Name: Optische kaart brengen van actiepotentialen en Calcium Transiënten in de muis Hart (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Leer optische mapping van actiepotentialen en calciumtransiënten in geïsoleerde muizenharten. Deze methode biedt hogere ruimtelijke resolutie dan traditionele technieken voor cardiale elektrofysiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

NIH subsidie ​​R01 HL085369.

1. Geavanceerde bereiding van de stam oplossingen <ol><li> Bereid twee voorraad oplossingen van de oplossing Tyrode's (16x), van te voren in gedeïoniseerd water en ze op te slaan 4 ° C: <ol class="lalpha"><li> Stock I (119,872 g / L NaCl, 3,056 g / L CaCl 2 (2H 2 O), 5,6 g / L KCl, 2,6274 g / L NaH 2 PO 4, 3,408 g / L MgCl 2 (6H 2 O), (Fisher wetenschappelijke, Fair Lawn, NJ)); </li><li> Stock II (26,88 g / L NaHCO3, (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)). </li></ol></li><li> Bereid voorraad oplossingen van fluorescerende kleurstoffen. Om te voorkomen dat herhaaldelijk bevriezen en ontdooien, slaan we 30 ul fracties van beide kleurstoffen bij -20 ° C, wat voldoende is voor een experiment: <ol class="lalpha"><li> Voltage-gevoelige kleurstof RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA) stock-oplossing, 1,25 mg / ml oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma, St. Louis, MO); </li><li> Calcium indicator Rhod-2AM (Invitrogen, Carlsbad, CA) stock-oplossing, 1 mg / ml oplossing in DMSO. </li></ol></li><li> Bereid excitatie-contractie ontkoppelrail blebbistatin stockoplossing (Tocris Bioscience, St. Louis, MO, 2 mg / ml oplossing in DMSO) vooraf en opslaan van de opgeloste blebbistatin bij 4 ° C. </li></ol> 2. Bereid perfusie-oplossingen en experimentele opstelling 7 <ol start="4"><li> Vers voor te bereiden 2L Tyrode de oplossing (128.2mM NaCl, 1,3 mm CaCl 2 (2H 2 O), 4.7mM KCl, MgCl 1.05mM 2 (6H 2 O), 1.19mM NaH 2 PO 4, 20mm NaHCO 3, 11,1 mm D-Glucose in gedeïoniseerd water, pH = 7,35 ± 0,05). Als voorraad oplossing wordt gebruikt om 2L oplossing Tyrode's (voldoende voor een experiment) te nemen 1750 ml gedeïoniseerd water en meng in 125 ml op voorraad I, 125 ml van Stock II, en 4g van glucose. </li><li> Zet de twee pompen van de perfusie-systemen. Stel de peristaltische pomp (Peri-Star, WPI, Sarasota, USA) die wordt gebruikt voor retrograde perfusie tot 40 ml / min. Stel de andere peristaltische pomp (Cole-Parmer Masterflex Peristalic Pomp L / S, Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, Illinois) die wordt gebruikt voor superfusie en om het perfusaat terug te keren naar de holding reservoir tot 80 ml / min. </li><li> Was de perfusie-systeem met 70% ethanol gedurende 30 minuten en dan met 2L gedeïoniseerd water. </li><li> Zodra alle gedemineraliseerd water wordt afgevoerd uit de kamer, circuleren van de Tyrode de oplossing en het door een 5-um filter (Millipore, Billerica, MA, USA) passeren. Warm het perfusaat tot +37 ° C met een watermantel en circulatiepomp (ThermoNESLAB EX7, Newtown, USA) en zuurstof het perfusaat door borrelen O 2 / CO 2 (95% / 5%) gas in de oplossing. Monitor de pH van de oplossing met een pH-meter (Oakton Instruments, Vernon Hills, IL) en pas de snelheid van O 2 / CO 2 borrelen om de pH te houden op 7,35 ± 0,05. Blijven volgen pH en temperatuur tijdens het experiment. </li><li> De dubbele optische kaart brengen apparaat bestaat uit twee Micam Ultima-L CMOS-camera's (SciMedia, Costa Mesa, CA), die een hoge ruimtelijke (100x100 pixels, 230 ± 20 micrometer per pixel) en temporele (1,000-3,000 frames / sec) resolutie. Fix een band-pass filter (590 ± 15 nm, Thorlabs, Newton, NJ) in de voorkant van de aangewezen calcium beeldcamera, terwijl, een lange-pass filter (&gt; 700 nm, Thorlabs, Newton, NJ) moet worden geplaatst in voorkant van de aangewezen spanning beeldvorming