FSL Constructen: Een eenvoudige methode voor het wijzigen van Cell / Virion Oppervlakken met een bereik van biologische merkers zonder dat hun levensvatbaarheid

Het algemene doel van deze procedure is om de oppervlakken van levende cellen of S ongevaarlijk en snel te labelen met bioactieve constructen. Dit wordt bereikt door eerst een oplossing van een functionele spacer, lipide of FSL-construct voor te bereiden. Vervolgens wordt een gelijk deel van de constructoplossing gemengd met een gelijk deel van de oplossing van cellen of VIRs.

Als derde stap wordt het mengsel 60 minuten lang geïncubeerd bij 37 °C. De laatste stap is het wassen van de gemodificeerde cellen of cytes of gemodificeerde VIRs of VIRs en deze vervolgens experimenteel te gebruiken zoals gebruikelijk. Uiteindelijk kunnen oppervlaktemodificeerde levende cellen of S worden gevisualiseerd met alle routinematige experimentele analysetechnieken, waaronder flowcytometrie, microscopie en agglutinatie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals covalente labeling, is dat deze snel, robuust en flexibel is en de vitaliteit van de gemodificeerde cel of Varian niet beïnvloedt. Om eerst de voorraadoplossing van het FSL-construct te bereiden, voegt u één milliliter verdunner toe aan het productflesje om het droge FSL-product te reconstitueren, waardoor een voorraadoplossing van één milligram per milliliter ontstaat. Sonicate het flesje gedurende 30 seconden, verdeel de voorraad in steriele containers van 100 microliter en bewaar de containers bij twee tot acht graden Celsius voor maximaal één week.

Om werkoplossingen van het FSL-construct voor insertie voor te bereiden, dient de oplossing vlak voor gebruik opnieuw gedurende 30 seconden met ultrasoon geluid te worden behandeld om eventuele celaggregaten te homogeniseren, waarna het FSL-construct en de buffer worden verdund tot de vereiste concentratie. Bewaar de werkoplossing gedurende maximaal een week bij twee tot acht graden Celsius. Na resuspensie in lipidenvrije media of PBS worden de cellen gecentrifugeerd voor FSL-modificatie om ongebonden lipiden te verwijderen. Pelleteer vervolgens de cellen in 100 µL verdunner; was de cellen voor de controles onder dezelfde omstandigheden tot 100 µL ongemodificeerde cellen.

Voeg indien gewenst 100 µL van een passende verdunning van de FSL-oplossing toe. Maak parallel ook negatieve controles met niet-gerelateerde FSL-oplossingen en/of PBS. Incubeer vervolgens alle celpopulaties gedurende één uur bij 37 °C na de incubatie.

Was alle cellen tweemaal met vetvrije media of PBS om eventuele vrije FSL-constructen te verwijderen en bereid een passende suspensie in vetvrije media. Zodra het FSL-modificatieproces is voltooid, kunnen de coys worden bewaard bij vier tot acht graden Celsius zoals een bloem. FSL-constructen bestaan uit drie hoofcomponenten, de functionele kop of F, die kan bestaan uit diverse biologisch functionele groepen.

De spacer RS is ontworpen om een afstand te creëren tussen de functionele kop en het membraan om de waterdisperseerbaarheid te verbeteren en om niet-reactief te zijn met menselijk serum en het DAL-lipide of L, waardoor het construct spontaan kan worden ingebouwd in oppervlakken vier. Representatieve FSL-groepen worden getoond in de volgende vijf afbeeldingen. Levende muizenembryo's werden direct gelabeld met FSL-fluoresceïne via de methode van twee uur bij 37 °C in serumvrij celkweekmedium, gewassen en vervolgens bekeken onder een fluorescentiemicroscoop.

Op deze eerste afbeelding is een zop palita-vrij embryo met twee cellen in spiegelbeeld te zien. De intense kleuring in het midden van het embryo is representatief voor een klassieke pollichaamkleuring. Op de volgende twee afbeeldingen worden zop palita-vrije embryo's met vier en acht cellen in spiegelbeeld getoond, waarbij een schaduwachtige kleuring zichtbaar is van de cellen die buiten het focuspunt van de microscoop vallen.

Een afbeelding van een zop palita vrije embryo in het 16-cel mirroring stadium wordt getoond in deze laatste afbeelding van FSL fluoresceïne-gelabelde levende mirroring embryo's. Intacte mirroring blastulae embryo's van vier tot vijf dagen oud, waarbij zowel het embryo als zop LUCITA gelabeld zijn, worden getoond in deze volgende reeks afbeeldingen. De FSL fluoresceïne-labeling van zebravisjes wordt getoond. Deze eerste afbeelding is een micro-angiografie van een zebravislarve 52 uur na bevruchting waarbij FSL fluoresceïne direct in de circulatie is geïnjecteerd.

De kleuring van de vaten van de zebravis is hier te zien. FSL-fluoresceïne, heterogene cellen uit nierweefsel van de zebravis of ZK-cyten, werden ex vivo gecreëerd en vervolgens gemicro-injecteerd in de circulatie van een ontvanger-zebravis 52 uur na bevruchting. In vivo observaties van de ZK-cyten werden twee uur na injectie gedaan door fluorescentie-imaging van de vaten met time-lapse microscopie. Getoond is een enkel videoframe waarbij grote, traag bewegende of immobiele cellen zijn aangegeven met oranje pijlen en snel bewegende cellen, die door hun beweging wazig verschenen, zijn aangegeven met groene pijlen. In deze afbeelding wordt de FSL-fluoresceïne-labeling getoond, verkregen door orale opname van het construct door zebravisembryo's maximaal vijf dagen onder te dompelen in medium met FSL-fluoresceïne.

