Name: Een eenvoudige Chelex protocol voor DNA-extractie van Anopheles Spp. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Leer een snel Chelex-protocol voor DNA-extractie uit Anopheles-muggen voor malariaparasietgenotypering. Deze methode levert hoogwaardig DNA geschikt voor PCR in slechts 37 minuten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn dank verschuldigd aan de leiders, hoofdmannen en gemeenschappen van Macha van hun unwaveing ​​samenwerken tijdens mug veld monstercollecties. Dr Doug Norris en Rebekka Kent aangeboden onschatbare expertise op de uitzoutingsconstante protocol. Dit werk werd gefinancierd door de Johns Hopkins Malaria Research Institute piloot subsidie ​​systeem. Mosquito en parasiet DNA-laboratorium normen werden gedoneerd door MR4, American Type &amp; Culture Collection.

1. Voorbereidende Dissectie van Mosquito Specimens <ol><li> Plaats mug op een klein snijden van parafilm en monteren op ontleden microscoop. </li><li> Dekking druppel gedeïoniseerd water om weefsel te verzachten. </li><li> Precies Incise de mug karkas bij de verbinding tussen de thorax en de buik, waardoor knikken van de kop en de thorax van de buik gedeelte. </li><li> Breng elke ontleed mug sectie in een schone geautoclaveerd 1,5 ml microcentrifugebuis prelabeled met mug ID-nummer gegevens en doelmatig zijn gekenmerkt aan het lichaam sectie (bijvoorbeeld &quot;m&quot; voor mid-gut sectie; &quot;ht&quot; voor de kop en borst sectie) aan te duiden. </li><li> Gooi parafilm en zorgvuldig microscoop podium af met 70% alcohol bevochtigd Kimwipe voor het verwerken van de volgende mug. </li></ol> 2. DNA-extractie van Mosquito Specimens <ol><li> Pipetteer 20 ul van gedeïoniseerd water in monsterbuis en gebruik pipet tip om de verzonken mug sectie vermalen tot een uniForm schorsing. </li><li> Voeg 100 ul van geautoclaveerd 1X PBS / 1% oplossing saponine monster homogenaat en meng door voorzichtig vortexen momentane. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. </li><li> Centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 2 min en verwijder het supernatant. </li><li> Hersuspendeer pellet in 100 pi 1X PBS. </li><li> Centrifugeer opnieuw bij 20.000 xg gedurende 2 min en verwijder het supernatant. </li><li> Door voorzichtig vortexen (5 sec), Hersuspendeer pellet in 75 ul steriel gedeïoniseerd water en 25 pi van 20% w / v Chelex-100 hars suspensie in gedeïoniseerd water. </li><li> Pierce gat in het deksel van het monster buis met behulp van steriele 23G injectienaald geflambeerd met bunsenbrander. </li><li> Kook monster suspensie in een waterbad op drijvende rack (of verwarmingsblok) gedurende 10 minuten. </li><li> Centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 1 min en daaropvolgende overdracht DNA oplossing in prelabeled opslag flesje voor gebruik als matrijs in PCR toepassingen. </li></ol> 3. Plasmodium falciparum Genotypering en Anophelesspp. Moleculaire identificatie <ol><li> Voeg 2,5 ul van de Chelex DNA extract in 25 pi PCR-reacties om DNA kwaliteit 11 controleren, Anopheles species identificeren 10 en genotype P. falciparum 12 mid-darm en speekselklier infecties. </li><li> Om amplicon opbrengst, vooral voor P. maximaliseren falciparum detectie bevatten 1.5X runderserumalbumine (BSA) in de PCR assay. De volgende reactie samenstelling wordt aanbevolen: (2,5 ul mal, 0,25 pM primers, 1,5 uM magnesiumchloride, 200 uM dNTPs, 1X PCR Buffer, 1.5X BSA en 1.0U Taq DNA polymerase, in 25 pl volumes). </li><li> Om te controleren voor DNA-kwaliteit in het extract, versterken regio van de geleedpotigen mitochondriale nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subeenheid 4 (ND4) gen (primers ND4FW [5&#39;-GTD YAT TTA TGA TTR CCT ​​AA-3 &#39;] en ND4RV [5&#39; -CTT CTT CGD CCW ADW CGT TC-3 &#39;]; verwachten product 400bp) 11,13. </li><li> Om Anopheles gambia onderscheidene sl. broer of zus soorten (An. gambiae ss en An. arabiensis alleen), versterken regio flankeren SNPs in het intergene spacer (IGS) regio, (primers VN [5&#39;-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 &#39;], GA [5&#39;-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 &#39;], AR [5&#39;-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3&#39;]; verwachten product 390bp Een gambiae ss, 315bp Een arabiensis) 10,11. </li><li> Voor het typen P. falciparum antifolaat resistentie polymorfismen, voert geneste PCR met flankerende regio aminozuur codons 108, 51, 59, 16 en 164 in de parasiet dihydrofolaatreductase (DHFR) gen te amplificeren: Eerste ronde primers: M1 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 &#39;] en M5 [5&#39;-AGTATATACATCGCTAACAGA-3&#39;] Secundaire ronde primers: M3 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 &#39;] met F / [5&#39;-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3&#39;] Of F [5&#39;-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] met M4 [5&#39;-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 &#39;]). Ook versterken regio aminozuur codons 436, 437, 540, 581 eennd 613 in de P. falciparum dihydropteroate synthetase (DHPS) gen: Eerste ronde primers R2 [5&#39;-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 &#39;] met R / [5&#39;-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3&#39;]; Secundaire ronde primers J: [5&#39;-&#39;TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3&#39;] met K / [5&#39;-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 &#39;] Of K: [5&#39;-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 &#39;] met K /, Of L [5&#39;-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 &#39;] met L / [5&#39;-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3&#39;] 12. </li><li> Betreft 4 ui amplicon te allelspecifieke restrictie-enzym digestie in 30 pl reacties volgens de instructies van de fabrikant te detecteren antifolaat geneesmiddelresistentie-geassocieerde polymorfismen 12. </li><li> Betreft 5 pi PCR amplicon (of 15 pi restrictiedigest) per rijstrook van ethidiumbromide gekleurde 2% agarose gel elektroforese (100 - 120 V) en visualiseren banden onder UV-licht. </li></ol>