camera. De camera's zijn loodrecht aan elkaar opgesteld door een houder, die een dichroïsche spiegel (635 nm cutoff, Omega Optical, Brattleboro, VT) bevat. Direct onder de dubbele camera houder is er een lens (Nikon NIKKOR 55 mm 1:1.4 235.052), die de emissie licht richt zich vanuit het hart op de dichroïsche spiegel. De werkafstand is ongeveer 3cm. De excitatie licht wordt gegenereerd door een halogeenlamp (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT, SciMedia, Costa Mesa, CA) en wordt doorgegeven door middel van een warmte-filter, sluitertijd, en de band-pass filter (520 ± 45 nm). Een flexibele lichtgeleider stuurt de band-pass gefilterd licht op de voorbereiding, en een sluitertijd wordt gebruikt om ervoor te zorgen dat de voorbereiding wordt blootgesteld aan het licht alleen tijdens de beeldacquisitie om te voorkomen dat fotobleken van de kleurstoffen. </li><li> Bereid Ag / AgCl 2 elektroden voor stimulatie en detectie van te voren en installeer ze in de kamer voorafgaand aan het plaatsen het hart. Zorg ervoor dat de versterkers en filters worden aangepast aan geschikte niveaus. </li></ol> 3. Oogst de muis hart, canule, en stel Langendorff perfusie <ol start="10"><li> Verdoven van de muis met ketamine / xylazine (ketamin, 80mg/kg lichaamsgewicht, xylazine, 10 mg / kg lichaamsgewicht) en heparine (100 eenheden) door intraperitoneale injectie. Verzekeren passend niveau van de anesthesie door het gebrek aan pijn reflex. </li><li> Na een tussentijdse borstbeen incisie, snel verwijdert u het hart en in zuurstofrijk was (95% O 2, 5% CO 2), een constante temperatuur (37 ± 1 ° C) Tyrode's oplossing. </li><li> Met behulp van een dissectiemicroscoop, Snel identificeren van de aorta en maak een schone dwars door de stijgende aorta onder het rechter a. subclavia. Een korte deel van de aorta wordt vervolgens gekoppeld aan een op maat gemaakte 21-gauge canule met een uitlopende tip. 4-0 zwart gevlochten zijden hechtmateriaal (chirurgische Specialties Corporation, Reading, PA) wordt gebruikt om het hart vast op de canule. Na cannulatie, is het hart retrogradely perfusie en superfused met de oplossing Tyrode's. De retrograde perfusie snelheid wordt aangepast in het bereik van 2-5 ml / min aan de aorta druk tussen de 60 en 80 mmHg (Pressure transducer, World precisie-instrumenten Inc (WPI), Sarasota, USA te houden; Bridge versterker TBM4M, WPI, Sarasota, USA). </li><li> Nadat het hart is gecanuleerde, zijn de longen, thymus, en vetweefsel vervolgens ontleed en verwijderd. </li><li> De geïsoleerde hart is gespeld (Fine Science Tools) aan de top naar de bodem van de perfusie kamer (Sylgard gecoat) te streamen-geïnduceerde beweging te voorkomen. De rechter-en linker atrium aanhangsels zijn ook uitgerekt en vastgezet (Fine Science Tools, Inc, Foster City, CA) op de bodem van de kamer, die maximale oppervlakte zorgt voor optische metingen van de atria. Heel belangrijk! Een klein siliconen buisje wordt ingebracht in de linker ventrikel via de longaders en gefixeerd door zijden hechtdraad naar het nabijgelegen bindweefsel. Dit voorkomt oplossing congestie en verzuring van het perfusaat gevangen in de linker ventrikel, wat vooral belangrijk is na de onderdrukking van ventriculaire contracties met een excitatie-contractie ontkoppelrail (zie deel 4 stap 19). </li><li> Een op maat gemaakte elektrode wordt geplaatst op het oppervlak van het hart naar de pacing prikkels, die wordt gegenereerd door Master-8 (AMP Instruments Ltd, Jeruzalem, Israël) of PowerLab 26T (AD Instruments, Sydney, Australië) gedrag. </li><li> Een klein afdekglas is gefixeerd op het oppervlak van de oplossing over het hart om bewegingsartefacten te verminderen van de trillende oplossing. </li><li> Focus van de excitatie licht op het hart. Daarnaast is de afstand tussen de dubbele camera apparatuur