Optische kaart brengen van actiepotentialen en Calcium Transiënten in de muis Hart
13 september 2011
Dit document beschrijft de dissectie procedure, instrumentale setup, en de experimentele omstandigheden tijdens de optische in kaart brengen van de transmembraan potentiaal (Vm) en intracellulair calcium van voorbijgaande aard (CAT) in intacte geïsoleerde Langendorff doorbloed muis harten.
Het algemene doel van deze procedure is om tegelijkertijd het transmembraanpotentieel en de intracellulaire calciumtransitie in intacte geïsoleerde LOR-geperfuseerde muizenharten optisch in kaart te brengen. Dit wordt bereikt door eerst het intacte muizenhart te verwijderen, vervolgens de aorta te canuleren en de LOR-perfusie te beginnen. De volgende stap is om het hart te immobiliseren door een excitatie-contractiekoppeling te laden en vervolgens het hart aan de perfusiekamer te bevestigen.
De laatste stappen zijn het laden van de optische kleurstoffen en het maken van voorbereidingen om bewegingsartefacten tijdens het experiment te verminderen. Optische beelden worden verkregen door het licht dat van het hart wordt uitgezonden te verzamelen met mijn cam Ultima LC Moss camera's. Hey, ik ben di.
Ik ben een afgestudeerde student aan de Washington University. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals micro-elektrode, is dat optisch in kaart brengen een grotere ruimtelijke resolutie mogelijk maakt over het hele oppervlak van het hart. Hallo, ik ben Matt Sulkin.
Ik ben een afgestudeerde student aan de Washington University. Deze methode, indien correct uitgevoerd, kan helpen om veel vragen in de cardiale elektrofysiologie te beantwoorden, zoals de basis van aritmogenez. Begin met het configureren van een peristaltiekpomp om de oplossingen te laten circuleren met 40 milliliter per minuut.
Stel vervolgens een tweede peristaltiekpomp in op 80 milliliter per minuut. Deze pomp brengt de Perfuse acht terug naar het houd- en zuurstofvoorraadreservoir. Zet de pompen aan en spoel het systeem met één liter, 70%ethanol gedurende 30 minuten met recirkulatie.
Volg deze wassing met twee liter gedeïoniseerd water zonder recirkulatie. Zodra het water is leeggepompt, circuleer twee liter Tyro-oplossing en laat het door een vijf micron filter gaan. Verwarm de Perfuse acht tot 37 graden Celsius met een watermantel en circulator en blaas zuurstofverzadigd gas in de oplossing.
Pas de snelheid van het gasbellen aan om de pH op 7,35 plus of min 0,05 te houden. Monitor zowel de pH als de temperatuur tijdens het experiment. Het dubbele optische in kaart brengingsapparaat bestaat uit twee hogesnelheids C moss camera's die een 100 bij 100 pixel beeld kunnen vastleggen met 3000 frames per seconde.
Bevestig een bandpassfilter aan de calciumbeeldvormingscamera en bevestig een langpassfilter aan de spanningsbeeldvormingscamera op een dubbele camerahouder. Bevestig een diic spiegel en lens zodat het emissielicht dat vanuit het hart komt, door de lens op de spiegel wordt gefocusseerd. Bevestig ook twee camera's aan de houder en schik ze zo dat ze loodrecht op elkaar staan.
Stel vervolgens het excitatielicht in. Het licht wordt gegenereerd door een halogeenlamp en wordt via een flexibele lichtgeleider geleid. Laat het licht door een hittefilter, een sluiter om de blootstelling te beperken en een excitatie bandpassfilter gaan.
Bereid ten slotte zilver en zilverchloride-elektroden voor door ze in de kamer te installeren. Na het controleren en aanpassen van de niveaus op de versterkers en filters, is de opstelling klaar voor een hart. Gebruik een cocktail van ketamine en xylazine met 100 eenheden heparine om een muis te anesthetiseren voordat u verder gaat.
Zorg ervoor dat het dier geen pijnreflex heeft door een teenprik te gebruiken. Na het maken van een middenborstasnede, verwijder snel het hart en het omliggende weefsel. Gebruik vervolgens een dissectiemicroscoop om snel de aorta te identificeren en maak een schone snede over de stijgende aorta onder de rechter subclavia-arterie.
Bevestig nu een korte sectie aorta aan een op maat gemaakte 21 gauge canule met behulp van vier zwarte gevlochten zijden hechtdraad. Na canuleringsretro grotelijks perfu en super fuse het hart. Met Tyro-oplossing, pas de stroomsnelheid aan om de aortadruk tussen 60 en 80 millimeter te houden. Kwik gemeten door een druktransducer.
Dissecteer en verwijder nu het omliggende long-, thymus- en vetweefsel. Breng nu een siliconenbuis in het linker ventrikel in via de longaderen. Naai de buis aan het nabijgelegen bindweefsel.
Deze zeer belangrijke stap voorkomt congestie en acidificatie van Perfuse acht die in het linker ventrikel vastzit, vooral na de onderdrukking van ventrikelcontracties. Om Perfuse acht-geïnduceerde hartbewegingen te voorkomen, bevestig het hart aan de onderkant van de sill guard gecoate perfusiekamer op zijn apex. Strek en bevestig bovendien de rechter en linker atriumoord op om het oppervlak van de atria in de rechtopstaande configuratie te vergroten.
Dit zal het opnameoppervlak maximaliseren. Om de pacing-stimulatie uit te voeren, bevestig een op maat gemaakte elektrode aan het oppervlak van het hart. Om bewegingsartefacten te verminderen, bevestig een kleine dekglas over het hart op het oplossingsoppervlak.
