Een eenvoudige Chelex protocol voor DNA-extractie van Anopheles Spp.
9 januari 2013
Een snelle en betaalbare manier om de kwaliteit malariaparasiet en vector-DNA extraheren uit mug exemplaren beschreven. Voortbouwend op chelerende eigenschappen van Chelex hars, maakt de eenvoudige methode genotypering van malariaparasieten in mug mid-darmkanaal en speekselklier fasen en moleculaire identificatie van de Anopheles Sibling soorten door middel van PCR.
Het algemene doel van deze procedure is om malaria-, parasiet- en muggen-DNA uit de darm- en speekselkliersecties van anomalieën, specimens te extraheren. Dit wordt bereikt door eerst de mug precies bij de verbinding tussen de buik en de borst te snijden, waardoor de darm wordt gescheiden van de speekselkliersectie. Vervolgens wordt elke sectie apart gemalen in gedeïoniseerd water.
Vervolgens wordt de weefselsuspensie gelijmd, gewassen en wordt de cellenpellet teruggewonnen. Ten slotte wordt de cellenpellet gereconstitueerd en gekookt, en wordt het DNA geëxtraheerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die hoge kwaliteit muggen- en malariaparasiet-DNA laten zien, geschikt voor gebruik als sjabloon om anomalieën, vectorspecies en malaria-infecties te identificeren door middel van PCR en allelspecifieke restrictie-enzymdigestie.
Dus het belangrijkste voordeel van deze zeer eenvoudige techniek boven bestaande zoals organische extractie en sorteermethoden is dat het zeer weinig veilige en gemakkelijk verkrijgbare reagentia gebruikt en ook veel minder verwerkingstijd nodig heeft. Om met het disseceren van de mug te beginnen, plaatst u deze op een klein stukje paraform en monteert u het op een dissectiemicroscoop. Bedek het met een druppel gedeïoniseerd water.
Om het weefsel in grootte te verzachten, de muggenkarkas precies bij de verbinding tussen de borst en buik. Hierdoor wordt het hoofd en de borst van het buikgedeelte afgesneden. Breng elke gedissecteerde muggensectie over in een schone autoclaaf, 1,5 milliliter microcentrifugebuisje vooraf gelabeld met muggen-ID-nummer en lichaamssectie. Gooi de parafilm weg en gebruik een met 70% alcohol bevochtigde Kim-doek om voorzichtig het microscooptafeloppervlak af te vegen voordat u naar de volgende mug gaat om muggen-DNA te extraheren. Pipetteer eerst 20 microliters gedeïoniseerd water in het steekproefbuisje.
En gebruik de pipettentip om de ondergedompelde muggensectie in een uniforme suspensie te malen. Voeg 100 microliters van een autoclaaf, een XPBS 1%saponin-oplossing toe aan het steekproefhomogenaat en vortex voorzichtig om te mengen. Incubeer de steekproef gedurende 20 minuten op kamertemperatuur.
Centrifugeer vervolgens gedurende twee minuten bij 20.000 G en gooi het supernatant weg. Resuspendeer het pellet in 100 microliters één XPBS. Herhaal vervolgens de draai.
Voeg 75 microliters steriele gedeïoniseerd water en 25 microliters van 20% gewicht per volume toe. Cellex 100 harssuspensie in gedeïoniseerd water en vortex voorzichtig om het pellet te resuspenderen met een steriele 23 gauge hypodermische naald ontstoken in een Bunsenbrander. Prik een gat in het deksel van het steekproefbuisje.
Kook de steekproefsuspensie gedurende 10 minuten in een verwarmingsblok. Centrifugeer gedurende één minuut bij 20.000 G en breng de DNA-oplossing over in een vooraf gelabelde opslagbuis voor gebruik als sjabloon in PCR-reacties om de kwaliteit van het geëxtraheerde DNA te controleren, een regio van het artropode mi mitochondriale nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subeenheid vier-gen te versterken die naar verwachting een fragment van 400 basenparen zal produceren. Om vervolgens te differentiëren tussen Ananais Gambia-soorten, versterk een regio flankerend SNP's in de intergene ruimte regio die naar verwachting maten van 390 basenparen voor Ananais Gambia Sens Stricto en 315 basenparen voor ananais api zal produceren.