en het hart, zodat een maximale resolutie zal worden verkregen. </li><li> Schakel alle lichten in de kamer en beginnen elektrische opnamen met behulp van PowerLab 26T. </li></ol> 4. Load voltage en calcium gevoelige kleurstoffen en excitatie-contractie ontkoppelrail <ol start="19"><li> Warm-up 0,6 ml blebbistatin. Mix 0,5 ml van de blebbistatin met het perfusaat op het bedrijf reservoir. Verdun de resterende 0,1 ml blebbistatin in 1 ml van de oplossing Tyrode en langzaam te injecteren (over een periode van 20 minuten) via een drug-poort in de buurt van de canule. Let op als blebbistatin geleidelijk vermindert de bewegingsartefacten. </li><li> Verdun 30 pi van de spanning gevoelige kleurstof RH237 voorraad oplossing in een 1 ml Tyrode en langzaam over 5-7 minuten te injecteren in dezelfde injectie poort als blebbistatin. </li><li> 30 pi calcium indicator Rhod-2 AM is 1:1 gemengd met Pluronic F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 20% oplossing in DMSO) en vervolgens verdund in een oplossing mL Tyrode en langzaam toegepast over 5-10 min via dezelfde injectiepoort . </li><li> Wacht op 5-10 minuten voor blebbistatin en kleurstoffen aan de celmembraan en cytosol te bereiken. Ga verder met het protocol wanneer er beweging volledig wordt onderdrukt. </li><li> Permanent toezicht op ECG-opnamen over het gehele procedure om de normale elektrische functie van het hart verzekeren. </li><li> Beginnen fluorescentiesignaal opnamen met de SciMedia aangepaste software (SciMedia, Costa Mesa, CA). </li></ol> 5. Representatieve resultaten: <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Experimentele opstelling voor de perfusie, de elektrische en optische opnames in kaart brengen. EM = emissie; Lp = longpass <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Experimentele voorbereiding en het signaal voorbeelden opgenomen tijdens ventriculaire pacing. Links: ECG-signalen worden verzameld van Ag / AgCl 2 disk elektroden (Top) en een voorbeeld van S1S1 stimulatie protocol wordt getoond (Bottom). Center: Langendorff muis hart voorbereiding. Rechts: Representatieve optische actiepotentialen en calcium voorbijgaande signalen van atria (Top) en de ventrikels (Onder) worden getoond. De gele pijl (Top) wijst op het fluorescerende signaal verstrooiing afkomstig uit de hartkamers, die wordt gezien in de atriale opnames. LV = linker ventrikel; RV = Rechts ventrikel; LA = links atrium; RA = rechts atrium <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Vertegenwoordiger optische opnames van V m en kat uit de ventrikels van een wild-type muis het hart. A. De experimentele voorbereiding met een reeks van gelijkmatig verdeelde locaties gemarkeerd door zwarte stippen waarvan de optische-opnames zijn te zien in (C). B. Voorbeeld tracing van V m en CaT vanaf een centrale locatie op de matrix (zie kader in (C)). C. V m (blauw) en CAT (rood) uit de reeks van gelijkmatig verdeelde locaties. Signalen waren weggegooid 3x3. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Activering kaart en geleiding. A. Een voorbeeld activering kaart uit een wild-type muis hart met dwarse (T) en longitudinaal (L) richtingen aangegeven met witte pijlen. B. V m signalen (Top) en dV / dt (Onder) die overeenkomen met de drie punten te zien in A (T1, T2, T3, L1, L2, L3). <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Action potentieel en calcium voorbijgaande duur analyse. A. Actie mogelijke duur bij 80% repolarisatie (APD80) en calcium voorbijgaande duur op 80% ontspanning (CaD80) kaarten zijn vanaf een hart onder controle condities (links) en na 30 nM isoproterenol applicatie (rechts). De geel / groene kleur in de ventrikels (rechts) geeft aan isoproterenol verkort APD80 en CaD80. B. Voorbeeld traces van APD80 en CaD80 van de wild-type muis ventrikels (Top) en atria (onder).