<ol><li>Bonnet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+antimalarial+treatment+in+Guinea%3A+in+vivo+study+of+two+artemisinin+combination+therapies+in+Dabola+and+molecular+markers+of+resistance+to+sulphadoxine-pyrimethamine+in+N%27Zerekore%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N'Zerekore.</a> Malar. J. 6, 54(2007).</li>
<li>Nsimba, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulphadoxine%2Fpyrimethamine+versus+amodiaquine+for+treating+uncomplicated+childhood+malaria+in+Gabon%3A+a+randomized+trial+to+guide+national+policy%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy.</a> Malar. J. 7, 31(2008).</li>
<li>Oyewole, I. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviour+and+population+dynamics+of+the+major+anopheline+vectors+in+a+malaria+endemic+area+in+southern+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vector+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria.</a> J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).</li>
<li>Harris, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+proportion+of+asymptomatic+Plasmodium+infections+with+low+and+sub-microscopic+parasite+densities+in+the+low+transmission+setting+of+Temotu+Province%2C+Solomon+Islands%3A+challenges+for+malaria+diagnostics+in+an+elimination+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J.+%22%5BJournal%5D)">A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting.</a> Malar. J. . 9, 254(2010).</li>
<li>Ouedraogo, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substantial+contribution+of+submicroscopical+Plasmodium+falciparum+gametocyte+carriage+to+the+infectious+reservoir+in+an+area+of+seasonal+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission.</a> PLoS ONE. 4, e8410(2009).</li>
<li>Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+challenges+in+the+scaling+up+of+HIV%2C+TB%2C+and+malaria+programs%3A+The+interaction+of+health+and+laboratory+systems%2C+clinical+research%2C+and+service+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery.</a> Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).</li>
<li>Ishengoma, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Health+laboratories+in+the+Tanga+region+of+Tanzania%3A+the+quality+of+diagnostic+services+for+malaria+and+other+communicable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Trop.+Med.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).</li>
<li>Alonso, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+research+agenda+for+malaria+eradication%3A+vector+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">A research agenda for malaria eradication: vector control.</a> PLoS Med. 8, e1000401(2011).</li>
<li>Grimberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+non-organic+procedure+for+the+isolation+of+genomic+DNA+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood.</a> Nucleic Acids Res. 17, 8390(1989).</li>
<li>Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indentification+of+single+specimens+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).</li>
<li>Kent, R. J., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mammalian+blood+meals+in+mosquitoes+by+a+multiplexed+polymerase+chain+reaction+targeting+cytochrome+B%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).</li>
<li>Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum%3A+detection+of+polymorphisms+in+the+dihydrofolate+reductase+and+dihydropteroate+synthetase+genes+by+PCR+and+restriction+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion.</a> Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).</li>
<li>Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+isolation+by+distance+among+Aedes+aegypti+populations+along+the+northeastern+coast+of+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).</li>
<li>Kreader, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relief+of+amplification+inhibition+in+PCR+with+bovine+serum+albumin+or+T4+gene+32+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).</li>
<li>Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsatellite+DNA+polymorphism+and+heterozygosity+among+field+and+laboratory+populations+of+Anopheles+gambiae+ss+%28Diptera+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae).</a> J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).</li>
<li>Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+polymerase+chain+reaction-amplified+malarial+DNA+in+infected+blood+and+individual+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes.</a> Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).</li>
<li>Al-Soud, W. A., Radstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+PCR-inhibitory+components+in+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).</li>
<li>Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitory+effect+of+pentobarbitone+on+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Methods%22%5BJournal%5D)">The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De vereenvoudigde Chelex methode hier gepresenteerde maakt winning van kwaliteit Anopheles spp en P. falciparum DNA van mug specimens vatbaar diverse PCR toepassingen. Deze techniek kan worden gebruikt voor moleculaire identificatie van malaria vector muggen en de bewaking van resistente P. falciparum allelen in muggen voor nationale malaria controleprogramma&#39;s. De voordelen van de vereenvoudigde Chelex techniek zijn eenvoud minder reagentia en dus kosten, veiligheid en kortere verwerkingstijd (37 min) dan standaardprotocollen zoals uitzouten werkwijze 10 (2 uur 47 min en een nacht stap, tabel 1). De genoemde voordelen en minimale reagens eisen (3 reagentia) in vergelijking met de huidige standaard protocol (10 reagentia, tabel 1) 11,15, de vereenvoudigde Chelex protocol bijzonder vriendelijk naar endemisch land laboratoria waar een constante reagensketen is vaak moeilijk te handhaven. Een beperking van de methode is dat als de standaard protocol, dat onderhevig is aan PCR remmers bekend bij de mug integument 16. Dit is echter gemakkelijk verlicht door opname van BSA in de assays. BSA is ook met succes toegepast als een versterking enhancer tegen inhibitoren in andere toepassingen PCR 17,18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Chelex-100, 50-100 droge mesh </td><td> BioRad </td><td> # 143-2832 </td><td></td></tr><tr><td> Saponine </td><td> SIGMA </td><td> 142-7425 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> New England Biolabs </td><td> B9001S </td><td></td></tr></tbody></table>