De brightfield-microscopie van de met FSL-fluoresceïne behandelde zebravissen links komt overeen met de aangrenzende fluorescentieafbeelding rechts. De fluorescentie was bij voorkeur gelokaliseerd in het darmkanaal. Er werd geen kleuring waargenomen in de hier getoonde onbehandelde controle-embryo's.

Hier wordt het vesiculaire stomatitisvirus of VSV direct gelabeld met 10 µg/mL FSL-fluoresceïne gedurende twee uur bij 37 °C, gevolgd door fixatie met 4% paraformaldehyde, en vervolgens analyse via FACS-scan; er is geen zuivering van het VSV-virion na FSL-labeling vereist. Dit histogram toont varkensniercellen die zijn geïnfecteerd met human A Puerto Rico 8 19 34 of H1N1-virussen gelabeld met FSL-fluoresceïne.

Niet-fluorescerende, niet-geïnfecteerde cellen worden weergegeven door de zwarte lijn, terwijl de fusie van het H1N1-coronavirus met de varkenscellen, die resulteerde in fluorescentie, wordt aangegeven door de rode lijn. In deze volgende reeks beelden werden de cellen eerst gedurende één uur bij 37 °C gelabeld met FSL-biotine, vervolgens gewassen en gereageerd met Fluor 4-gelabelde avadine, en daarna gewassen en nat gemonteerd voor fluorescentiemicroscopie. De eerste afbeelding toont een samengesteld confocaal beeld van een muizenembryo-blastocyste, en deze figuur toont een centrale confocale doorsnede van het embryo uit de voorgaande afbeelding.

Hier zijn levende, beweeglijke menselijke spermatozoa. De onscherpte is het gevolg van hun beweging. Een duidelijkere representatieve afbeelding van menselijke spermatozoa, gefixeerd in 4% paraformaldehyde na insertie, is te zien in deze figuur hier.

FSL-biotinegelabelde menselijke erytrocyten worden getoond; fixatie met 4% paraformaldehyde voor insertie heeft geen invloed op de FSL-labeling, zoals geïllustreerd in de volgende twee figuren. Hier kunnen 4% paraformaldehyde-gefixeerde RL 95 menselijke endometriumcarcinoomcellen worden waargenomen. Daarentegen zijn de RL 95 menselijke endometriumcarcinoomcellen in deze afbeelding niet gefixeerd. Er zijn vrijwel geen verschillen in de labeling waarneembaar tussen de twee afbeeldingen met of zonder fixatie.

FSL biotin-gelabelde RBC-cytes, geobserveerd in een bloedmonster dat twee uur na intraveneuze infusie van de cytes is afgenomen, worden hier links getoond; de cellen werden rechts bekeken onder lichtmicroscopie, hetzelfde veld cellen werd onder fluorescentie bekeken, en de twee aanwezige cytes kunnen in het groen worden geïdentificeerd. Het berekenen van de ratio van de cytes ten opzichte van niet-gelabelde cellen kan worden gebruikt als indicator voor overleving. Deze laatste afbeelding van een FSL biotin-gelabelde cel toont levende menselijke endometriale biotin-cytes die zijn gevisualiseerd door binding aan abated beads.

Deze laatste reeks afbeeldingen toont de interacties van het FSL-construct met bloedgroepmarkers. De eerste afbeelding is van menselijke rode bloedcel GLI-cyten gecoat met een concentratie van 500 microgram per milliliter FSLG, getest tegen verdunningen van menselijk serum. Menselijke rode bloedcellen reageren van nature niet met het Xena-antigeen GALI-antigeen.

Op deze manier kunnen cytes worden gebruikt om antilichaamniveaus in serum te kwantificeren. In dit voorbeeld werd vastgesteld dat de patiënt een antigentiter van 1:32 had door cytes te creëren met afnemende hoeveelheden FSL. Net als bij het bepalen van een antigentiter kan een optimaal antigenniveau voor de detectie van antilichamen worden vastgesteld; er kunnen cellen worden gemaakt die alleen een positief resultaat geven wanneer het antilichaamniveau een specifieke titer overschrijdt.

De hoeveelheid FSL-antigeen die nodig is voor een positief resultaat is afhankelijk van de kwaliteit en het niveau van het antilichaam dat wordt gedetecteerd. Voor koolhydraatantigenen zal doorgaans een FSL-oplossing van 100 micrograms per milliliter leiden tot een sterke positieve reactie. Menselijke groep O rode bloedcellen zijn gemodificeerd om een specifiek niveau van een antigeen te hebben of zijn zogenaamd gestandaardiseerd.

A-cytes worden gebruikt om antia in menselijk serum nauwkeurig en reproduceerbaar te kwantificeren. In dit voorbeeld werden de cytes bereid uit de eigen rode cellen van de donor en bleek het antia-niveau in het geteste serum van groep O één tot 32 te zijn. Hier wordt in de zesde buis getoond dat bloedgroep A- en B-antigenen, die gelijktijdig in één enkel monster van rode cellen van groep O werden ingebracht, werden gebruikt om A-zwakke, B-zwakke cytes te creëren.

Deze cellen kunnen worden gebruikt voor kwaliteitscontrole van VO. De analyse van de specifiek geformuleerde week A- en week B-cellen, getest tegen anti-A en anti-B reagentia, geeft de verwachte zwakke reacties zoals blijkt uit deze figuur, waarbij de reacties plaatsvinden in het midden van de bodem van de buizen. Deze eenvoudige techniek kan in twee uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.