<ol><li>Efimov, I. R., Rendt, J. M., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+maps+of+intracellular+%5BCa2%2B%5Di+transients+and+action-potentials+from+the+surface+of+perfused+guinea-pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts.</a> Circulation. 90, 1-1 (1994).</li>
<li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+repolarization+and+refractoriness+from+intact+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of repolarization and refractoriness from intact hearts.</a> Circulation. 90, 1469-1480 (1994).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> J Physiol. 529, 171-188 (2000).</li>
<li>Pruvot, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+calcium+cycling+versus+restitution+in+the+mechanism+of+repolarization+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Role of calcium cycling versus restitution in the mechanism of repolarization alternans.</a> Circ Res. 94, 1083-1090 (2004).</li>
<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95, 21-33 (2004).</li>
<li>Fast, V. G. Recording action potential using voltage sensitive dyes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFast%2C+VG+%22Practical+methods+in+cardiovascular+research%22">Practical methods in cardiovascular research</a>. Dhein, S., Delmoar, M. , Springer. New York. 233-255 (2005).</li>
<li>Glukhov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+K%28ATP%29+channel+pharmacology+in+intact+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. , (2009).</li>
<li>Baker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dispersion+of+repolarization+and+refractoriness+in+transgenic+mouse+hearts+promotes+reentrant+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced dispersion of repolarization and refractoriness in transgenic mouse hearts promotes reentrant ventricular tachycardia.</a> Circ Res. 86, 396-407 (2000).</li>
<li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacol Res. 41, 613-627 (2000).</li>
<li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+electrode+polarization+in+the+far+field%3A+implications+for+external+defibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Virtual electrode polarization in the far field: implications for external defibrillation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279, 1055-1070 (2000).</li>
<li>Hammouda, M., Kinosita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coronary+circulation+in+the+isolated+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The coronary circulation in the isolated heart.</a> J Physiol. 61, 615-628 (1926).</li>
<li>Salama, G., Hwang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+optical+mapping+of+intracellular+free+calcium+and+action+potentials+from+Langendorff+perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts.</a> Curr Protoc Cytom. 12, 17-17 (2009).</li>
<li>Lou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+panoramic+imaging+of+epicardial+electrical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Quantitative panoramic imaging of epicardial electrical activity.</a> Ann Biomed Eng. 36, 1649-1658 (2008).</li>
<li>Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+new%2C+long-wavelength%2C+voltage-sensitive+dyes+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart.</a> J Membr Biol. 208, 125-140 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In dit experiment hebben we wijzigde de Langendorff perfusie methode door het toevoegen van een klein siliconen buisje, wat vooral belangrijk is na de onderdrukking van ventriculaire contracties met een excitatie-contractie ontkoppelrail. Het silicium buis wordt gebruikt om de oplossing congestie, verzuring van de perfusie-oplossing, en de ontwikkeling van ischemie in de linker ventrikel te voorkomen. De muis hart is zeer gevoelig voor onderkoeling, dus, de temperatuur verschillen tussen het hart zal leiden tot kunstmatige verschillen in actiepotentiaal duur. Bijgevolg werd een verwarmingssysteem geïmplementeerd in de perfusie kamer in om een constante temperatuur van 37 ° C te behouden tijdens het geheel van het experiment 8. Aangezien een Langendorff model niet behouden innervatie van het hart, moet men overwegen om neurotransmitters aan het perfusaat om fysiologische sympathische en parasympathische toon 9 te onderzoeken. Naast de retrograde perfusie, toevoeging van superfusie van het hart helpt bij het handhaven geschikte milieu-parameters, zoals pH en temperatuur. In deze methode, was het Langendorff perfusie hart horizontaal geplaatst. Een verticale Langendorff perfusie setup kan ook worden gebruikt 10, maar kan resulteren in iets andere cardiale mechanica 11. Naast de CMOS-camera&#39;s, alternatieve detectors zijn ook beschikbaar en kan worden toegepast in kaart V m en CaT tegelijk 12. Toepassing van de CMOS-camera&#39;s van hoge spatio-temporele resolutie verzekert de juistheid van de opnames, maar optisch in kaart brengen van signalen niet van een enkele cel. Integendeel, elk fluorescent signaal komt uit honderden of duizenden cellen, afhankelijk van de optische vergroting. De veel grotere ventriculaire fluorescentie kan vervormen atriale signalen door optische verstrooiing, daarom een ​​zorgvuldige interpretatie van de opgenomen signalen optisch is vereist. Een andere beperking van de muis voorbereiding is het signaal vervorming en ruis veroorzaakt door de kromming van het oppervlak als gevolg van de geringe omvang van het hart 13. Geleidingssnelheid metingen kunnen worden veranderd niet alleen van de kromming van de muis hart, maar ook uit elektrode polariteit en virtuele elektroden. Om dit te bereiken nauwkeurigheid voor geleidingssnelheid, activering anisotropie, en repolarisatie kaarten, de juiste focus van de camera aan het oppervlak van het hart is essentieel. Bij deze methode kan real-time ECG-opnamen een aanvulling op de optisch onderzoek van de cardiale elektrofysiologie. Voltage-gevoelige kleurstof (RH237) en calcium indicator (Rhod-2AM) worden gebruikt in het protocol vanwege hun snelle respons, vergelijkbaar excitatie, en onderscheiden emissiespectra 3,7. Er zijn alternatieve combinaties van kleurstoffen die kunnen worden gebruikt tot en met V m en CaT andere dan de RH237 en Rhod-2AM 3 te meten. Een nieuwe voltage-gevoelige kleurstof, PGHI, met een grote Stoke&#39;s shift (&gt; 200nm) bleek beter V m en CAT-signalen als gevolg van de grotere scheiding van de emissie golflengtes tussen PGHI en Rhod-2AM 14 mogelijk te maken. Toekomstige verbeteringen kunnen zich richten op het verkennen van nieuwe fluorescerende probes, de ontwikkeling van nieuwe beeldvormende detectoren, en verbeterde beeldverwerking software. Hogere resolutie en nieuwe optische beeldvormingsmodaliteiten voor 3D optische kaarten zijn ook belangrijk de toekomstige richting van de optische kaart brengen 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Chemisch </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S271-1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 (2H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> C79-500 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S217-500 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (6H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 (H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S369-500 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S233-3 </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> D16-1 </td></tr><tr><td> Blebbistatin </td><td> Tocris Bioscience, Ellisville, MO </td><td> 1760 </td></tr><tr><td> RH237 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, Californië </td><td> S1109 </td></tr><tr><td> Rhod-2AM </td><td> Invitrogen, Carlsbad, Californië </td><td> R1244 </td></tr><tr><td> Pluronic F127 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, Californië </td><td> P3000MP </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide (DMSO) </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> D2650 </td></tr></tbody></table>