een eenvoudige chelex protocol voor dna-extractie van<em&gt; anopheles</em&gt; spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemische landen worden in toenemende mate de aanneming van moleculaire tools voor efficiënte typen, identificatie en bewaking tegen malaria parasieten en vector muggen, als een integraal onderdeel van de bestrijdingsprogramma&#39;s 1,2,3,4,5. Voor een duurzame inrichting van deze nauwkeurige benaderingen in operationeel onderzoek naar de bestrijding van malaria en eliminatie inspanningen, eenvoudige en betaalbare methode, met karig reagens en apparatuur aan te scherpen zijn essentieel 6,7,8. Hier presenteren we een eenvoudig Chelex-gebaseerde techniek voor de extractie van malariaparasiet en vector-DNA van veld verzamelde muggen exemplaren. We morfologisch geïdentificeerd 72 Anopheles gambiae sl. Vanaf 156 muggen gevangen genomen door pyrethrum spuiten vangsten in slaapkamers van de huishoudens binnen een 2.000 km 2 nabijheid van de Malaria Instituut in Macha. Na dissectie van de kop en thorax scheiden van de buik voor alle 72 Anopheles gambiae sl. muggen werden de twee delen afzonderlijk geplaatst in 1,5 ml microcentrifuge buizen en ondergedompeld in 20 pl gedeioniseerd water. Met behulp van een steriele pipet tip, werd elke mug sectie afzonderlijk gehomogeniseerd tot een uniforme suspensie in de gedeïoniseerd water. Van de daaropvolgende homogenaat van elke sectie muggen, werd 10 ul behouden, terwijl de andere 10 pi werd overgebracht naar een afzonderlijk geautoclaveerd 1,5 ml buis. De afzonderlijke monsters werden onderworpen aan DNA extractie door ofwel de vereenvoudigde Chelex of de standaard uitzouten extractieprotocol 9,10. De uitzouten protocol is de zogenaamde en veel gebruikt omdat het werk hoge zoutconcentraties in plaats van gevaarlijke organische oplosmiddelen (zoals fenol en chloroform) voor het eiwit tijdens precipitatiestap DNA extractie 9. Extracten werden gebruikt voor de PCR amplificatie met behulp van primers gericht geleedpotige mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subeenheid 4 gen (ND4) om DNA kwaliteit 11, een PCR voor de identificatie van Anopheles gambiae broer of zus soorten 10 en een geneste PCR controleren op het typen van Plasmodium falciparum infectie 12. Vergelijking met behulp van DNA-kwaliteit (ND4) PCR toonde 93% sensitiviteit en 82% specificiteit voor de Chelex benadering ten opzichte van de gevestigde uitzoutingsconstante protocol. Corresponderende waarden van gevoeligheid en specificiteit was 100% en 78%, respectievelijk met sibling soortidentificatie PCR en 92% en 80%, respectievelijk P. falciparum detectie PCR. Er waren geen significante verschillen in percentage monsters die amplicon signaal met de Chelex of regelmatig uitzouten protocol alle drie PCR toepassingen. De Chelex aanpak vereist drie eenvoudige reagentia en 37 minuten in beslag, terwijl de uitzoutingsconstante protocol hield 10 verschillende reagentia en 2 uur en 47 min &#39;verwerkingstijd, met inbegrip van een overnachting stap. Onze resultaten tonen aan ede Chelex methode is vergelijkbaar met de bestaande uitzouten extractie en kan worden vervangen als een eenvoudige en duurzame aanpak met beperkte middelen waar een constante reagens keten is vaak moeilijk te handhaven.

