FSL Constructen: Een eenvoudige methode voor het wijzigen van Cell / Virion Oppervlakken met een bereik van biologische merkers zonder dat hun levensvatbaarheid
August 5th, 2011
Functie-Spacer-Lipid (FSL) constructies kan de oppervlakte-eigenschappen van levende cellen en virions worden gewijzigd zonder verlies van vitaliteit. De methode vereist slechts een eenvoudige aanraking van een FSL bouwen oplossing met een cel / virion en spontaan en stabiele ondergrond incorporatie optreedt.
Het algemene doel van deze procedure is om de oppervlakken van levende cellen of S onschadelijk en snel te labelen met bioactieve constructies. Dit wordt bereikt door eerst een functionele spacer, lipide of FSL-constructie-oplossing te bereiden. Vervolgens wordt een gelijk deel van de constructie-oplossing gemengd met een gelijk deel van de oplossing van cellen of VIRs.
Als derde stap wordt het mengsel gedurende 60 minuten geïncubeerd bij 37 graden Celsius. De laatste stap is om de gemodificeerde cellen ofcyten of gemodificeerde VIRs of VIRs te wassen en ze experimenteel zoals gewoonlijk te gebruiken. Uiteindelijk kunnen op het oppervlak gemodificeerde levende cellen of S worden gevisualiseerd door middel van alle routinematige experimentele analysetechnieken, inclusief flowcytometrie, microscopie en agglutinatie.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals covalente labeling, is dat het snel, robuust, flexibel is en de vitaliteit van de gemodificeerde cel of Varian niet beïnvloedt. Om de FSL-constructiestok-oplossing te bereiden, voegt u eerst een milliliter verdunningsmiddel toe aan het productbestand om het droge FSL-product te reconstitueren en creëert u een stockoplossing van één milligram per milliliter. Soniceer de flacon gedurende 30 seconden, verdeel de stock in 100 microliter steriele containers en bewaar de containers bij twee tot acht graden Celsius gedurende maximaal een week.
Om werkende FSL-constructiele oplossingen voor inbrenging te bereiden, soniceer de oplossing net voor gebruik gedurende 30 seconden om eventuele mis-cellen te homogeniseren, verdun vervolgens de FSL-constructie en buffer tot de vereiste concentratie. Bewaar de werkoplossing bij twee tot acht graden Celsius gedurende maximaal een week na resuspendering in lipidevrij media of PBS, centrifugeer de cellen voor FSL-modificatie vrij van ongebonden lipiden. Bewaar vervolgens de cellen in 100 microliter verdunningsmiddel, was de cellen voor de controles onder dezelfde omstandigheden tot 100 microliter ongemodificeerde cellen.
Voeg indien gewenst 100 microliter van een geschikte verdunning van FSL-oplossing toe. Maak parallel daaraan ook negatieve controles met niet-gerelateerde FSL-oplossingen en/of PBS. Bewaar vervolgens alle celfracties gedurende één uur bij 37 graden Celsius na de incubatie.
Was alle cellen twee keer met lipidevrij media of PBS om eventuele vrije FSL-constructen te verwijderen en bereid een geschikte suspensie in lipidevrij media. Zodra het FSL-modificatieproces is voltooid, kunnen de coys worden bewaard bij vier tot acht graden Celsius als een bloem. FSL-constructen bestaan uit drie hoofdcomponenten, de functionele kop of F, die een verscheidenheid aan biologisch functionele groepen kan zijn.
De spacer RS is ontworpen om de ruimte tussen de functionele kop en het membraan te creëren om de waterdispersiteit te verbeteren en om niet-reactief te zijn met menselijk serum en de DAL-lipide of L, die het construct toelaat om spontaan in oppervlakken te worden opgenomen. Vier representatieve FSL-groepen worden getoond in de volgende vijf afbeeldingen. Levende muis-embryo's werden direct gelabeld met FSL-fluoresceine door de twee uur bij 37 graden Celsius methode in serumvrij celcultuurmedia, gewassen en vervolgens bekeken onder fluorescentiemicroscopie.