optische kaart brengen van actiepotentialen en calcium transiënten in de muis hart

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

De muis hart is een populair model voor cardiovasculaire studies te wijten aan het bestaan ​​van goedkope technologie voor genetische manipulatie in deze soort. Hart-en fysiologische fenotypering van de muis hart kan eenvoudig worden gedaan met behulp van fluorescentie beeldvorming in dienst verschillende sondes voor transmembraan potentiaal (V m), calcium transiënten (CAT), en andere parameters. Excitatie-contractie koppeling wordt gekenmerkt door een actiepotentiaal en intracellulair calcium dynamiek, daarom is het uitermate belangrijk om tegelijkertijd zowel de kaart V m en Cat vanaf dezelfde locatie op het hart 1-4. Gelijktijdige optische afbeelding van Langendorff doorbloed muis harten heeft de potentie om mechanismen die ten grondslag liggen aan hartfalen, hartritmestoornissen, metabole ziekten en andere hart-en vaatziekten toe te lichten. Visualisatie van activering, kan geleidingssnelheid, actiepotentiaal duur en andere parameters in een groot aantal sites niet worden bereikt met cellulair niveau onderzoek, maar is goed opgelost door het in kaart brengen van optische 1,5,6. In deze paper presenteren we de instrumentatie setup en experimentele omstandigheden voor het gelijktijdig optische in kaart brengen van V m en Kat in de muis harten met een hoge spatio-temporele resolutie met behulp van state-of-the-art CMOS-imaging-technologie. Consistente optische opnamen verkregen met deze methode te illustreren dat de gelijktijdige optische in kaart brengen van Langendorff geperfuseerde muis harten is haalbaar en betrouwbaar is.