Voorbeelden van resultaten van PCR assays voor mug DNA extract kwaliteit (figuur 1), Anopheles arabiensis moleculaire identificatie (figuur 2) en P. falciparum detectie (figuur 3) blijkt dat de vereenvoudigde Chelex werkwijze vergelijkbaar resultaat levert het standaard protocol uitzouten 10, ondanks veel minder stappen (tabel 1). Met vergelijkbare DNA-kwaliteit in de betreffende extracten is het niet verwonderlijk dat monster positiviteit tarieven met betrekking tot een. gambiae broertje soorten en parasitaire infectie tarieven waren niet statistisch verschillend op basis van McNemar-chi-kwadraat test (Figuur 3). Gevoeligheid (%) werd berekend als TP / (TP + FN) * 100, waar TP betekent het ware positieven en valse negatieven FN geeft. Specificiteit (%) werd bepaald als TN / (TN + FP) * 100, waar TN betekent het ware negatieven en FP geeft valse positieven. De DNA kwaliteit (ND4) PCR toonde 93% sensitiviteit en 82% specificiteit voor de Chelex benadering ten opzichte van de gevestigde uitzoutingsconstante protocol als gouden standaard. Corresponderende waarden van gevoeligheid en specificiteit was 100% en 78%, respectievelijk met sibling soortidentificatie PCR en 92% en 80%, respectievelijk P. falciparum detectie PCR. De toevoeging van BSA aan reactiemengsels tot een algemene verhoging van PCR positieve (figuur 3) door verlichting van PCR remmers 14 voor zowel de vereenvoudigde Chelex en regelmatige uitzouten protocol. Deze toename was niet statistisch significant behalve DNA kwaliteit (ND4 PCR) op Chelex extracten (p = 0,039). Allelspecifieke restrictie-enzymdigestie op P. falciparum DHFR (of andere doelgen) amplicon kan de genotypering van mid-darm en speekselklier malaria infecties resistentie allelen (figuur 4; speekselklier data niet getoond). <table border='"1"&gt;'><tr><td colspan="2"> Eenvoudige Chelex Procedure </td><td colspan="2"> Standaard Zouten uit Procedure </td></tr><tr><td> Stappen </td><td> Reagentia </td><td> Stappen </td><td> Reagentia </td></tr><tr><td><ol><li> Toevoegen specimen tot 1,5 ml microfugebuis en homogeniseer in 100 pi 1X PBS / 1% saponine-oplossing (2 min). </li><li> Reactie bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. </li><li> Spin bij 20.000 xg gedurende 2 min en verwijder het supernatant. </li><li> Voeg 100 ul van 1X PBS toe en meng voorzichtig door kort vortexen (3 sec). </li><li> Spin bij 20.000 xg gedurende 2 min en verwijder het supernatant. </li><li> Voeg 25 ul van 20% w / v Chelex in gedeïoniseerd water en 75 pi steriel gedemineraliseerd water. </li><li> Pierce opening in deksel monsterbuis met hete steriele 23G naald en kook buisinhoud gedurende 10 minuten. </li><li> Spin microfugebuisje op 20000 xg gedurende 1 min. </li><li> Breng supernatant in steriele prelabeled flesje en bewaar DNA oplossing bij -20 ° C tot gebruik (2,5 ul in 25 ul PCR reactie). </li></ol></td><td> PBS Saponine Chelex-100 kralen </td><td><ol><li> Toevoegen specimen tot 1,5 ml microfugebuis en homogeniseer in 100 ul buffer Bender * met 1% DEPC (2 min). </li><li> Incubeer bij 65 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Voeg 15 ul koude 8 M kaliumacetaat. Meng voorzichtig