In deze eerste afbeelding is een zop palita vrije twee cel spiegelende embryo te zien. De intense kleuring in het midden van het embryo is representatief voor een klassieke polaire lichaamskleuring. In de volgende twee afbeeldingen worden zop palita vrije vier cel en acht cel spiegelende embryo's getoond die een schaduwkleuring van de cellen vertonen die buiten het microscoop P van focus liggen.
Een afbeelding van een zop palita vrije 16 cel spiegelende embryo is getoond in deze laatste afbeelding van FSL-fluoresceine gelabelde levende spiegelende embryo's. Vier tot vijf dagen oude intacte spiegelende blastocysten embryo's met zowel embryo als zop LUCITA gelabeld worden getoond in deze volgende reeks afbeeldingen. FSL-fluoresceine labeling van zebravis wordt getoond. Deze eerste afbeelding is van een microangiografie van een 52 uur post bevruchting zebravis larven die FSL-fluoresceine direct in de circulatie is geïnjecteerd.
Kleuring van het vaatstelsel van de zebravis kan hier worden waargenomen. FSL-fluoresceine, heterogene zebravis nierweefsel cellen of ZKcytes werden exvivo gecreëerd en vervolgens micro geïnjecteerd in de circulatie van een 52 uur post bevruchting ontvanger zebravis in vivo observaties van de ZKcytes werden twee uur na injectie gemaakt door beeldvorming van het vaatstelsel onder fluorescentie met time-lapse microscopie. Getoond is een enkele videoframe met grote langzaam bewegende of onbeweeglijke cellen aangegeven met oranje pijlen en snel bewegende cellen, die als gevolg van hun beweging vervaagd zijn aangegeven met groene pijlen. In deze afbeelding wordt FSL-fluoresceine labeling door orale opname van het construct getoond dat is bereikt door zebravis embryo's en FSL-fluoresceine bevattende media gedurende maximaal vijf dagen te immergeren.
De brightfield microscopie van de FSL-fluoresceine behandelde zebravis links komt overeen met de aangrenzende fluorescente afbeelding rechts. De fluorescentie was bij voorkeur gelokaliseerd in het darmkanaal. Er werd geen kleuring waargenomen in de onbehandelde controle-embryo's die hier worden getoond.
Hier wordt vesiculair stomatitisvirus of VSV direct gelabeld met 10 microgram per milliliter FSL-fluoresceine gedurende twee uur bij 37 graden Celsius getoond, gevolgd door fixatie met 4% paraform aldehyde, en vervolgens analyse door fact scan is getoond, geen zuivering van de VSV vir. Post FSL-labeling was vereist. Deze histogram toont varkenstesticulaire cellen geïnfecteerd met humaan A Puerto Rico 8 19 34 of H een N een VIRs gelabeld met FSL-fluoresceine.
Niet fluorescerende ongeïnfecteerde cellen worden weergegeven door de zwarte lijn, terwijl het fusie van de H een N een coron met de varkenscellen, wat resulteerde in fluorescentie, wordt aangegeven door de rode lijn. In deze volgende reeks afbeeldingen werden de cellen eerst gelabeld met FSL-biotine gedurende één
Overzicht
Dit artikel bespreekt het gebruik van Function-Spacer-Lipid (FSL) constructies voor het wijzigen van de oppervlakken van levende cellen en virionen zonder hun vitaliteit te schaden. De methode omvat eenvoudig contact met een FSL-constructie-oplossing, wat leidt tot spontane en stabiele opname in het oppervlak.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Biotechnologie
- Neurowetenschap
Achtergrond
- FSL-constructies bestaan uit een functioneel hoofd, een spacer en een lipide.
- De techniek maakt onschadelijk en snel labelen van celoppervlakken mogelijk.
- Het is voordeliger dan traditionele covalente labelmethoden.