Dit document beschrijft de dissectie procedure, instrumentale setup, en de experimentele omstandigheden tijdens de optische in kaart brengen van de transmembraan potentiaal (Vm) en intracellulair calcium van voorbijgaande aard (CAT) in intacte geïsoleerde Langendorff doorbloed muis harten.

Optische kaart brengen van actiepotentialen en Calcium Transiënten in de muis Hart

Het muizenhart is een populair model voor cardiovasculaire studies vanwege het bestaan van goedkope technologie voor genetische modificatie bij deze soort. ...

Het algemene doel van deze procedure is om gelijktijdig het transmembraanpotentiaal en de intracellulaire calciumtransiënt optisch in kaart te brengen in intacte, geïsoleerde en met LOR geperfuseerde muizenharten. Dit wordt bereikt door eerst het intacte muizenhart te excideren, vervolgens de aorta te canuleren en te beginnen met de LOR-perfusie. De volgende stap is om het hart te immobiliseren door een excitation contraction coupler te laden en vervolgens het hart vast te pinnen in de perfusiekamer.De laatste stappen zijn het laden van de optische kleurstoffen en het treffen van voorbereidingen om bewegingsartefacten tijdens het experiment te verminderen. Optische beelden worden verkregen door het licht dat door het hart wordt uitgezonden op te vangen met my cam Ultima LC Moss-camera's. Hey, mijn naam is di.Ik ben een promovendus aan de Washington University. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals micro-elektroden, is dat optical mapping een hogere ruimtelijke resolutie mogelijk maakt over het gehele hartoppervlak. Hallo, ik ben Matt Sulkin.Ik ben een promovendus aan de Washington University. Deze methode kan, mits correct uitgevoerd, helpen bij het beantwoorden van veel vragen in de cardiale elektrofysiologie, zoals de basis van aritmogenese. Begin met het configureren van één peristaltische pomp om de oplossingen te laten circuleren met een snelheid van 40 milliliters per minuut.Stel vervolgens een tweede peristaltische pomp in op 80 milliliters per minuut. Deze pomp voert het Perfuse eight terug naar het bewaar- en zuurstofreservoir. Zet de pompen aan en spoel het systeem 30 minuten lang met recirculatie met één liter 70% ethanol.Volg deze spoeling met twee liter gedeïoniseerd water zonder recirculatie. Zodra het water is afgevoerd, circuleert u twee liter Tyro-oplossing en laat u dit door een vijf micron filter lopen. Warm het perfuse op tot 37 °C met een watermantel en circulator, en borrel geoxygeneerd gas in de oplossing.Pas de snelheid van het gasborrelen aan om de pH op 7,35 plus of min 0,05 te houden. Monitor zowel de pH als de temperatuur tijdens het experiment. De dubbele optische mapping-apparatuur bestaat uit twee CMOS-camera's met hoge snelheid die een afbeelding van 100 bij 100 pixels kunnen vastleggen bij 3000 frames per seconde.Bevestig een banddoorlaatfilter aan de calciumbeeldgevingscamera en een langdoorlaatfilter aan de voltagescanscamera op een dubbele camerahouder. Bevestig een dichroïsche spiegel en lens zodanig dat het emissielicht afkomstig van het hart door de lens op de spiegel wordt gefocust. Bevestig daarnaast twee camera's aan de houder en plaats deze zodanig dat ze loodrecht op elkaar staan.Stel vervolgens de excitatieverlichting in. Het licht wordt gegenereerd door een halogeenlamp en via een flexibele lichtgeleider geleid. Leid het licht door een warmtefilter, een sluiter om de blootstelling te beperken en een excitatie-banddoorlaatfilter.Bereid tot slot de zilver- en zilverchloride-elektroden voor door deze in de kamer te plaatsen. Na het dubbel controleren en afstellen van de niveaus op de versterkers en filters is de opstelling klaar voor een hart. Gebruik een cocktail van ketamine en xylazine met 100 units heparine om een muis te anesthetiseren voordat u verdergaat.Bevestig dat het dier geen pijnreflex heeft door middel van een knijpreflex in de teen. Maak na een mediaal sternale incisie het hart en het omliggende weefsel snel vrij. Identificeer vervolgens met een dissectiemicroscoop snel de aorta en maak een schone doorsnede door de aorta ascendens onder de rechter arteria subclavia.Bevestig nu een kort stuk aorta aan een op maat gemaakte 21 gauge canule met vier 4-0 zwart gevlochten zijden hechtingen. Na