en incubeer op ijs gedurende 45 minuten. </li><li> Spin monster in microfugebuizen bij 20.000 x g gedurende 10 min en overdracht supernatant naar een nieuwe 1,5 ml buis. </li><li> Voeg 250 ul 100% ethanol en meng goed door het buisje. </li><li> Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Spin monsters bij 20.000 x g gedurende 15 minuten. </li><li> Aspireren en verwijder het supernatant, waardoor de pellet volledig opdrogen in de buis (30 min). </li><li> Hersuspendeer pellet in 20 ul 0,1 X SSC + RNAse (10 ug / ml) gedurende de nacht bij 4 ° C. </li><li> Voeg 80 pl DEPC water en bij -20 ° C tot gebruik. </li></ol></td><td> Diethylpyrocarbonaat (DEPC) * Bender Buffer: 0,1 M NaCl 0,2 M Sucrose 0,1 M Tris-HCL 0,05 M EDTA, pH 9,1 0,5% SDS in DEPC water 8 M kaliumacetaat Ethanol 0,1 x Saline natriumcitraat (SSC) buffer RNAse (10 ug / ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Totale tijd: 37 min </td><td colspan="2"> Totale tijd: 2 uur 47 min, plus girale </td></tr></table> Tabel 1. Stap voor stap vergelijking van de reagentia en de tijd eisen voor eenvoudige Chelex protocol en staanard uitzoutingsconstante methode voor DNA-extractie van muggen exemplaren. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. ND4 mitochondriale DNA PCR vergelijking van de kwaliteit van vereenvoudigde Chelex "C" en standaard uitzouten "M" extracten Anopheles arabiensis veldmonsters. NC, negatieve controle, M1 en C1, M2 en C2, M3 en C3, en de M4 en C4 zijn gekoppeld zouten uit en Chelex uittreksels uit dezelfde An. arabiensis mug specimens. L, 100 bp DNA ladder. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2 Moleculaire identificatie PCR voor Anopheles arabiensis C1 en M1, M2 en C2, C3 en M3, M4 en C4 duiden respectieve amplicon van uitzouten "M" en vereenvoudigde Chelex "C" DNA extracten dezelfde mosquito specimens;.. AR, Anopheles arabiensispositieve controle, L, 100 bp DNA-ladder. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Detectie van positieven, op Chelex en zouten uit DNA-extracten voor muggen veldmonsters, met PCR assays voor de moleculaire identificatie van Anopheles arabiensis (AR) 10, geleedpotigen NADH dehydrogenase-gen 4 (ND4) DNA-kwaliteit te testen 11 en antifolaat resistentie P . falciparum DHFR genotypering 12 (F-M4). resultaten getoond voor assays uitgevoerd met of zonder BSA in het reactiemengsel. McNemar-chi-kwadraattest werd gebruikt om te bepalen of de verschillen tussen percentage positieve PCR van DNA geëxtraheerd uit de vereenvoudigde Chelex en de standaard uitzouten protocollen waren statistisch significant. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> P. falciparum-infecties in muggen (midden-gut-gegevens weergegeven) voor resistentie allelen. BstN ik vertering op amplicon flankerende codon 108 van de P. falciparum DHFR gen 12 toont cycloguanil-resistente S108T mutanten in mug monsters (M1-M5, mid-gut-gegevens weergegeven). U, onverteerd 522 bp amplicon; FCR3, laboratorium standaard P. falciparum positieve controle kloon die S108T, K1, P. falciparum laboratorium standaard kloon negatieve controle uitvoeren cycloguanil-gevoelige S108N, L, 100 bp DNA-ladder.