Vervolgens om p falciparum anti folate geneesmiddelresistentiepolymorfismen te genotyperen. Voer nested PCR uit om de regio te versterken die aminozuurcodons flankeert 16 51 59, 108 en 164. In het dihydrofolaatzuurreductasegen van de parasiet, voer allelspecifieke digestie van de amplicon uit om anti folate geneesmiddelresistentie te detecteren. Geassocieerde polymorfismen. Controleer de reacties op een 2% AROS-gelexamen. Voorbeelden van resultaten van PCR-assays voor muggen-DNA-extractkwaliteit, analis RABIS moleculaire identificatie en p falciparum genotypering tonen aan dat de vereenvoudigde Kelex-methode vergelijkbare resultaten oplevert als het standaard salting out-protocol, ondanks minder stappen en minder dan een kwart van de tijd met vergelijkbare DNA-kwaliteit in de respectieve extracten. Het is niet verwonderlijk dat monsterpositiviteitspercentages met betrekking tot anomalieën, Gambia-broersoorten, evenals parasietinfectiepercentages niet statistisch verschillend waren op basis van de McNear's chi-kwadraattest.
De toevoeging van BSA aan reactiemengsels resulteert in een algemene toename van PCR-positieven als gevolg van verwijdering van PCR-remmers voor zowel het vereenvoudigde kelex- als het reguliere salting out-protocol. Deze toename was echter niet statistisch significant, behalve voor DNA-kwaliteit op kelex-extracten. Allelspecifieke restrictie-enzymdigestie van de p falciparum-amplicon maakt de genotypering van darm- en speekselkliermalaria-infecties mogelijk voor geneesmiddelresistentie-allelen. Eenmaal onder de knie.
Deze techniek zou in ongeveer 37 minuten moeten kunnen worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een snelle en betaalbare methode voor het extraheren van hoogwaardig DNA uit malariaparasieten en muggenvectoren. Door gebruik te maken van Chelex-hars maakt deze techniek een effectieve genotypering van malariaparasieten en moleculaire identificatie van Anopheles-soorten mogelijk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Genomica
Achtergrond
- Malaria is een aanzienlijk mondiaal gezondheidsprobleem dat wordt overgebracht door Anopheles-muggen.
- Traditionele DNA-extractiemethoden kunnen tijdrovend zijn en vereisen gevaarlijke reagentia.
- Er is behoefte aan eenvoudigere, veiligere en efficiëntere technieken voor DNA-extractie.
- Deze studie introduceert een methode die aan deze behoeften voldoet door gebruik te maken van Chelex-hars.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een snelle en kosteneffectieve methode voor het extraheren van DNA uit malariaparasieten en muggenvectoren.
- Het mogelijk maken van genotypering van malariaparasieten en identificatie van Anopheles-soorten.
- Het vergelijken van de efficiëntie en effectiviteit van de nieuwe methode met traditionele protocollen.
Gebruikte methoden
- Dissectie van muggenexemplaren om de middendarm en de speekselkliersecties te scheiden.
- Vermalen van weefsel in gedeïoniseerd water om een suspensie te creëren.
- Gebruik van Chelex-hars voor DNA-extractie.
- Polymerasekettingreactie (PCR) voor genotypering en soortidentificatie.
Belangrijkste resultaten
- De Chelex-methode levert hoogwaardig DNA op dat geschikt is voor PCR.
- De resultaten zijn vergelijkbaar met traditionele methoden, maar de verwerkingstijd is aanzienlijk korter.
- De percentages positieve monsters voor soortidentificatie en parasitaire infecties waren statistisch vergelijkbaar tussen de methoden.
- De toevoeging van BSA verbeterde de PCR-resultaten door remmers te verminderen.
Conclusies
- De vereenvoudigde Chelex-methode is effectief voor het extraheren van DNA uit malariavectoren.
- Deze techniek kan in minder dan 40 minuten worden uitgevoerd, waardoor deze praktisch is voor routinematig gebruik.
