RNAi Mediated Gene Knockdown en Transgenese door micro-injectie in de Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Het algemene doel van deze procedure is om succesvol vreemd DNA te transformeren en de genfunctie in Priyanka Pacificus-nematoden te onderdrukken. Voor transgenese: begin met het prepareren van het juiste genomische DNA met compatibele cohesieve uiteinden.

Voor RNA-interferentie wordt het gen van belang gesynthetiseerd met behulp van een kit voor transcriptie van dubbelstrengs RNA. Micro-injecteer vervolgens de PRIs van DIANCA pacificus met het DNA of het dubbelstrengs RNA. Screen de F1-populatie op het geselecteerde markerfenotype bij transgenese en selecteer op het knockdown-fenotype bij RNA-interferentie voor transgenese.

Blijf de resultaten van de F2 transgene wormen monitoren om resultaten te verkrijgen die specifieke genexpressies laten zien met behulp van een GFP-reporter via fluorescentiemicroscopie. Hallo, ik ben Ray Hong van de California State University of Northridge, en in deze demonstratie worden de stappen voor genetische manipulatie in specifieke nematoden beschreven. In een opkomend modelorganisme kunnen RNAi en transgenesis cruciale vragen in de ontwikkelingsbiologie en het gedrag beantwoorden door genfuncties en -expressies te karakteriseren.

Personen die nieuw zijn met deze methode zullen baat hebben bij het bekijken van hoe de worm op het injectieplatform wordt geplaatst en hoe de worm wordt geïnjecteerd op het juiste brandvlak waar de gonaden zichtbaar zijn. In tegenstelling tot andere soorten zijn de gonaden van C. elegans specifiek, aangezien deze elkaar dorsaal kruisen en uiteindelijk migreren terwijl de nematode zich ontwikkelt van de late J4-fase naar volwassen wormen. Daarnaast moet genomisch DNA, gedigesteerd met compatibele restrictie-enzymen, worden toegevoegd aan uw transgenen en co-injectiemarker om uw injectiemengsel samen te stellen.

In dit laboratoriumexperiment zal Jessica een micro-injectie demonstreren in het geval van PRI's, specifiek voor transgenese. Voor de injectie zijn 3D NA-constructen vereist, samen met de dominante co-injectiemarker. Het doelrapporteur-transgen en de genomische D-N-A-D-N-A-constructen worden gedigesteerd met compatibele restrictie-enzymen. De DNA-constructen worden verzameld met behulp van een ethanolprecipitatieprotocol.

Het injectiemengsel wordt bereid volgens de in de tabel vermelde concentraties. Controleer de instellingen van de manometer van de stikstoftank. Laad nu één tot twee µL van het injectiemengsel in de naald.

Plaats de naald in de micro-injectiemanipulator. Breek de naaldpunt door deze lichtjes tegen de rand van een dungetrokken capillaire buis op een objectglas te tikken en plaats de naald vervolgens in een rustpositie. Giet nu paraffine-olie over de plaat met vier jonge volwassen wormen.

Selecteer één worm en breng deze over naar een injectiepad. Positioneer onder de microscoop de gonade van de worm in de richting van de naald, waarbij de vulva van de naald af is gericht. Breng de naald nu naar de positie die in het microscoopbeeld zichtbaar is.

Breng de bovenste gonade en de naald in hetzelfde brandvlak. Prik voorzichtig in de worm en pomp het injectiemengsel naar binnen. Let op dat de eieren zich naar de distale punt verplaatsen, wat duidt op een succesvolle injectie.

Positioneer de naald opnieuw om de onderste gonade te injecteren en herhaal de injectie. Aangezien deze gonade zich onder het darmkanaal bevindt, zal de verspreiding van de eitjes niet zichtbaar zijn, waardoor het moeilijker is om het succes van de injectie te beoordelen. Na de injectie moet de worm echter intact blijven zonder uitstulpende gonaden.

Plaats de naald terug in de rustpositie. Voeg een druppel M9-buffer toe om de worm te redden met behulp van enkele OP 50-bacteriën op een pick. Raak de worm aan met de OP 50 zodat deze aanhecht.

Breng de worm nu over naar een plaat met druppels van 50 µL OP 50. Bewaar de geïnjecteerde wormen gedurende ongeveer vier dagen bij 20 °C zodat ze eieren kunnen leggen en de F1-generatie kan groeien. Screen de wormen vervolgens op het geselecteerde fenotype.

Select individuele F1-individuen met het waargenomen fenotype, breng deze over naar een nieuw gezaaide plaat en bewaar deze bij 25 °C. Breng ten slotte, voor transgene lijnen, individuele F2-individuen over naar afzonderlijke platen. Bewaar volgende generaties bij 20 °C.

De manipulatie van genfuncties op organismisch niveau via RNAi en transgenese zijn kernaspecten van het Ppac pacificus-model voor evolutionaire ontwikkelingsbiologie; in vergelijking met een wild-type worm links, resulteert de stabiele F4 PPR L3-transgene lijn in een dominante roller die GFP-expressie in de neuronen van de kop vertoont. Omgekeerd genereert dit RNAi-experiment PRL1-mutanten die een volledige knockdown vertonen van de rollende locomotie die gewoonlijk wordt waargenomen in de PRL1-roller gain-of-function mutant TU 92. Zodra de techniek onder de knie is, kan elke injectie in vijf minuten worden voltooid. Het is belangrijk om te onthouden dat alle F2's van onafhankelijke F1-transgene roll-lijnen individueel gepickt moeten worden om onafhankelijke F2-promi vast te stellen.

Dit komt omdat we vaststelden dat de GFP-expressie zeer variabel was tussen de F₂-lijnen en dat de overdracht van het roller-fenotype niet correleert met het expressieniveau van G.