Een snelle en betaalbare manier om de kwaliteit malariaparasiet en vector-DNA extraheren uit mug exemplaren beschreven. Voortbouwend op chelerende eigenschappen van Chelex hars, maakt de eenvoudige methode genotypering van malariaparasieten in mug mid-darmkanaal en speekselklier fasen en moleculaire identificatie van de<em&gt; Anopheles</em&gt; Sibling soorten door middel van PCR.

Een eenvoudige Chelex protocol voor DNA-extractie van<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemische landen maken in toenemende mate gebruik van moleculaire instrumenten voor efficiënte typering, identificatie en surveillance van malariaparasieten en vectoren ...

Het algemene doel van deze procedure is het extraheren van DNA van malaria, parasieten en muggen uit de secties van de middendarm en kliersecties van de exemplaren. Dit wordt bereikt door de mug eerst precies door te snijden bij het gewricht tussen het abdomen en de thorax, waardoor de middendarm wordt gescheiden van de sectie met de speekselklieren. Vervolgens wordt elke sectie afzonderlijk vermalen in gedeïoniseerd water.Vervolgens wordt de weefselisuspensie behandeld met loog en gewassen, waarna het celpellet wordt teruggewonnen. Ten slotte wordt het celpellet gereconstitueerd en gekookt, en wordt het DNA geëxtraheerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die DNA van hoge kwaliteit van zowel de mug als de malariaparasiet laten zien, dat geschikt is voor gebruik als template om anomalieën, vectorensoorten en het genotype van malariainfecties te identificeren via PCR en allelspecifieke restrictie-enzymdigestie.Het belangrijkste voordeel van deze zeer eenvoudige techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals organische extractie en sorteermethoden, is dat er zeer weinig veilige en gemakkelijk verkrijgbare reagentia worden gebruikt en dat de verwerkingstijd aanzienlijk korter is. Om de muskiet te dissekeren, plaatst u deze op een klein stukje parafilm en monteert u deze onder een dissectiemicroscoop. Bedek de muskiet met een druppel gedeïoniseerd water.Om het weefsel in fixatiemiddel te verzachten, wordt het muggenkarkas precies bij het gewricht tussen het thorax en het abdomen ingesneden. Hierdoor worden de kop en het thorax van het abdominale gedeelte gescheiden. Verplaats elk gedissecteerd muggendeel naar een schone, geautoclaveerde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter, vooraf gelabeld met het identificatienummer van de mug en het lichaamsdeel. Verwijder de parafilm en veeg met een Kimwipe, bevochtigd met 70% alcohol, zorgvuldig de objecttafel van de microscoop schoon voordat u overgaat naar de volgende mug. Pipetteer voor het extraheren van het muggen-DNA eerst 20 µL gedeïoniseerd water in de monsterbuis.Gebruik vervolgens de pipetpunt om de ondergedompelde muskietsectie te vermalen tot een uniforme suspensie. Voeg 100 µL van een geautoclaveerde XPBS 1% saponine-oplossing toe aan het monsterhomogenaat en meng dit voorzichtig door middel van vortexen. Incubeer het monster gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.Centrifugeer vervolgens gedurende twee minuten bij 20.000 G en verwijder het supernatant. Resuspendeer het pellet in 100 µL 1X PBS. Herhaal daarna de centrifugatie.Voeg 