- FSL-modificaties hebben geen invloed op de vitaliteit van cellen.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het oppervlaktemodificeren van levende cellen en virionen.
- Om gemodificeerde cellen te visualiseren met behulp van standaard experimentele technieken.
- Om de flexibiliteit en robuustheid van labelmethoden te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van FSL-constructie-oplossingen.
- Mixen van FSL-oplossingen met cellen of virionen.
- Incubatie bij 37 graden Celsius.
- Wassen van gemodificeerde cellen om ongebonden constructies te verwijderen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle oppervlaktemodificatie van levende cellen en virionen.
- Visualisatie van gemodificeerde cellen door middel van microscopie en flowcytometrie.
- Demonstratie van FSL-labeling in verschillende biologische modellen.
- Vergelijking met traditionele labelmethoden toont voordelen in snelheid en behoud van vitaliteit.
Conclusies
- FSL-constructies bieden een snelle en effectieve manier om levende cellen te labelen.
- De methode is veelzijdig en kan worden toegepast op verschillende celtypen.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitbreiden naar therapeutische en diagnostische gebieden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
FSL constructs enable rapid, non-disruptive surface modification of cells and virions, preserving viability while adding functional markers. This supports target validation and assay development by providing a reliable, scalable method to probe molecular interactions without genetic engineering or covalent chemistry. The approach reduces mechanistic ambiguity in early discovery and enhances predictive confidence in phenotypic screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through stable, non-toxic surface labeling of cells and virions.
- Operational Value: Provides a simple incubation-based method that avoids complex genetic manipulation or chemical conjugation.
- Predictive Value: Supports functional target validation by maintaining native cell/virion viability and activity post-modification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates kodecytes and kodevirions with consistent surface presentation of biomarkers for reproducible binding assays.
- Operational Value: Enables rapid preparation of labeled cells/virions in under two hours, compatible with high-throughput screening formats.
- Assay Readiness: Produces quantifiable outputs detectable via flow cytometry, microscopy, and agglutination, supporting assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates in vivo tracking of modified cells and virions, as demonstrated in zebrafish and murine models.
- Biomarker Alignment: Allows co-display of multiple antigens (e.g., A and B blood group antigens) on single cells for complex serological profiling.
- Risk Mitigation: Preserves viability and function, reducing false negatives in functional assays due to label-induced artifacts.
Pipeline & Workflow Integration
The FSL method fits within the discovery continuum from target engagement to lead identification, enabling rapid generation of modified biological systems for downstream evaluation without compromising native physiology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing reversible, non-disruptive surface modification to probe receptor-ligand interactions.
- Screening: Delivers assay-ready kodecytes/kodevirions with stable surface incorporation, improving reproducibility across screening campaigns.
- Analytics: Enables quantitative readouts via fluorescence, microscopy, and agglutination, facilitating comparison of binding affinities and cellular responses.
- Translational Research: Supports continuity from in vitro labeling to in vivo tracking, as shown in zebrafish vasculature and embryo models.
- Enterprise Reuse: Represents a modular, plug-and-play platform adaptable to diverse F moieties (e.g., fluorophores, biotin, sugars) across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by maintaining cell/virion functionality while adding detectable markers.
- Operational Value: Offers a rapid, robust, and flexible protocol requiring only incubation and optional washing.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by improving target validation fidelity through biologically relevant surface presentation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by generating reliable quality controls and diagnostic panels from modified cells/virions.
Implementation Considerations
- Requires basic cell culture or virion handling expertise and access to lipid-free media or PBS for optimal incorporation.
- Depends on sonication and sterile aliquoting of FSL stock solutions to ensure homogeneity and prevent aggregation.
- Necessitates standardization of incubation time (60 min), temperature (37°C), and washing steps to remove unbound constructs.
- Involves adaptation considerations for different model systems (e.g., embryos, spermatozoa, erythrocytes, virions) while preserving the core protocol.
- Includes practical limitations such as the need for lipid-free conditions during incubation to prevent competitive membrane incorporation.