Doe dit door het glas tussen verschillende pinnen te klemmen. Als laatste voorbereidingen, focus het excitatielicht op het hart en positioneer de camera's om een optisch beeld te krijgen en begin dan met het laden van de kleurstof terwijl de kleurstof wordt geladen. Controleer continu ECG-opnames om de normale elektrische functie van het hart te garanderen.
Begin met het opwarmen van BLEs statin tot kamertemperatuur. Meng vervolgens een halve milliliter BLEs statin in de profuse acht in het houdreservoir en verdun de resterende een tiende milliliter BLEs statin in één milliliter Tyros-oplossing. Injecteer gedurende de volgende 20 minuten langzaam de BLEs statin in tyros via een drugspoort nabij de canule.
De BLEs statin zal geleidelijk het bewegingsartefact verminderen. Verdun vervolgens 30 microliters spanningsgevoelige kleurstof in één milliliter tyr oplossing en injecteer deze mix gedurende vijf tot zeven minuten langzaam via dezelfde drugspoort. Maak vervolgens dezelfde mix opnieuw.
Voeg deze keer een extra 30 microliters calciumindicator toe. Breng deze mix gedurende vijf tot tien minuten langzaam aan via dezelfde poort. Nadat de calciumindicator is
Overzicht
Deze studie presenteert een gedetailleerde procedure voor optische mapping van transmembraanpotentiaal en intracellulaire calciumtransits in geïsoleerde Langendorff-geperfuseerde muizenharten. De methode verbetert de ruimtelijke resolutie in vergelijking met traditionele technieken en biedt inzichten in de cardiale elektrofysiologie.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Cardiale Elektrofysiologie
- Optische Mapping Technieken
- Muizenhartmodellen
Achtergrond
- Optische mapping maakt gelijktijdige meting van Vm en CaT mogelijk.
- Traditionele methoden zoals micro-elektroden hebben beperkingen in ruimtelijke resolutie.
- Deze techniek kan helpen bij het onderzoeken van aritmogeneze.
- Langendorff-perfusie handhaaft de levensvatbaarheid van het hart voor experimenten.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode voor optische mapping in muizenharten te ontwikkelen.
- Om het begrip van cardiale elektrische activiteit te verbeteren.
- Om onderzoek naar de mechanismen van aritmieën te vergemakkelijken.
Gebruikte Methoden
- Excisie en canuleringen van het muizenhart voor perfusie.
- Gebruik van hogesnelheidscamera's voor het vastleggen van optische beelden.
- Het laden van optische kleurstoffen om transmembraanpotentiaal en calciumtransits te visualiseren.
- Monitoring van pH en temperatuur tijdens het experiment.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle optische mapping van Vm en CaT in het geïsoleerde hart.
- Gedemonstreerd verminderde bewegingsartefacten met kleurstoftoepassing.
- Actiepotentialen en calciumtransitsignalen effectief geregistreerd.
- De methode gevalideerd voor toekomstige elektrofysiologische studies.
Conclusies
- De optische mappingtechniek biedt hoge ruimtelijke resolutie.
- Deze methode kan onderzoek in cardiale elektrofysiologie bevorderen.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek gebruiken om aritmogeneze te onderzoeken.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Optical mapping of transmembrane potential and calcium transients in mouse hearts provides high-resolution spatial and temporal data critical for mechanistic de-risking in cardiovascular target validation. This approach enables quantitative assessment of electrophysiological phenotypes, supporting predictive confidence in preclinical models of arrhythmia and heart failure. By capturing concurrent Vm and CaT dynamics, the method bridges discovery biology with translational biomarker alignment in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping action potential and calcium transient dynamics across cardiac tissue.
- Operational Value: Supports biological de-risking through simultaneous visualization of excitation-contraction coupling parameters.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking molecular perturbations to functional electrophysiological outputs.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation via standardized optical signal acquisition.
- Quantitative Outputs: Generates reproducible measurements of action potential duration, conduction velocity, and calcium transient amplitude.
- Scalability: Facilitates platform reuse across multiple cardiac disease models through consistent Langendorff perfusion and dye loading protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to studies of heart failure, arrhythmias, and metabolic disease using genetically engineered mouse models.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical validation through preserved tissue architecture and physiological perfusion.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying electrophysiological liability early in the discovery pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical efficacy assessment, enabling iterative refinement of cardiovascular candidates based on functional electrophysiological readouts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking by correlating genetic or pharmacological interventions with spatial electrophysiological patterns.
- Screening: Delivers assay standardization and quantitative outputs essential for reliable compound screening in ion channel and modulator discovery.
- Analytics: Provides spatiotemporal measurements of Vm and CaT that enable comparative analysis across experimental conditions and genotypes.
- Translational Research: Maintains physiological relevance through Langendorff perfusion, supporting extrapolation to intact organ responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological phenotyping capability applicable across multiple cardiovascular projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cardiac electrophysiology.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined perfusion, dye loading, and imaging parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying electrophysiological liabilities prior to significant investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on quantitative action potential and calcium transient profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac dissection, Langendorff perfusion, and optical imaging systems.
- Dependent on high-speed CMOS cameras, excitation light sources, and optical filter sets for dual-channel detection.
- Necessitates cross-team standardization of dye loading protocols and motion artifact reduction strategies.
- Involves adaptation considerations when translating to different mouse strains or disease models with altered cardiac physiology.
- Includes practical limitations such as dye toxicity, photobleaching, and the need for meticulous motion suppression to maintain data quality.