75 µL steriel gedeïoniseerd water en 25 µL van een 20% w/v Cellex 100-hars suspensie in gedeïoniseerd water toe en vortex voorzichtig om het pellet opnieuw te suspenderen met behulp van een steriele 23 gauge hypodermische naald die is gevlamd in een bunsenbrander. Prik een gat in het dopje van de monsterbuis.Kook de monster-suspensie in een heating block gedurende 10 minuten. Centrifugeer bij 20.000 G gedurende één minuut en breng de DNA-oplossing over in een vooraf gelabeld bewaard buisje voor gebruik als template in PCR-reacties om de kwaliteit van het geëxtraheerde DNA te controleren en om een regio van het mitochondriale nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit four-gen van de arthropode te amplificeren, waarvan wordt verwacht dat dit een fragment van 400 baseparen oplevert. Om vervolgens onderscheid te maken tussen Ananais Gambia-soorten, wordt een regio geflankeerd door SNP's in de intergene spacer-regio geamplificeerd, waarvan wordt verwacht dat deze fragmenten van 390 baseparen oplevert voor Ananais Gambia Sens Stricto en 315 baseparen voor ananais api.Ansis voert vervolgens de genotypering uit van de polymorfismen voor resistentie tegen antifolaatmedicatie bij P. falciparum. Voer een nested PCR uit om de regio rondom de aminozuurcodons 16, 51, 59, 108 en 164 te amplificeren. Voer in het dihydrofolaatreductase-gen van de parasieten een allelspecifieke digestie van het amplicon uit om resistentie tegen antifolaatmedicatie vast te stellen.Geassocieerde polymorfismen. Controleer de reacties op een 2%AROS gel-elektroforese. Voorbeelden van resultaten uit PCR-assays voor de kwaliteitsanalyse van mosquito DNA-extract, RABIS moleculaire identificatie en p falciparum genotypering tonen aan dat de vereenvoudigde Kelex-methode soortgelijke resultaten oplevert als het standaard salting-out protocol, ondanks minder stappen en minder dan een kwart van de tijd, met een vergelijkbare DNA-kwaliteit in de respectievelijke extracten; het is dan ook niet verrassend dat de positiviteitspercentages van monsters met betrekking tot anomalieën, Gambia-zuster-soorten en parasitaire infectiepercentages statistisch niet verschilden op basis van de chi-kwadraat-toets van McNear.De toevoeging van BSA aan reactiemengsels resulteert in een algemene toename van PCR-positieven door de verwijdering van PCR-remmers voor zowel het vereenvoudigde kelex- als het reguliere salting-outprotocol. Deze toename was echter niet statistisch significant, behalve voor de DNA-kwaliteit van kelex-extracten. Zodra de methode onder de knie is, maakt allelspecifieke restrictie-enzymvertering van het p. falciparum-amplicon het mogelijk om midgut- en speekselklierinfecties met malaria te genotyperen op drugresistente allelen.Deze techniek kan, mits correct uitgevoerd, in ongeveer 37 minuten worden voltooid.

a-simple-chelex-protocol-for-dna-extraction-from-anopheles-spp

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Onlangs high-throughput sequencing technologie is sterk toegenomen gevoeligheid van chromatine immunoprecipitatie (ChIP) experiment en gevraagd de toepassing ervan met behulp van gezuiverde cellen of weefsel ontleed. Hier hebben we een methode om af te bakenen ChIP techniek te gebruiken...