canulatie wordt het hart retrograde geperfuseerd en gesuperefuseerd met Tyrode-oplossing; pas de stroomsnelheid aan om de aortadruk tussen 60 en 80 mmHg te houden, gemeten met een druktransducer.Dissekeer nu en verwijder het omliggende long-, thymus- en vetweefsel. Plaats vervolgens een siliconen slang via de longaders in de linker ventrikel. Hecht de slang vast aan het nabijgelegen bindweefsel.Deze zeer belangrijke stap voorkomt congestie en verzuring van Perfuse eight dat vastzit in de linker ventrikel, vooral na het onderdrukken van ventriculaire contracties. Om door Perfuse eight geïnduceerde hartbewegingen te voorkomen, wordt het hart bij de apex vastgepind aan de bodem van de met sill guard gecoate perfusiekamer. Rek daarnaast de rechter- en linkerauriculaire appendages uit en pin deze vast om het oppervlak van de atria in de rechtopstaande configuratie te vergroten.Dit zal het registratieoppervlak maximaliseren. Om de pacing-stimulaties uit te voeren, bevestigt u een op maat gemaakte elektrode op het hartoppervlak. Om bewegingsartefacten te verminderen, bevestigt u een klein dekglas over het hart op het oppervlak van de oplossing.Doe dit door het glas tussen meerdere pinnen te klemmen. Focus als laatste voorbereiding het excitatielicht op het hart en positioneer de camera's om een optisch beeld te verkrijgen, begin vervolgens met het laden van de kleurstof terwijl de kleurstoffen worden geladen. Bewaak continu de ECG-registraties om een normale elektrische functie van het hart te waarborgen.Begin met het opwarmen van BLEs statine tot kamertemperatuur. Meng vervolgens een halve milliliter BLEs statine in de profuse eight in het opvangreservoir, en verdun de resterende 0,1 milliliter BLEs statine in één milliliter Tyros-oplossing. Injecteer gedurende de volgende 20 minuten langzaam de BLEs statine in tyros via een drug port nabij de canule.De BLEs-statine zal het bewegingsartefact geleidelijk verminderen. Verdun vervolgens 30 µL spanningsgevoelige kleurstof in één milliliter tyro-oplossing en injecteer dit mengsel langzaam gedurende vijf tot zeven minuten in dezelfde drugport. Maak daarna hetzelfde mengsel opnieuw.Voeg nu nog eens 30 µL calciumindicator toe. Breng dit mengsel langzaam gedurende vijf tot 10 minuten via dezelfde poort aan. Nadat de calciumindicator is geïnjecteerd, wacht u nog vijf tot 10 minuten zodat de BLEs-statine de beweging volledig kan onderdrukken en de kleurstoffen de cellen kunnen binnendringen voordat u verdergaat met het experiment.Deze hartpreparaat is gemaakt. Volgens het protocol werden ECG-signalen geregistreerd tijdens ventriculaire pacing vanaf S1-S1 stimulatie. Actiepotentialen en calciumtransiënten werden geregistreerd vanuit de atria aan de linkerzijde en de ventrikels aan de rechterzijde.De pijl geeft aan waar signaalverstrooiing vanuit de ventrikels plaatsvond; door de opnames van de camera te groeperen in eenheden van drie bij drie pixels, kan een matrix van calciumtransiënten en actiepotentialen worden weergegeven op basis van de gegevens uit de array-data. Er kan een figuur worden opgesteld die de geleiding van het actiepotentiaal laat zien. Gegevens van drie opeenvolgende punten op de transversale en longitudinale as tonen de amplitudeverandering bij de voortplanting van het actiepotentiaal over een ventriculair oppervlak.Hetzelfde geldt voor een figuur die de duur van de actiepotentiaal en de calciumtransiënt weergeeft. Hierbij wordt links een controleconditie getoond en rechts een behandelconditie. Er is isoproterenol in het hart geïnjecteerd, wat de duur van zowel de calciumtransiënten als de actiepotentialen duidelijk verkort.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee tot drie uur worden voltooid volgens deze procedure. Andere methoden, zoals een pacing-protocol, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals die over de refractaire periode van de AV-knoop.

optical-mapping-action-potentials-calcium-transients-mouse

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit artikel beschrijft een hoge temporele en ruimtelijke resolutie techniek om optisch image actie potentiaal beweging op het oppervlak van de Langendorff-geperfuseerde rattenharten met behulp van een potentiometrische kleurstof (di-8-ANEPPS).