- Het biedt een veiliger en efficiënter alternatief voor traditionele DNA-extractiemethoden.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
In omgevingen met beperkte middelen vereist duurzame moleculaire surveillance van malariavectoren en -parasieten DNA-extractiemethoden die prestaties in balans brengen met operationele eenvoud. Het Chelex-gebaseerde protocol levert een vergelijkbare DNA-kwaliteit als gevestigde salting-out-methoden, terwijl de complexiteit van de reagentia wordt verminderd en de verwerkingstijd wordt teruggebracht van bijna drie uur naar minder dan 40 minuten. Dit positioneert de methode als een praktisch hulpmiddel voor het mogelijk maken van schaalbare, kosteneffectieve genotyperings- en soortidentificatieworkflows in onderzoek en bestrijdingsprogramma's in endemische regio's.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar vector-parasietinteracties mogelijk door DNA-templates te leveren voor soortbevestiging en beoordeling van de infectiestatus.
- Operationele waarde: Vermindert de actieve werktijd en de hoeveelheid benodigde reagentia, wat een hogere doorvoer bij de verwerking van in het veld verzamelde monsters ondersteunt.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert DNA op dat geschikt is voor PCR-gebaseerde assays gericht op het onderscheid tussen vectorsoorten en het genotyperen van parasieten.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van slechts drie reagentia (gedeïoniseerd water, saponine, Chelex-hars), wat de standaardisatie van de assay verbetert en de variabiliteit in laboratoria met beperkte middelen vermindert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de continuïteit van vectorcollectie naar downstream-toepassingen, zoals genotyping van geneesmiddelenresistentie via nested PCR en restrictiedigestie.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak voor gevaarlijke organische oplosmiddelen, waardoor de veiligheid en toegankelijkheid in veldlaboratoria worden verbeterd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van monsterverwerking tot genetische analyse, waardoor betrouwbare input mogelijk wordt voor op PCR gebaseerde identificatie- en genotyperingsassays.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetesten met betrekking tot de verspreiding van vectoren en de infectiegraden van Plasmodium falciparum in veldomstandigheden.
- Screening: Levert DNA-extracten met voldoende kwaliteit en opbrengst voor multiplex PCR-toepassingen, wat de inzetbaarheid van assays ondersteunt.
- Analytics: Maakt kwantitatieve beoordeling mogelijk via PCR-amplificatie van ND4, soortspecifieke SNP's en loci voor drugresistentie, waardoor vergelijkingen tussen steekproefgroepen mogelijk zijn.
- Translational Research: Verbindt entomologische surveillance met genotypering van parasieten, ter ondersteuning van risicogebaseerde beslissingen in malariabestrijdingsstrategieën.
- Enterprise Reuse: De eenvoud van het protocol en de minimale behoefte aan apparatuur (microcentrifuge, verwarmingsblok) maken adoptie op meerdere veldlocaties en door diverse onderzoeksteams mogelijk.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende betrouwbaarheid bij de identificatie van vectorensoorten en de detectie van parasieten door een sensitiviteit en specificiteit die vergelijkbaar zijn met benchmarkmethoden.
- Operationele waarde: Behaalt een hoge reproduceerbaarheid met minimale afhankelijkheid van reagentia, waardoor de kwetsbaarheid van de toeleveringsketen in afgelegen gebieden wordt verminderd.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go-beslissingen in surveillanceprogramma's mogelijk door de doorlooptijd voor moleculaire bevestiging te verkorten.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van interventies door tijdige, nauwkeurige gegevens te leveren over vectorencompetentie en parasitaire prevalentie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist basisopleiding in de moleculaire biologie voor weefseldissectie, homogenisatie en de opzet van PCR.
- Toegang tot een microcentrifuge die 20,000 × g kan bereiken en een warmteblok voor de kookstap is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams profiteert van consistente vortex- en pipetteertechnieken tijdens de homogenisatie en resuspensie van de hars.
- Aanpassing aan andere muggensoorten of monstertypen kan validatie van de lyse-efficiëntie en de verwijdering van inhibitoren vereisen.
- Praktische beperking: De methode bevat een handmatige maalstap die zonder aanpassingen ultra-high-throughput automatisering kan beperken.