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van Drosophila Weefsel

Fluorescerende<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie op Mitotische Chromosomen van muggen

We beschrijven een robuuste methode voor het chromatine immunoprecipitatie met primaire T-cellen. De methode is gebaseerd op standaard methoden, maar gebruikt een specifieke set van omstandigheden en reagentia die de efficiëntie van een beperkte hoeveelheid cellen verbeteren. Belangrijk is een gedetailleerde beschrijving van de data analysefase gepresenteerd.

Efficiënte Chromatine immunoprecipitatie behulp Beperking hoeveelheden biomassa

Chromosoomschilderen is een handige methode voor het bestuderen van de organisatie van de celkern en de evolutie van het karyotype. Hier demonstreren we een aanpak om specifieke interessegebieden te isoleren en te versterken van enkele polytene chromosomen die vervolgens worden gebruikt voor twee- en driedimensionale fluorescerende in situ hybridisatie (FISH).

2D en 3D Chromosoom schilderen in Malaria Muggen

We beschrijven hier een eenvoudige en snelle papieren DNA extractiewerkwijze HIV provirale DNA uit vol bloed gedetecteerd met kwantitatieve PCR. Dit protocol kan worden verlengd voor gebruik bij het detecteren andere genetische merkers of alternatieve amplificatiewerkwijzen.

Filtratie Isolatie van nucleïnezuren: Een eenvoudige en snelle DNA Extraction Method

Hier presenteren we een nieuwe aanpak om te identificeren plantenvirussen met dubbele streng DNA genomen. Wij gebruiken standaard methoden uittreksel DNA en RNA van besmette bladeren en uitvoeren van de volgende generatie sequencing. Bioinformatic hulpmiddelen assembleren sequenties in contigs, identificeren van contigs vertegenwoordigen virus genomen en genomen aan taxonomische groepen toewijzen.

Het combineren van de analyse van DNA in een ruwe Virion extractie met de analyse van RNA van besmette bladeren om te ontdekken van nieuwe Virus Genomes

Hier wordt een DNA-extractieprotocol beschreven met behulp van magnetische kralen om DNA-extracties van hoge kwaliteit van muggen te produceren. Deze extracties zijn geschikt voor een downstream next-generation sequencing benadering.

Een op magnetische kraal gebaseerd mosquito-DNA-extractieprotocol voor sequencing van de volgende generatie

Dit protocol biedt de stappen van DNA-extractie tot experimentele opstelling voor digitale druppel PCR (ddPCR), inclusief analyse voor de identificatie en kwantificering van niet-homologe end-joining (NHEJ) gebeurtenissen op doellocaties na gRNA-geïnduceerde Cas9-splitsing en DNA-reparatie. Andere toepassingen van deze methode zijn toepassingen zoals polymorfismedetectie en genbewerkingsvariantverificatie.

Digital-Droplet PCR om indels mutaties in genetisch gemodificeerde anopheline muggenpopulaties te detecteren

Dit artikel beschrijft een protocol voor snelle identificatie van indels geïnduceerd door CRISPR /Cas9 en selectie van mutante lijnen in de mug Aedes aegypti met behulp van hoge resolutie smeltanalyse.

Indel Detection na CRISPR/Cas9 Mutagenese met behulp van Hoge resolutie Melt Analysis in de Mosquito Aedes aegypti

Dit protocol beschrijft een sandwich-enzymgekoppelde immunosorbenttest om speekselkliersporozoïeten bij muggen te detecteren. Met behulp van gemakkelijk verkrijgbare monoklonale antilichamen maakt de methode kosteneffectieve detectie met hoge doorvoer mogelijk van muggen die Plasmodium falciparum of Plasmodium vivax dragen. De methode is geschikt voor onderzoek naar de overdracht van malaria, inclusief vectoronderzoeken.

Detectie van Plasmodium Sporozoïeten bij Anopheles-muggen met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbenttest

Leer een snel Chelex-protocol voor DNA-extractie uit Anopheles-muggen voor malariaparasietgenotypering. Deze methode levert hoogwaardig DNA geschikt voor PCR in slechts 37 minuten.

Een eenvoudige Chelex protocol voor DNA-extractie van

Meer video's verkennen