Optisch in kaart brengen van Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts

Dit artikel beschrijft de basisprocedures voor het uitvoeren van optische in kaart brengen van experimenten in de Langendorff-geperfuseerde konijn hart met behulp van het panoramische imaging systeem, en de dubbele (spanning en calcium) beeldvormende modaliteit.

Multiparametrische Optische kaart brengen van de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Dit artikel beschrijft de techniek die wordt gebruikt om dubbelkanaals optisch karteren uit te voeren in gekweekte HL-1 atriale celmonolagen. Dit unieke protocol maakt de gelijktijdige visualisatie van zowel calcium (Ca) als spanning (Vm) activiteit in hetzelfde gebied mogelijk voor de gedetailleerde detectie en analyse van elektrofysiologische eigenschappen van gekweekte monolagen.

Spanning en Calcium Dual Channel Optische kaart brengen van Gekweekte HL-1 atriale Myocyte Monolayer

Dit artikel beschrijft de gedetailleerde protocol en de apparatuur die nodig is voor dual optische kaart brengen van transmembraan potentiaal (V m) en gratis intra-sarcoplasmatisch reticulum (SR) Ca 2+ in de Langendorff-doorbloed konijn hart. Deze methode maakt directe observatie en kwantificering van Vm en SR Ca 2+ dynamiek in het intacte hart.

Optische kaart brengen van Intra-sarcoplasmareticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; En Transmembrane potentieel in de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Hier presenteren we een protocol voor optische kaart brengen van de elektrische activiteit van de muis rechteratrium en vooral de sinusknoop, bij een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Hoge-resolutie optische kaart brengen van de Muis sinusknoop

Dit protocol beschrijft de elektrofysiologische evaluatie van lymfkliertest atria met behulp van een optische mapping systeem met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, met inbegrip van dubbele opnamen van de membraan spanning en Ca2 + voorbijgaande onder geprogrammeerd stimulatie door middel van een speciale elektrode-katheter.

Elektrofysiologische beoordelingvan lymfkliertest Atria met hoge resolutie optische Mapping

We presenteren de methodologie voor het isoleren van Murine myocyten en het verkrijgen van spannings-of calcium sporen tegelijk met sarcomere inkorten van sporen met fluorescentie fotometrie met gelijktijdige metingen van digitale cellen geometrie.

Optische beeldvorming van geïsoleerde Murine ventriculaire Myocyten

Het doel van deze studie was het vaststellen van een methode voor het onderzoeken van de cardiale dynamiek met behulp van een translationeel diermodel. De beschreven experimentele aanpak omvat Dual-emission optocardiografie in combinatie met een elektrofysiologisch onderzoek om elektrische activiteit te beoordelen in een geïsoleerd, intact varkens hart model.

Optocardiografie en elektrofysiologie studies van ex vivo Langendorff-perfused Hearts

Dit protocol beschrijft de procedure voor het doorsnijden en kweken van menselijke cardiale plakjes voor preklinische geneesmiddelentesten en beschrijft het gebruik van optische mapping voor het opnemen van transmembranespanning en intracellulaire calciumsignalen gelijktijdig van deze plakjes.

Preklinische Cardiale Elektrofysiologie Beoordeling door Dual Voltage en Calcium Optical Mapping van human organotypic cardiale plakjes

Dit protocol introduceert dual-dye optische mapping van muizenharten verkregen van wildtype en knock-in dieren die zijn aangetast door catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie, inclusief elektrofysiologische metingen van transmembraanspanning en intracellulaire Ca2+ transiënten met hoge temporele en ruimtelijke resolutie.

Dual-Dye optische mapping van harten van RyR2R2474S Knock-in muizen van catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie

Leer optische mapping van actiepotentialen en calciumtransiënten in geïsoleerde muizenharten. Deze methode biedt hogere ruimtelijke resolutie dan traditionele technieken voor cardiale elektrofysiologisch onderzoek.

Optische kaart brengen van actiepotentialen en Calcium Transiënten in de muis Hart

Meer video's verkennen