryonale fenotypes voor bestudering van genfunctie in deze soort.

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever, Dermestes maculatus

Microinjection van Nasonia vitripennis embryo's is een essentiële methode voor het genereren van de wijzigingen van het erfelijk genoom. Hier beschreven is een gedetailleerde procedure voor microinjection en transplanteren van Nasonia vitripennis embryo's, die toekomstige genoom manipulatie in dit organisme aanzienlijk zal vergemakkelijken.

Embryo Microinjection en transplantatie techniek voor Nasonia vitripennis genoom manipulatie

Hier presenteren we protocollen voor het verzamelen en microinjecting precellular westelijke maïs rootworm embryo's bestemd voor de uitoefening van functionele-genomic assays zoals germline transformatie en CRISPR/Cas9-genoom bewerken.

Microinjection van Western maïswortelboorder, Diabrotica virgifera virgifera, embryo's voor Germline transformatie of CRISPR/Cas9 genoom bewerking

RNA interferentie is een breed toepasbare, krachtige techniek voor het manipuleren van genexpressie in specifieke ontwikkelingsstadia. Hier beschrijven we de noodzakelijke stappen voor de implementatie van deze techniek in de aquatische duikkever Thermonectus marmoratus, van de verwerving van gensequenties tot het knockdownen van genen die de structuur of het gedrag beïnvloeden.

RNA Interferentie in aquatische kevers als een krachtig instrument voor het manipuleren van genexpressie op specifieke ontwikkelingstijdpunten

Hier beschrijven we methoden voor efficiënte pop- en volwassen injecties in Nasonia vitripennis als toegankelijke alternatieven voor embryomicro-injectie, waardoor functionele analyse van genen van belang mogelijk is met behulp van RNA-silencing via RNA-interferentie (RNAi) of gen knock-out via CRISPR / Cas9 genoombewerking.

Pupal en volwassen injecties voor RNAi en CRISPR Gen editing in Nasonia vitripennis

Hier introduceren we een gedetailleerde soaking-methode van RNA-interferentie in Bursaphelenchus xylophilus om de studie van genfuncties te vergemakkelijken.

Toepassing van RNA-interferentie in de dennenaaltjes, Bursaphelenchus xylophilus

Entomopathogene nematoden leven in symbiose met bacteriën en samen infecteren ze met succes insecten door hun aangeboren immuunsysteem te ondermijnen. Om onderzoek naar de genetische basis van nematodeninfectie te bevorderen, worden methoden beschreven voor het handhaven en genetisch manipuleren van entomopathogene nematoden.

Kweken en genetisch manipuleren van entomopathogene nematoden

Dit artikel demonstreert CRISPR-Cas9-gemedieerde genoomengineering in Steinernema hermaphroditum, een entomopathogene (EPN: insect-parasitaire) nematode en een opkomend genetisch model. De beschreven technologie is nuttig voor het creëren van mutanten, waardoor genfuncties in de nematodebiologie kunnen worden opgehelderd die relevant zijn voor mutualistische en parasitaire symbiose.

CRISPR-Cas9-gebaseerde mutagenese in de entomopathogene nematode Steinernema hermaphroditum en het onderhoud van mutante lijnen

Leer RNAi-geïnduceerde genknockdown en transgenese via micro-injectie in de necromene nematode Pristionchus pacificus. Deze methode maakt genetische manipulatie mogelijk voor evolutionaire en gedragsbiologische studies.

RNAi Mediated Gene Knockdown en Transgenese door micro-injectie in de Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Meer video's verkennen